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Agosto de 2002
PROCEDIMIENTO RECUENTO AEROBIOS Revisin: 9
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1. OBJETIVO
Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos que contiene un alimento. Este
mtodo es uno de los indicadores microbiolgicos de calidad mas utilizado.
3. FUNDAMENTO
Este en un mtodo de recuento en placa y siembra en profundidad.
Los resultados de este anlisis permiten:
Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin.
Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de los
alimentos.
Verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos.
Indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos.
4. REFERENCIAS
4.1 Bacteriological Analytical Manual. Online Enero 2001.
4.2 Standard Methods for the Examination of Dairy Products.15 ed. 1992. (Para clculo de
resultados)
4.3 PRT-712.01-001 "Procedimiento de Recepcin de las muestras".
4.4 PRT-712.01-002 "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua"
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5. TERMINOLOGA
No Aplica
6.2.2 DILUYENTE: Agua dilucin fosfato buferada de Butterfield pH 7.2 0.1 distribuida
en volmenes de 9 mL en tubos de tapa rosca.
6.2.3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Agar Plate Count Agar o Standard Methods
Agar estril, pH 70.1, distribuido en frasco Schott con 200 mL. (Anexo N 3)
7. DESARROLLO
7.1 REQUISITOS "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS
VIABLES" (Ver Anexo N 1)
7.2 PRECAUCIONES "RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS
VIABLES" (Ver Anexo N 2)
7.3 DILUCIONES Y SIEMBRA DE LA MUESTRA
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Si hay menos de 10 colonias por cm, contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6
cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ngulo
recto, contar cada cuadrado slo una vez
Si hay ms de 10 colonias por cm contar las colonias en cuatro de tales porciones.
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En ambos casos, multiplicar el nmero promedio de las colonias contadas por cm por el rea
de la placa usada para estimar el nmero de colonias por placa. Cada laboratorio debe
determinar el rea en cm de las placas usadas. Registre los valores obtenidos e indique como
recuento estimado.
Si hay mas de 100 colonias por cm, registrar como >100 col / cm.
Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con ms de 1/4 de las placas con crecimiento
invasivo, deberan tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad
ambiente en la cmara o estufa de incubacin y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra).
7.5.2.2 Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango
25-250 colonias calcular el RAM segn la siguiente frmula:
N= C
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde :
N = nmero de colonias por ml o g de producto
C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin.
n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva.
d = dilucin de la cul fu obtenido el primer recuento
Ejemplo
1 : 100 1 :1000
232 y 244 33 y 28
N = 232 + 244 + 33 + 28
[( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01
= 537
0.022
= 24.409 = 24000
7.5.2.3 Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del
rango 25-250 colonias, usar slo aquellos recuentos que estn dentro de este rango.
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Ejemplo
1 : 100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )
18 2 < 2.500 recuento en placa estimado (RPES)
0 0 < 2.500 recuento en placa estimado (RPES)
Ejemplo
1 :100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )
MNPC 640 640.000 recuento en placa estimado (RPES)
( MNPC = Muy numeroso para contar )
7.5.5 Todas las placas con ms de 100 colonias promedio por cm.
Estimar que el R A M es mayor de 100 veces la mayor dilucin sembrada, por el rea de placa
utilizada y por el recproco de la dilucin.
Ejemplo
1 : 100 1 : 1.000 R A M ( mL o g )
TNPC 7.150* > 6.500.000 * ( RPES )
TNPC 6.490** >5.700.000 **( RPES )
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7.5.6 Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente
de laboratorio.
Informar segn corresponda.
7.6.2 Siempre que se utilice el mtodo de recuento en placa para decidir si una partida de
alimentos se acepta o se rechaza, debe considerarse nicamente recuentos realizados dentro
del rango 25-250 colonias y nunca los recuentos estimados. Desde el punto de vista de un
Organismo Oficial, el recuento estimado es slo til como una aproximacin inicial para
valorar la calidad bacteriolgica de un alimento.
7.6.3 En el caso de que se utilice el recuento en placa para establecer si un alimento determinado
cumple una norma microbiolgica, debe tomarse en cuenta los planes de muestreo
especificados para ese alimento
7.8 CONTROLES
7.8.1 Chequear esterilidad de:
- Agua de dilucin
- Agar para recuento en placa (Plate Count o agar Standard Methods)
- Pipetas
- Placas Petri
7.8.2 Control de ambiente por mtodo de sedimentacin en placa :
- Mesn de siembra
- Flujo laminar
7.8.3 Control de temperatura de incubadora diariamente.
7.8.4 Control temperatura bao termorregulado cada vez que se siembre muestras
8. REGISTROS
9. TABLA DE MODIFICACIONES
Se cambia 11 g por 50 g.
10. ANEXOS
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ANEXO N 1
PLACAS PETRI: Los fondos de las placas Petri deben tener por lo menos 85 mm de
dimetro interior y una profundidad de 12 mm con superficies
interiores y exteriores libres de burbujas, rayaduras u otros
defectos. Pueden ser de vidrio o desechables.
AREA DE TRABAJO: Debe ser un mesn nivelado, con amplia superficie de trabajo,
limpio, iluminado. El laboratorio debe tener buena ventilacin,
libre de polvo y de corrientes de aire. El nmero de
microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) en el aire del
rea de trabajo no debe exceder de 15 colonias por placa expuesta
durante 15 minutos.
ANEXO N 2
PRECAUCIONES
"RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS VIABLES"
Al retirar una pipeta estril de su contenedor evite contaminar la punta con las superficies
exteriores del envase.
Extraer un volumen ligeramente mayor a la alcuota deseada. Retirar la pipeta por sobre el
nivel del lquido y enrasar tocando con la punta de sta la pared interior del tubo o frasco
de dilucin.
Levantar la tapa de la placa Petri lo necesario para introducir la pipeta. El tiempo que debe
transcurrir para que la pipeta entregue el volumen de 1 mL es de 2-4 segundos. Tocar un
punto seco de la placa manteniendo la pipeta en posicin vertical.
Fundir la cantidad de medio de cultivo necesario para ser usada en un perodo de 3 horas y
mantenerlo en bao de agua a 47 C 2C.
ANEXO N 3
CARACTERSTICAS DEL AGAR STANDARD
Si el medio de cultivo es preparado por ingredientes stos deben tener las siguientes
especificaciones:
1-Casena pancretica: debe ser de calidad USP dada en la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 744.
2-Extracto de levadura: conforme a normas dadas por la U.S. Pharmacopoeia, 1975 XIX p. 758.
3-Glucosa: segn normas de U.S. Pharmacopoeia XIX p. 128. Debe ser anhidra.
4- Agar: conforme a las siguientes especificaciones.
a) Caractersticas generales:
El material seco debera ser granulado o en escamas, de color blanco cremoso. Una cantidad de 2 g
suspendida en 100 mL. de agua destilada fra. Debera disolverse completamente en 5 minutos
a 100 C. Despus de autoclavar esta solucin debe estar libre de materias extraas o
partculas en suspensin las cuales pueden interferir en la lectura. El pH de esta solucin al
2% no debe ser menos de 6,0.
1- Debera ser preparado con ingredientes que tengan las caractersticas anteriormente mencionadas.
2- El polvo debe ser beige claro o amarillo plido.
3- El contenido de humedad no debera ser menos del 5 %.
4- Debe ser soluble la solucin al 2,35 % al hervir 1 a 2 minutos. Esta solucin debe ser clara y libre
de precipitados.
5- Debe tener un pH final 7 0,2 a 25 C, despus de ser esterilizado a 121 por 15 minutos.
6- No debe presentar precipitado cuando es mantenido a 50-56 C, por 2 hrs. despus de ser
esterilizado.
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ANEXO N 4
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
Tcnica Recuento en placa siembra en profundidad
1 mL
HOMOGENEIZADO:
450 mL de Solucin de
Butterfield 9 mL de
Solucin de Butterfield
50 g muestra
Dil 10 -1 10 -2 10 -3
SIEMBRA :
1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL
ANEXO N 5
LECTURA, REGISTRO, CALCULO E INFORME DE RESULTADOS RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
Lic. T.M. Mariana Fernndez C. Instituto de Salud Pblica de Chile
1-Placas normales CASOS LECTURA Y REGISTRO CALCULO Y REGISTRO INFORME
25-250 colonias ufc /g o mL
a) Cuando los recuentos de los -Utilizar para el clculo los recuentos
duplicados de placas de slo obtenidos en placas normales.
una de las diluciones caen
dentro del rango 25-250
colonias Ej 2 10= 301 y 289 -Si el tercer dgito es 6 , 7, 8 , o 9 adicionar
10= 244 y 232 1 unidad al segundo dgito 2,4 x 10 ^5
Ej 1 = 238 x 1000 = 238.000
= 240.000
N= 232 + 244 + 33 + 28
[ ( 1x 2 ) + ( 0,1 x 2 ) ] x 0,01
N= 24.409
c) Cuando los recuentos de las Ej 10= 238 =238 x 100 = 23.800 2,4 x 10^3
placas en duplicado caen tanto 263 =24.000
dentro como fuera del rango 25
- 250 colonias , usar slo 10= 15
aquellos recuentos que estn 17
dentro de este rango .
N =Nmero de colonias / g o mL
C = Suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 =Nmero de placas contadas de la menor dilucin
n2 =Nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva
d =dilucin de la cual fue obtenido el primer recuento
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* Basado en un rea de 65 cm ( 9 cm de dmetro.) MNPC = Muy numeroso para contar RPES = Recuento en placa estimado
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c) Placas sin desarrollo Ninguna de las placas presenta Ej 10 0y0 < 1,0 x por el recproco de dilucin menor < 2,5 x 10^3
de colonias desarrollo de colonias 10 0y0 (RPES)
REF: Standard Methods for the Examination of Dairy Products.15 ed. 1992. (Para clculo de resultados)
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ANEXO N 6
TABLA DE DILUCIONES SEGN ANLISIS REALIZADO EN EL LAB 346
Los anlisis que aparecen marcados en negrita, estn estipulados en el Reglamento sanitario de los Alimentos
1.2 Leche y crema pasteurizada 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
1.3 Leche y crema en polvo 2 placas dil 10-2 y 10-3 NMP dil 10-1, 10-2 y 10- No
3
1.4 Leche y crema UHT (previa incubacin a 2 placas directo No
35 C por 10 das)
1.8 Postres lcteos envasados no acidificados 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 2 placas dil 10-1 y 10-2
marcadas con rojo
1.9 Quesillo No Rto dil 10-1 No
Queso fresco chacra y queso de suero
1.12 Queso procesado (fundido y en polvo) 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
2.1 Helados base leche simples 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
2.2 Helados base leche complejos con otros 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
ingredientes
3.1 Mantequilla y margarina 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
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4.4 Mezclas en seco que requieren coccin 2 placas dil 10-2 y 10-3 No No
(budines, flanes)
5.2 Pastas frescas 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
5.3 Fideos y pastas rellenas desecadas No Rto dil 10-1 2 placas dil 10-1 y 10-2
marcadas con rojo
6.2 Miel No No No
8.1 Pan y masas horneadas sin relleno No No 2 placas dil 10-1 y 10-2
marcadas con rojo
8.2 Masas horneadas con relleno y/o cobertura 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
8.3 Productos farinceos para cctel (snacks) No No 2 placas dil 10-1 y 10-2
marcadas con rojo
9.1 Leches en polvo , frmulas para lactantes, 2 placas dil 10-1 y 10-2 NMP dil 10-1, 10-2 y 10- No
productos en base a cereales y 3
preparaciones infantiles
9.3 Preparaciones infantiles listas para consumo 2 placas dil 10-1 y 10-2 NMP No
que requieren calentamiento Lquidas: Directo, 10-1 y
10-2
Slidas: dil 10-1, 10-2 y
10-3
9.4 Formulas lcteas con cereales 2 placas dil 10-2 y 10-3 NMP No
Lquidas: Directo, 10-1 y
10-2
10.1 Carne de res cruda 2 placas dil 10-4 y 10-5 No No
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10.3 Cecinas cocidas 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
10.4 Cecinas crudas frescas y hamburguesas 2 placas dil 10-4 y 10-5 Rto dil 10-1 No
10.6 Cecinas crudas acidificadas 2 placas dil 10-3 y 10-4 Rto dil 10-1 No
11.2 Pescados y mariscos crudos congelados 2 placas dil 10-3 y 10-4 NMP dil 10-1, 10-2 y 10- No
3
11.3 Pescados y mariscos precocidos o cocidos 2 placas dil 10-3 y 10-4 NMP dil 10-1, 10-2 y 10- No
congelados 3
11.4 Pescados y mariscos ahumados 2 placas dil 10-3 y 10-4 NMP dil 10-1, 10-2 y 10- No
3
12.1 Huevo pasteurizado, lquido, congelado, 2 placas dil 10-2 y 10-3 No No
deshidratado
13.1 Mayonesa y otras salsas en base a huevo 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
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13.3 Especias y condimentos 2 placas dil 10-3 y 10-4 No 2 placas dil 10-1 y 10-2
marcadas con rojo
15.1 Comidas y platos preparados listos para 2 placas dil 10-2 y 10-3 Rto dil 10-1 No
consumo
16.3 Agua potable, aguas minerales y hielo 2 placas directo y dil 10-1 Rto directo y dil 10-1 No
16.4 Zumos, nectares y bebidas a base de frutas * 2 placas dil 10-2 y 10-3 ( No * 2 placas dil 10-1 y 10-2
y verduras no pasteurizados marcadas con rojo
17.1 Caf y sucedneo de caf No No No
Agua de dilisis 2 placas directo, dil 10-1 y 10-3 Rto directo 2 placas directo, dil 10-1 y 10-3
marcadas con azul e incubadas a 25 C marcadas con rojo