PROCEDIMIENTO NMP PARA LA

DETERMINACION DE COLIFORMES
FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
Seccin Microbiologa
de Alimentos
1.

PRT-712.02-006

Fecha emisin:
1992
Revisin: 5
Fecha revisin:
23-05-2011
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OBJETIVO

Este anlisis se realiza para estimar la densidad de coliformes fecales en agua, con una
incubacin de 24 hrs. por lo cual se obtienen resultados en menor tiempo que el mtodo
tradicional.
2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Este procedimiento se aplica a muestras de aguas crudas y agua de mar.

3.

FUNDAMENTO

El caldo A-1 puede ser usado para aislamiento directo de coliformes fecales desde agua, no
requiere una etapa de preenriquecimiento.
4.

REFERENCIAS

4.1

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 Ed. 2005 .Captulo
9. 9221 E.2 pag 9-57.

5.

TERMINOLOGA

5.1

Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos Gram negativos
aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando
cido y gas dentro de 24 hrs. a 44,5 0,2C.
En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar
sanitariamente la calidad del agua.

6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

EQUIPOS

6.1.1

Incubadora a 35 0,5C

6.1.2

Bao de agua termorregulado a 44,5 0,2 C

6.1.3

Termmetros calibrados con graduaciones de 0,1C

6.2

MATERIALES

6.2.1

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.

6.2.2

Placas Petri de 100 mm de dimetro

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6.2.3

Tubos o botellas de dilucin, de vidrio borosilicato con tapas hermticas

6.2.4

Tubos de fermentacin de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm

6.2.5

Asa de 3 mm de dimetro

6.2.6

Propipeta

6.3

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

6.3.1

Medio A1 doble concentracin

6.3.2

Medio A1 concentracin simple

6.3.3

Agua de dilucin buffer fosfato estril o agua peptonada estril 0.5%

6.4

CEPAS CONTROL

6.4.1

Cepa control positivo: Escherichia coli

6.4.2

Cepa control negativo: Enterobacter aerogenes

7.

DESARROLLO

7.1

SIEMBRA

7.1.1

Se utiliza caldo A-1 en tubos de fermentacin y como diluyente, agua de dilucin buffer
fosfato estril o agua peptonada estril 0.5%.

7.1.2

Agitar la muestra y diluciones, vigorosamente 25 veces en 7 segundos en un arco de 45

con movimientos de arriba a abajo, para asegurar la homogeneidad de la muestra; este
procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones.

7.1.3

Inocular 5 tubos de caldo A-1 doble concentracin con 10 mL de muestra cada tubo.

7.1.4

Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentracin simple con 1 mL de muestra cada tubo.

7.1.5

Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilucin buffer

fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilucin 1:10.

7.1.6

Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentracin simple con 1 mL de la dilucin 1:10 cada
tubo.

7.1.7

Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilucin buffer

fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilucin 1:100.

7.1.8

Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentracin simple con 1 mL de la dilucin 1:100 cada
tubo.

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7.1.9

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Inocular un tubo de medio con A-1 con control positivo utilizando una cepa de
Escherichia coli y otro con el control negativo utilizando una cepa de Enterobacter
aerogenes. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad
de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente.

7.1.10 Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar
los tubos inoculados en incubadora a 35 0,5 C por 3 hrs para resucitacin.
7.1.11 Luego transferir la gradilla a un bao de agua a 44,5 0,2C durante 21 horas 2
horas.
7.1.12 Al trmino del perodo de incubacin se observa la formacin de gas en los tubos de
fermentacin. Se considera un test positivo para coliformes fecales la presencia de gas,
cualquiera sea la cantidad producida o la efervescencia que se produce al agitar
suavemente el tubo.
Ausencia de gas o ausencia de efervescencia se considera un test negativo para
coliformes fecales.
7.1.13 Anotar los resultados de las muestras en el registro RG-712.00-025 y de las cepas
control en el registro RG-712.00-005, de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009.
7.2

CALCULO

7.2.1

La combinacin de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP (Tabla 9221: IV

St. Mt. 2005 Pag. 9-54), y los resultados se expresan como NMP por 100 mL. de
muestra.

7.2.2

Si en lugar de las porciones de muestra de 10-1-0,1 mL, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el

resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,10,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por 100.

7.2.3

Cuando se utilizan ms de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de

3 series, eligiendo la dilucin ms alta que da resultados positivos en los 5 tubos
ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer
en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos).

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FECALES EN AGUAS POR METODO A-1
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Ejemplos de determinacin de NMP en series de 5 tubos

Ejemplo
Volumen de muestra (mL)
10
1
0,1
0,01
a
5
5
1
0
b
4
5
1
0
c
0
0
1
0
d
5
4
4
1
e
5
4
4
0
f
5
5
5
5

7.3

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Lectura
0,001
0
0
0
0
1
2

510
451
001
441
441
552

NMP
330
48
1,8
400
400
54000

EXPRESION DE RESULTADOS

Los resultados se expresan como NMP Coliformes fecales/100 mL de muestra.

8.

REGISTROS

8.1

RG-712.00-005 Registro cepas control baos de agua para anlisis de Coliformes

fecales.

8.2

RG-712.00-006 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el

anlisis de Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli.

8.3

RG-712.00-025 Registro de resultados anlisis de coliformes, coliformes fecales y E.

coli en muestras de agua.

8.4

RG-712.00-009 Registro control de ambiente.

9.

ANEXOS

Anexo N 1

Registro cepas control de baos de agua para anlisis de coliformes fecales, RG712.00-005.

Anexo N 2

Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el anlisis de

coliformes, RG-712.00-006.

Anexo N 3

Registro de resultados anlisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de

agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025.

Anexo N 4

Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009.

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Anexo N 1
Registro cepas control de baos de agua para anlisis de coliformes fecales, RG-712.00-005

FECHA

Bao N inventario

Bao N inventario

Bao N inventario

Bao N inventario

----------------------

----------------------

----------------------

----------------------

CONTROLES

CONTROLES

CONTROLES

(+)

(-)

(+)

(-)

(+)

(-)

CONTROLES

(+)

INIC:

(-)

Anexo N 2
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados
en el anlisis de coliformes, RG-712.00-006
FECH
A

Caldo
Lauril
Sulfato
Triptosa
concentra
d

Caldo
Lauril
Sulfato
Triptosa
simple

Agar
Caldo
Rojo
Bilis
Neutro Verde
Cristal Brillant
Violeta
e
(VRB)

Cald
o EC

Cald
o
A-1

Agar Rojo
Neutro
Cristal
Violeta Glucosa
(VRBG)

Agar
MacConke
y Sorbitol

Agar
glucosa
(enterobacteria)

INIC

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Anexo N 3
Registro de resultados anlisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua
coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025
N:.......................Tipo de muestra:.......................................... Analista............................................
Fecha /hora recoleccin...............................Fecha/hora anlisis:...................T Ambiental.
Medios

CLST (C)
#

CLST (S)
#

Endoles
#

Diluyente
#

CBCB
#

Caldo EC
#

Caldo
MUG
#

EC-

Pipeta
1mL / 5
mL
#

Incubadora/
Bao term.

PORCION DE MUESTRA (mL)

PRESUNTIVO
CLST 24 - 48 hrs 35C
Endo Les 24 hrs.
COLIFORMES CONFIRMATIVO
CBVB
48 hrs. a 35 C
E.C./E.C.-MUG 24 h/44,5+/- 0,2C

N.M.P. Coliformes /100 mL :..............germ / 100 mL

Rcto Coliformes:.................................

N.M.P. Coliformes Fecales :...............germ /100 mL

P/A E.coli:.............................

Anexo N 4
Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009
LABORATORIO:...............................................................MES :.....................................AO :..............................

FECHA/

LOTE

CONTROL AMBIENTE MESON DE TRABAJO

Lado izquierdo
Placa abierta

Placa cerrada

Lado derecho
Placa abierta

Placa cerrada