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23-08-2002
PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE
Revisión: 5
SALMONELLA EN ALIMENTOS POR
MÉTODO CONVENCIONAL
Fecha revisión:
30-03-2009
Sección Microbiología PRT-712.03-012 Página 1 de 26
de Alimentos
1. OBJETIVO
Detectar la presencia de Salmonella en los alimentos mediante método cualitativo recomendados
por organismos internacionales
3. FUNDAMENTO
De acuerdo con las normas internacionales y al reglamento sanitario de los alimentos la sola
presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo.
La técnica permite realizar compósitos de muestras y según el número de unidades que
componen el compósito agregar el caldo de preenriquecimiento manteniendo la proporción 1:9
a no ser que no esté indicado. Para muestras no analizadas sobre una base de peso exacto,
referirse a instrucciones para el método específico.
El fundamento del método para la detección en alimentos se basa en que la presencia de
Salmonella está en menor número que el de la flora acompañante especialmente en alimentos sin
tratamiento previo o bien que los microorganismos se encuentran estresados por los procesos
tecnológicos a que son sometidos (calor, radiación, congelación etc.)
En el laboratorio los métodos convencionales para su recuperación consideran todos estos
factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de preenriquecimiento y
enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realización
de pruebas bioquímicas y Serotipificación.
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4. REFERENCIAS
4.1 Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre 2007.
4.2 A.P.H.A. Asociación Americana de Salud Pública.-1992. Formules antigeniques des
serovars de Salmonella. WHO colaborating centre for reference and research on
Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux
75724. Paris cedex 15, France.1992.
4.3 Tablas T.L.M. Instituto de Salud Pública de Chile. 1991. M.E.Valenzuela y J. Astorga.
4.4 AOAC International. 2000. Official methods of analysis, 18th ed., Methods 967.25,
967.26, 967.27, 967.28, 978.24, 989.12, 991.13, 994.04, and 995.20. A.O.A.C, md.
International, Gaithersburg.
5. TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.4.5 SUEROS
6.4.5.1 Suero Polivalente Somático para Salmonella Poly A-I (DIFCO)
6.4.5.2 Suero polivalente flagelar.
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7. DESARROLLO
7.1 En el laboratorio “Enterobacteriaceae “se reciben las muestras homogeneizadas desde el
laboratorio “Recepción de muestras”.
7.1.1 Anotar en cuaderno de Inscripción del laboratorio de Enterobacteriaceae la clave y
número de las muestras.
7.1.2 Someter a incubación la muestra en caldo de preenriquecimiento a 35 °C por 18-24
horas para continuar con el proceso.
* Nota: En el caso de las muestras que deben traspasarse a caldo de enriquecimiento
previo a un día feriado, el caldo de preenriquecimiento incubado se guarda en
refrigeración hasta por 72 horas.
7.3.2 Sembrar cada uno de los caldos con los cultivos en: una placa de Agar X.L.D/N
(xilosa-lisina-dexocicolato/novobiocina); una placa de Agar Bismuto Sulfito (plaqueado
el día antes y guardadas en oscuro a la temperatura ambiente) y una placa de Agar
Hektoen.
7.3.3 Cada tubo de caldo de enriquecimiento se debe vortear y con asa de 3 mm (inóculo10
µl) extraer una asada e inocular las placas identificadas con negro y azul según caldo a
sembrar.
7.3.4 Inocular el Agar Hecktoen en forma de estrías y sin flamear el asa, agotar el inóculo en
el agar X.L.D./N; extraer otro inóculo con el asa y sembrar el Agar Bismuto sulfito.
7.3.5 Incubar las placas invertidas con la parte inferior hacia arriba a 35ºC ±.0,5 por 24 horas
y realizar la lectura.
7.3.6 Si las placas de agar Bismuto sulfito no presentan desarrollo o este es escaso incubar
por 24 horas más.
7.3.7 Ordenar según clave y número consecutivo para su lectura.
7.3.8 Anotar resultados en registro RG-712.00-072.
7.4.1 Agar Hektoen (HK.) Colonias azul-verdes a colonias azules con o sin centros negros.
Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes,
brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras
Algunos cultivos atípicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros
negros.
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7.4.2 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato/novobiocina (XLD). Colonias rosadas con o sin
centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros
grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente
negras. Excepciones: serotipos S. paratyphi A y S. choleraesuis, pueden dar colonias
transparentes sin centro negro; algunos cultivos atípicos de Salmonella producen
colonias amarillas con o sin centros negros.
7.4.3 Agar Bismuto Sulfito (B.S) Colonias marrón, color gris, o colonias negras; a veces
tienen un brillo metálico y el medio circundante es por lo general marrón al principio,
pero puede virar a negro con el tiempo que la incubación aumenta, produciendo el
efecto de halo supuesto.
7.5.1.2 Agar LIA semi inclinados (fondo de 4 cm de alto debido a que la descarboxilación
de la lisina es estrictamente anaerobio) y
7.5.1.3 Agar MIO
7.5.2 Marcar los tubos identificando la procedencia del caldo de aislamiento (lápiz azul caldo
Tetrationato y lápiz negro caldo Rappaport).
7.5.3 Toque ligeramente el centro de la colonia escogida con la aguja estéril de inocular e
inocule el TSI rayando la inclinación y picando el fondo; sin quemar, inocule el LIA
por picado del fondo dos veces y luego rayando la inclinación. Incubar los tubos con
las tapas sin apretar para mantener condiciones aeróbicas en la incubación y así
prevenir la producción excesiva de H2S. En el caso del TSI, incubar un poco inclinado
para evitar la producción excesiva de gas.
7.5.4 Sembrar en picadura con asa aguja los tubos de agar Movilidad Indol Ornitina (M.I.O)
cuidando no mover la aguja del asa para no romper el agar y poder leer bien la
movilidad.
7.5.5 Guardar las placas de agar selectivo a 5-8 °C.
7.5.6 Incubar TSI, LIA y MIO a 35 °C +/- 1ºC por 24 +/- 2 horas.
7.5.7 Alternativamente se pueden utilizar kit bioquímicos comerciales aprobados por AOAC
como API 20 E, Enterotubo II, Enterobacteriaceae, Micro-ID o Vitek GNI, para
identificación presuntiva. Los kit comerciales no deben ser utilizados como sustituto
de los test serológicos.
7.6.7 Las cultivos que dan el fondo ácido en LIA (Amarillo) y una inclinación alcalina
(azul) y el fondo ácido en TSI, también deberían ser consideradas como potencial
Salmonella y debería ser subcultivada.
7.6.8 Pruebas de cultivos positivos en TSI proseguir para determinar si ellos son de la
especie de Salmonella, incluyendo S. Arizonae.
7.6.9 Si los cultivos de TSI no logran dar reacciones típicas para la Salmonella (inclinación
alcalina y fondo ácido) escoger colonias adicionales sospechosas de placas de medio
de cultivos selectivo de supuestas-positivas e inocular TSI y LIA Aplicar pruebas de
identificación bioquímicas y serológicas.
7.6.10 Examinar un mínimo de 6 cultivos de TSI por cada 25 g de la unidad analítica o cada
375 g del compuesto, provenientes de ambos caldos de enriquecimiento.
7.6.11 Si los cultivos en TSI son mixtos, se recomienda reaislar en agar XLD, Hecktoen o
Mac Conkey, en este último las colonias típicas se observan, transparentes incoloras,
con o sin centro negro y pueden presentar un halo de precipitación biliar causado por
otros microorganismos.
Lectura:
¾ Fermentación de la Glucosa: fondo amarillo y tendido rojo. →Informar K/A
¾ Fermentación de la Lactosa y/o Sacarosa: Tendido Amarillo.→informar A/A ó K
¾ Producción de Gas: Ruptura del agar. Informar la producción de gas de 1 a 3 cruces (+).
¾ Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio que puede ser de intensidad variable.
Informar la presencia de 1 a 3 cruces (+)
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Numero Correspondiente en 1 2 3
Pares
Deaminación de la ornitina + + +
(alcalino en aerobiosis)
Movilidad - + +
Decarboxilación de ornitina - + +
Producción de indol + - +
Fermentación de la glucosa + + +
Ejemplos típicos Klebsiella Enterobacter Escherichia
oxytoca aerogenes coli
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7.8 SEROLOGÍA
7.8.1 Confirmar con suero polivalente somático y suero polivalente flagelar (Anexo Nº 5)
7.8.2 Enviar para confirmación serológica al "Centro de Referencia de Enterobacterias del
I.S.P.”
8. REGISTROS
9. TABLA DE MODIFICACIONES
10. ANEXOS
Anexo Nº 1 Esquema de trabajo
Anexo Nº 2 Pruebas complementarias para la identificación de Salmonella
Anexo Nº 3 Tabla 1 BAM On line Diciembre 2007 reacciones bioquímicas y serológicas de
Salmonella y Tabla 2 BAM On line Criterios parta descartar las cepas que no sean Salmonella.
Anexo N° 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies.
Anexo N° 5 Serología de Salmonella (BAM online 2007)
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ANEXO Nº 1
Pesar y agregar caldo prenriquecimiento (25 g +225 mL (o 50g + 450 mL )
↓
↓ ↓ ↓
Incubar 24 a 48 horas a 35 ºC. Incubar por 24 horas a 35 ºC
↓
Lectura de placas
↓
Inocular colonias sospechosas en agar T.S.I., L.I.A y M.I.O
↓
Incubar 24 h a 35ºC
↓
Lectura tubos Pruebas diferenciales
↓
Confirmación serológica
↓
Informe de resultado
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ANEXO N°2
Los cultivos puros que resulten urea negativos pueden ser sometidos a las siguientes pruebas:
b) Caldo rojo fenol dulcitol al 0.5 %. Inocular el caldo con cultivo de TSI. Incubar 48 ±
2 h en 35°C, examinar después de 24 h. La mayor parte de especies de Salmonella da la
prueba positiva, indicada por la formación de gas en el interior del tubo de fermentación y pH
ácido (amarillo) del medio. La producción de ácido puede interpretarse como reacción
positiva. El test negativo esta indicado por ninguna formación de gas en el interior del tubo
de fermentación, y no hay variación en el color rojo (con el fenol rojo como indicador) o
púrpura (con bromocresol púrpura como el indicador).
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c) Caldo Triptona (o triptofano). Inocule el caldo con inoculo proveniente del agar TSI.
Incube 24 ± 2 h en 35°C.
Si hasta ahora no se ha realizado las pruebas serológicas, estas deben ser realizadas en este
punto. (Ver anexo 5)
Realice las siguientes pruebas adicionales sobre cultivos que no dan reacciones típicas de
Salmonella para pruebas descritas en la Tabla 1 (ver anexo 3) y que por consiguiente no
clasifica como Salmonella.
a) Caldo de Lactosa Rojo Fenol o Caldo de lactosa púrpura bromo cresol: Del TSI,
inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo. Incubar 48 ± 2 h en 35°C, examinar
después de 24 h.
Positivo - producción ácida (amarillo) y producción de gas en tubo de fermentación interior.
Considerar la sola producción de ácido como reacción positiva. La mayor parte de cultivos de
Salmonella dan resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formación de gas en el
interior del tubo de fermentación y rojo (cuando el rojo fenol es el indicador) o púrpura (con
púrpura bromocresol como indicador) en todas partes del medio.
b) Caldo Rojo Fenol o púrpura bromo cresol sacarosa: Descartar como no Salmonella,
los cultivos que dan pruebas de sacarosa positivas, excepto aquellos que dan ácido en la
inclinación del TSI y reacciones positivas en el LIA
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• Rojo metilo: A 5 mL de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6 gotas del
indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da la prueba positiva,
indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color distinto, como el amarillo es la
prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan positivo:
d) Agar Citrato Simmon's: Inocular este agar usando aguja de inoculación con cultivo
proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la inclinación y picando el extremo.
Descartar por no pertenecer a Salmonella, los cultivos que dan pruebas de lactosa positivas,
excepto los cultivos que presentan inclinaciones ácidas TSI y reacciones positivas en LIA, o
los cultivos que dan reacciones positivas al caldo malonato. Realice posteriormente más
pruebas sobre estos cultivos para determinar si ellos son S. arizonae.
Clasificar como Salmonella a los cultivos que tienen el modelo de reacción de la Tabla1 (ver
anexo 3). Descartar, como no perteneciente a Salmonella, los cultivos que den cualquiera de
los resultados presentados en la Tabla 2 (ver anexo 3). Cultivos que no han sido claramente
clasificados, pueden ser sometidos a pruebas adicionales de clasificación de enterobacterias
de Edwards y de Ewing.
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ANEXO Nº 3
Table 2. Criterios para descartar las cepas que no son Salmonella BAM online
Diciembre 2007
Test o substrato Resultados
1. Ureasa positivo (color púrpura )
2. Test Indol positivo (color rojo en superficie)
y
Polyvalente flagelar (H) test; negativo (no aglutina)
O Test Indol positivo (rojo en superficie)
y
Spicer-Edwards flagelar test negativo (no aglutina)
ANEXO N° 4
Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies*
SALMONELLA ENTÉRICA S.
BONGORI
SUBESPECIE
entérica salamae arizonae diarizonae houtenae indica
Dulcitol + + - - - d +
ONPG(2h) - - + + - d +
Malonato - + + + - - -
Gelatinasa - + + + + + -
Sorbitol + + + + + - +
Cultivo en - - - - + - +
KCN
L(+)-tartrato(a) + - - - - - -
Galaturonate - + - + + + +
(*)
Y- + + - + + + +
glutamyltrans
ferasa
B- d d - + - d -
glucoronidasa
Mucato + + + - (70%) - + +
Salicina - - - - + - -
Lactosa - - - (75%) + (75%) - d -
Lisis por fago + + - + - + d
O1
Habitat usual Animales de Animales de sangre fría y ambientales
sangre caliente
(a)
d-tartrato (*) Typhimurium d, Dublin - + 90% o más reacciones positivas
- 90% o más negativas d Diferentes reacciones dadas por distintas serovariedades
*Formules antigeniques des serovars de salmonella 1997 Michel Popoff et L .LeMinor pag 12
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ANEXO Nº 5
Los cultivos que contienen antígenos de Salmonella demostrables como el test flagelar (H)
positivo, pero que no tienen las características bioquímicas de Salmonella deberían ser
purificadas y probadas de nuevo.