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GUIA PARA LA VALIDACIN EMISIN:
DE MTODOS DE ENSAYO VERSIN: 01

PGINA: 1 DE 26

GUIA PARA LA VALIDACIN DE MTODOS DE ENSAYO

ELABOR REVIS APROB

REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA
REPRESENTANTE DE CALIDAD DIRECCIN
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
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1. OBJETIVO

Establecer una gua de las actividades para la validacin de mtodos de ensayo

normalizados y empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los
mtodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede
aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Regular o sistematizar los mtodos para la validacin de las instrucciones de ensayo y de
calibracin.

El objetivo de la validacin es probar la aptitud de los mtodos, as como la capacidad del

laboratorio. La validacin se apoya en los parmetros estadsticos del procedimiento.

Los procedimientos y el alcance de la validacin no son siempre los mismos y deben ser
establecidos individualmente.

2. ALCANCE

Esta gua se debe aplicar a todos los mtodos de ensayo establecidos en el Laboratorio de
Salud Pblica del Meta.

3. DEFINICIONES

Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se

han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especifica prevista.
Verificacin: Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se
han cumplido los requisitos especificados.
Valor Verdadero Convencional (De una Magnitud): Valor atribuido a una
magnitud particular, y aceptado a veces por convencin, porque la representa, con
una incertidumbre apropiada, para un fin dado.
Mesurando: Magnitud particular sometida a medicin.
Incertidumbre de Medida: Parmetro asociado al resultado de una medicin, que
caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonables atribuidos al
mesurando.
Exactitud de una Medicin: Proximidad entre el resultado de una medicin y el
valor verdadero del mesurando.
Repetibilidad (De los Resultados de las Mediciones): Proximidad entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las
mismas condiciones de medicin. (Aplicacin de un mismo procedimiento, a un
mismo objeto, por le mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo
equipamiento instrumental, en el mismo lugar).
Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo
mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de medicin.
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Precisin Intermedia: Magnitud que relaciona la variacin en los resultados

observados cuando uno o ms factores, tales como tiempo, equipamiento, operador,
varan dentro de un mismo laboratorio.
Lmite de Deteccin: Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con
cierto nivel de confianza especificado.
Para un resultado analtico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la
duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real
del analito.
La seal del fondo es producida por el blanco y exhibe ruido. El lmite de deteccin
(LD) corresponde a una seal k veces la desviacin estndar del ruido del fondo.
Tpicamente el valor de k es igual a 3 (LD = 3F) Los valores por encima del LD
pueden ser atribuidos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son
indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables.
Lmites de Cuantificacin: Es la menor cantidad que puede ser determinada
cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza.
Para el anlisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que slo se emplean
valores atribuibles al analito. El lmite de cuantificacin es entre 3 y 10 veces el LD
(LD = 3F), segn cada caso.

4. RESPONSABLE

La aplicacin de este documento es responsabilidad del personal del Laboratorio de las

reas de Vigilancia del ambiente y atencin a las personas en la realizacin de los ensayos.
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5. DESARROLLO

5.1. GENERALIDADES

5.1.1. CONDICIONES GENERALES

Antes de que un procedimiento pueda proporcionar informacin analtica til, es

necesario demostrar que sus resultados son aceptables. La validacin consiste en
valorar si la precisin y la exactitud que se obtienen siguiendo el procedimiento son
adecuadas para el problema. Adems, la validacin garantiza que el procedimiento
escrito es lo suficientemente detallado como para que distintos analistas o
laboratorios obtengan resultados comparables cuando lo utilicen.

La validacin es un proceso experimental por el cual se establece mediante estudios

de Laboratorio que las caractersticas de diseo del mtodo analtico cumplan los
requerimientos (metodolgico y estadstico) para la aplicacin analtica propuesta.
Involucra el desarrollo de un protocolo, que incluye la estimacin de las medidas de
precisin y exactitud aplicables a cualquier mtodo analtico.

Se valida para asegurar la calidad, reducir costos, aumentar la productividad

cumplir con la normas establecidas, y la validacin determina las caractersticas de
operacin, ventajas, limitaciones, confianza, seguridad en el mtodo analtico y en
la calidad de los resultados obtenidos en el laboratorio de trabajo. Disminuye el
nmero de fallas y repeticiones.

El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos

normalizados, previo a su uso en ensayos. Cualquier variacin en el mtodo
normalizado implica la repeticin de dicha confirmacin.

Los equipos tambin deben ser calibrados y/o validados antes de su uso.

5.1.1.1. Tipos de Validacin

PROSPECTIVA: Proceso de validacin para metodologas nuevas que se

disea y comienza a realizarse en el presente, pero los datos se analizan
transcurrido un determinado tiempo, en el futuro.

RETROSPECTIVA: Proceso de validacin para metodologas que actualmente

se estn aplicando, el anlisis se realiza en el presente, pero con datos del
pasado obtenidos en un momento puntual.
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REVALIDACIN: Repeticin total o parcial de una validacin, por la

introduccin de algn cambio que se espera afecte la bondad de un mtodo
validado.

TRANSFERENCIA DE VALIDACIN: Confrontacin de resultados de pruebas

de adecuacin y anlisis en paralelo, por lo menos, de dos muestras
homogneas obtenidas por el equipo que realizar la validacin y el equipo que
aplicar la tcnica validada

5.1.2. PRINCIPIOS DE LA VALIDACIN

Cada validacin de un procedimiento consiste en tres pasos:

1. Definicin de los atributos del mtodo a validar (Por ejemplo: Lmite de
deteccin 1mg/l, intervalo lineal mayor a 2 rdenes de magnitud, incertidumbre
de los resultados < 20% en todo intervalo de trabajo, para el caso de la
validacin de un mtodo analtico general.
2. Elaboracin del protocolo de validacin F-SA-140
3. Determinacin de los parmetros estadsticos del procedimiento.
4. Valoracin de los resultados de la validacin por comparacin de los
parmetros estadsticos obtenidos con las condiciones y decisin sobre la
validez del procedimiento para el propsito establecido mediante la ejecucin
del protocolo.
5. Elaboracin del informe de validacin F-SA-141
6. Declaracin del mtodo frente a su aptitud frente a las especificaciones y uso
previsto

5.1.2.1. Establecimiento de las Condiciones y Alcance de la

validacin

5.1.2.1.1. Establecimiento de las condiciones

Las condiciones de la validacin se encuentran definidas por el mtodo en
su documento normativo. De no ser as se deben establecer apoyados en
soportes cientficos, mtodos similares y/o guas de validacin.

5.1.2.1.2. Establecimiento del Alcance de la Validacin

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Para definir el alcance de la validacin se tendr en cuenta el tipo de ensayo;

del cual depender los atributos y especificidad del protocolo de validacin:

1. Mtodo Normalizado: Se trata de un mtodo de ensayo estandarizado,

validado por otro organismo, que ha sido publicado, generalmente
comunidades cientficas y que se aplica exactamente como est descrito
en la norma.
2. Mtodo No Normalizado: Se trata de una modificacin a un mtodo de
ensayo normalizado, por ejemplo, se hicieron modificaciones a los
mtodos descritos en la norma que pueden tener una repercusin sobre
la calidad de los resultados.

Ejemplos: Un mtodo de extraccin diferente, otra matriz.

La validacin en los casos descritos tiene objetivos distintos y por lo tanto

diferentes puntos esenciales como muestra la tabla 1.

Tabla 1: Objetivos de la validacin segn el tipo de procedimiento de ensayo.

Mtodo de Ensayo Objetivos de la Validacin

Caso 1. Comprobacin de que el laboratorio ha

Mtodo normalizado estandarizado el ensayo y lo utiliza correctamente.
Caso 2. Comprobacin de que la repetibilidad, la
Modificacin de un reproducibilidad, la precisin intermedia y la
mtodo normalizado. exactitud del mtodo original no depende de la
modificacin introducida, robustez del ensayo y
que el laboratorio ha estandarizado el ensayo y lo
utiliza correctamente.

Tabla 2: Alcance de la validacin segn el tipo de procedimiento de prueba.

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Mtodo de Ensayo Objetivos de la Validacin

Caso 1. 1.) Comprobacin del cumplimiento de los

Mtodo normalizado parmetros estadsticos. Ejemplo: incertidumbre
de los resultados, repetibilidad, exactitud, lmite de
deteccin (Siempre y cuando se indiquen en la
norma).
2.) Elaboracin de cartas de control analizando un
material de referencia.
3.) Participacin en ensayos interlaboratorios.
Caso 2. Modificacin de 4.) Adems de lo indicado para el caso 1 de esta
un mtodo normalizado. Tabla, probar parmetros estadsticos
determinados.

El alcance de la validacin deber establecerse en el protocolo de validacin F-SA-140 y,

en caso necesario, los principios aplicados deben registrarse en el informe de validacin F-
SA-141.

5.1.2.1.3. Parmetros DETERMINADOS

Las guas internacionales sugieren que de acuerdo al mtodo se validen y/o

verifiquen los siguientes atributos:
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Linealidad

El anlisis de una muestra genera una seal qumica o fsica de una magnitud proporcional
a la cantidad de analito existente en la muestra. La seal puede ser cualquier cosa que
podamos medir; ejemplos habituales son la masa, el volumen y la absorbancia. Para
nuestros fines, es conveniente dividir las tcnicas analticas en dos clases generales, segn
que la seal sea proporcional a una cantidad absoluta del analito o que lo sea a una
cantidad relativa. Si una tcnica revela la cantidad absoluta del analito existente en la
muestra, la seal proporcionada por el anlisis, SA, podr expresarse como:
SA = knA ,
Donde nA son los moles o gramos del analito de la muestra y k es una constante
de proporcionalidad.
Una segunda clase de tcnicas analticas son las que responden a la cantidad
relativa del analito, as:
SA = kCA ,
Donde CA es la concentracin del analito en la muestra.
La linealidad de un mtodo analtico se refiere a la proporcionalidad que existe
entre la concentracin del analtico y su repuesta o seal. Adems,
conjuntamente se determina el rango lineal, es decir el intervalo comprendido
entre la concentracin mnima y mxima del analito para cual el mtodo ha sido
probado. En muchos casos es interesante comparar los resultados de la recta
de regresin obtenida con el analito puro con los correspondientes al analito en
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la matriz. La falta de correspondencia de las rectas nos indica que hay

interferencia por matriz

Precisin

La precisin es la medida de la dispersin de los datos en torno a un valor central y puede

expresarse como rango, desviacin estndar o varianza. Por lo general la precisin se
divide en dos categoras: Repetibilidad y precisin intermedia.

Repetibilidad

Es la precisin obtenida cuando todas las mediciones son hechas por el mismo analista
durante un solo perodo de trabajo analtico, utilizando las mismas soluciones y el mismo
instrumental.

Precisin intermedia

Es la precisin obtenida en cualquier otro conjunto de condiciones, por ejemplo, por

distintos analistas o en distintos das de trabajo de laboratorio por un mismo analista. Como
la precisin intermedia abarca un nmero mayor de fuentes de variabilidad, nunca puede
ser mejor que la repetibilidad.

Los errores que afectan a la distribucin de las mediciones alrededor del valor central se
llaman aleatorios y se caracterizan por variaciones tanto de magnitud como de sentido. Los
errores aleatorios no afectan necesariamente a la exactitud de un anlisis. Como se
distribuyen aleatoriamente alrededor del valor central, los errores positivos y negativos
tienden a compensarse, siempre que el nmero de mediciones sea lo suficientemente
grande. En estas circunstancias, la precisin del anlisis solo afecta a la media o a la
mediana.

La precisin es una medida del grado de precisin intermedia y repetibilidad del mtodo
analtico bajo las condiciones normales de operacin y est relacionada con el coeficiente
de variacin.

Ecuacin de Horwitz

Si no se dispone de un mtodo con el cual comparar los parmetros de precisin, los valores
tericos de repetibilidad (RSDr) y precisin intermedia (RSDR), expresados como CV%,
podrn calcularse aplicando la ecuacin de Horwitz.

PRSDR% = 2C -0,1505
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Donde c es la concentracin del elemento analizado expresada en ppm mg/L y RSDR %

representa la desviacin tpica relativa calculada a partir de los resultados obtenidos en
condiciones de precisin intermedia [(SR / x) x 100]

Segn Horwitz, la precisin del mtodo analtico bajo condiciones de precisin intermedia,
se considera aceptable cuando su coeficiente de variacin CV% experimental (RSDR) es
inferior al valor calculado con la ecuacin terica.

En general, los valores tomados de esta curva son indicativos de la precisin alcanzable y
aceptable del mtodo analtico por diferentes laboratorios. Su aplicacin proporciona un
medio satisfactorio sencillo de evaluar la aceptabilidad de la precisin del mtodo.

Los valores calculados con la ecuacin de Horwitz se consideran lmites razonables de

variabilidad que permiten comparar y calificar la precisin de cualquier mtodo analtico en
funcin de la concentracin del analito determinado en una muestra.

Variacin de la precisin intermedia estndar relativa (RSDR) en funcin de la

concentracin, c, expresada como tanto por uno.

El clculo del criterio de aceptabilidad para la imprecisin se realizar acorde a las

especificaciones de la AOAC Official Methods of Analysis
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Exactitud

La exactitud es una medida de la proximidad existente entre la medida de la tendencia

central y la verdad o el valor esperado.

La ms utilizada es la recuperacin. Si bien el valor verdadero de la concentracin no se

conoce sino que solo puede estimarse, es posible preparar una muestra por un
procedimiento ms exacto que el evaluado (pesada, dilucin, etc.) y utilizarla como
referencia.

Los errores que afectan a la exactitud de un anlisis se llaman sistemticos y se

caracterizan por una desviacin sistemtica en relacin con el valor verdadero; es decir,
todas las medidas individuales son demasiado grandes o demasiado pequeas. Un error
sistemtico positivo produce un valor central mayor que el valor verdadero y un error
sistemtico negativo da lugar a un valor central menor que el valor verdadero. Tanto los
errores sistemticos positivos como los negativos pueden afectar el resultado del anlisis,
con un efecto acumulativo que conduce a un error sistemtico positivo o negativo neto.

Sensibilidad

La capacidad para demostrar que dos muestras tienen distintas cantidades de analito es
una parte esencial de muchos anlisis. La sensibilidad de un mtodo es una medida de su
capacidad para establecer que estas diferencias son significativas. A menudo se confunde
la sensibilidad con el lmite de deteccin del mtodo. El lmite de deteccin es la menor
cantidad de analito que puede detectarse con seguridad. Por tanto, el lmite de deteccin
es un parmetro estadstico. La sensibilidad es el cambio de la seal por unidad de cambio
de la cantidad de analito y equivale a la constante de proporcionalidad de las ecuaciones:

SA = knA , y SA = kCA ,

Si Delta SA es el menor incremento de seal que puede medirse, la menor diferencia en

la cantidad de analito que puede detectarse ser para cada caso:

Delta nA = Delta SA / k
Delta CA = Delta SA / k

La sensibilidad de un mtodo analtico corresponde a la mnima cantidad de analito que

puede producir un resultado significativo. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos
de sensibilidad: Sensibilidad de calibracin: la que corresponde a la pendiente de la curva
de calibracin Sensibilidad analtica: la correspondiente al cociente entre la sensibilidad de
calibracin y la desviacin estndar de la medida. Dos tcnicas o la misma tcnica
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empleada para diferentes matrices, pueden tener la misma sensibilidad de calibracin, pero
diferente sensibilidad analtica debido a factores propios como: necesidad de extraccin,
concentracin, etc.

Selectividad

Un mtodo analtico es selectivo cuando su seal slo depende de la cantidad de analito

presente en la muestra. En presencia de una interferencia, las ecuaciones
SA = knA, y SA = kCA,

Pueden ampliarse para incluir un trmino que corresponda a la contribucin de esta

interferencia a la seal SI de tal modo que la seal de la muestra en los dos casos quedar
convertida en:

SMUESTRA = SA + SI = kA nA + kInI y SMUESTRA = SA + SI = kA CA + kICI

Donde SMUESTRA es la seal total debida a los componentes de la muestra y kA y kI son las
sensibilidades para el analito y la interferencia y nI y CI son los moles y la concentracin
de la interferencia en la muestra.

La selectividad del mtodo para la interferencia en relacin al analito se define como el

coeficiente de selectividad, KA,I y viene dado por la relacin :

KA,I = kI / kA

Que puede ser positivo o negativo, dependiendo de si el efecto de la interferencia sobre la

seal es similar o, opuesto al del analito. Un coeficiente de selectividad superior a (+1) o
inferior a (-1) indica que el mtodo es ms sensible para la interferencia que para el analito.

La exactitud de un mtodo depende de su selectividad para el analito Sin embargo, incluso

el mejor mtodo puede no estar libre de interferencias que contribuyan a la seal registrada.
Las interferencias potenciales pueden encontrarse en la muestra propiamente dicha, o en
los reactivos que se utilizan durante el anlisis. Si no hay interferencia alguna, la totalidad
de la seal medida durante el anlisis, SMEDIDA, es la suma de la seal producida por el
analito ms la de los reactivos, SREACT.

La ecuacin para la seal SMEDIDA = SA + SREACT. = KCA + SREACT, siendo CA la concentracin

del analito. Esta ecuacin no podr resolverse si no se dispone de una determinacin
independiente de SREACT. La contribucin de SREACT se determina midiendo la seal de un
reactivo en un anlisis en el que no entra la muestra, que es lo que se denomina el blanco
del mtodo.
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Blanco del mtodo

Muestra que contiene todos los componentes de la matriz excepto el analito.

Robustez y solidez

Para que un mtodo sea til debe proporcionar resultados fiables. En la realidad, los
mtodos estn sometidos a distintas interferencias qumicas y fsicas que contribuyen a la
incertidumbre del anlisis. Cuando un mtodo est relativamente libre de interferencias
qumicas, puede aplicarse a la determinacin de analitos en muestras con una amplia
variedad de matrices. Estos mtodos se consideran robustos. Se considera robusto aquel
mtodo que puede aplicarse a los analitos en una amplia variedad de matrices.

Las variaciones aleatorias en las condiciones experimentales tambin introducen

incertidumbre. Si la sensibilidad de un mtodo depende en gran medida de las condiciones
experimentales, por ejemplo, de la temperatura, de la acidez o del tiempo de reaccin, las
pequeas variaciones de estas condiciones pueden dar lugar a resultados
significativamente distintos. Un mtodo slido es relativamente insensible a los cambios en
condiciones experimentales. Se considera slido aquel mtodo que no es sensible a los
cambios de las condiciones experimentales.

Lmite de deteccin

El lmite de deteccin de un mtodo es la menor cantidad o concentracin de analito que

puede detectar con seguridad estadstica. La International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) define el lmite de deteccin como la menor concentracin o cantidad
absoluta de un analito que produce una seal significativamente mayor que la que se
obtiene con el blanco de reactivo. Matemticamente, la seal del analito en el lmite de
deteccin (SA)LD , es
(SA)LD = S REACT + z(Sigma)REACT

Donde SREACT es la seal del reactivo del blanco, (SigmaREACT es la desviacin estndar
conocida para la seal del reactivo del blanco y z es un factor correspondiente al nivel de
confianza deseado. La concentracin correspondiente al lmite de deteccin (CA)L D est
dada por la siguiente relacin:

(CA)LD = (SA)L D / k

El valor de z depende del nivel de significacin deseado con el que se va a informar el lmite
de deteccin. Lo habitual es dar a z un valor de 3 que corresponde a un nivel de significacin
de alfa = 0.00135 (tabla de distribucin normal de una cola). Por lo tanto, slo el 0.135 %
de las medidas efectuadas en el blanco darn seales situadas fuera de este rango. Cuando
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se desconoce (Sigma) REACT, el trmino z(Sigma)REACT pude sustituirse por t (SREACT ) ,

donde t es el valor adecuado de la tabla t de un anlisis de una cola.

Al analizar una muestra para determinar la presencia de un analito, se compara la seal de

la muestra con la del blanco. La hiptesis nula es que la muestra no contiene analito, en
cuyo caso (SA) LD y SREACT sern idnticos. La hiptesis alternativa es que si existe analito
y que (SA) LD es > SREACT, si (SA )LD supera a SREACT por un valor de z Sigma (ts), se
rechazar la hiptesis nula y se admitir que hay pruebas de existencia de analito en la
muestra. La probabilidad de que se rechace falsamente una hiptesis nula, es decir, de un
error tipo 1, es la misma que el nivel de significacin. Si se selecciona z como 3, la
probabilidad de un error de tipo 1 se reducir a 0.135 %.

Lmite de cuantificacin

Es la concentracin o cantidad absoluta ms pequea de un analito que puede

determinarse con seguridad y se denomina (LDC).

El Committee on Enviromental Analytical Chemistry of the American Chemical Society

recomienda la siguiente expresin para el lmite de cuantificacin:

(SA)LDC = SREACT + 10(Sigma)REACT

Test de significacin

Un test de significacin se crea para determinar si la diferencia entre dos o mas valores es
demasiado grande como para que pueda explicarse por un error aleatorio. Al crear una
prueba de significacin, el primer paso consiste en definir el problema experimental como
una cuestin de si o no. Una hiptesis nula y una hiptesis alternativa proporcionan
respuestas a la pregunta. La hiptesis nula, H0 implica que error aleatorio es suficiente para
explicar cualquier diferencia entre los valores que se comparan. La hiptesis alternativa, HA,
es que la diferencia entre los valores es demasiado grande como para que pueda ser
explicada por un error aleatorio y por tanto, debe ser real. La prueba de significacin se
lleva a cabo sobre la hiptesis nula que, tras la prueba, se retiene o se rechaza. Si la
hiptesis nula se rechaza, deber aceptarse la hiptesis alternativa. Cuando la hiptesis
nula no se rechaza, se dice que se retiene, en lugar de decirse que se acepta.

Una vez establecidas la hiptesis nula y alternativa, se elige un nivel de significacin para
el anlisis. El nivel de significacin es el nivel de confianza para la retencin de la hiptesis
nula, o, en otras palabras, la probabilidad de que el rechazo de la hiptesis nula sea
incorrecto. En el primer caso, el nivel de significacin se expresa como porcentaje (p. ej.;
95 %) y en el segundo se expresa como alfa, definiendo alfa como:
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Alfa = 1 - Nivel de confianza

100

As para un nivel de confianza del 95%, alfa ser igual a 0.05

Test de Significacin de dos colas. Test en la que se rechaza la hiptesis nula para los
valores situados a ambos extremos de la distribucin normal.

Test de Significacin de una cola. Test en la que la hiptesis nula queda rechazada para
los valores situados slo en un extremo de la distribucin normal.

Comparacin entre xmedia y (u)

Un enfoque para validar un nuevo mtodo analtico consiste en analizar una muestra patrn
que contiene una cantidad conocida de analito (u). La exactitud del mtodo se juzga
determinando la cantidad media de analito presente en varias muestras, XMEDIA y usando un
test de significacin para compararla con (u). La hiptesis nula es que XMEDIA y (u) sern
iguales y que cualquier diferencia entre los dos valores puede explicarse por errores
aleatorios que afectan a la determinacin de XMEDIA, la hiptesis alternativa es que la
diferencia entre XMEDIA y (u) es demasiado grande para que pueda explicarse por un error
aleatorio.

Intervalos de confianza de las muestras (limite superior y limite inferior)

En el numeral 3.2 definimos el intervalo de confianza como la forma de expresar el valor

ms probable de la media de una poblacin (u), cuando se conoce la desviacin estndar
Sigma. Como (s2 ) es un estimador sin sesgo de (Sigma)2 debe ser posible obtener
intervalos de confianza para muestras sustituyendo (s) por (Sigma) en las siguientes
ecuaciones :

Miu (u) = Xi +/- z (Sigma) Y Miu (u) = XMEDIA +/- (z (Sigma)) /

(n)1/2

Los valores de z mostrados en las tablas estadsticas proceden de una curva de

distribucin normal, que es una funcin de (s2) y no se (Sigma)2 .Aunque (Sigma)2 es un
estimador sin sesgo de (s2), estos dos valores pueden diferir significativamente en cualquier
muestra seleccionada aleatoriamente. Para resolver la incertidumbre al calcular (Sigma)2,
se sustituye el valor de z por la variable t, que se define como (t >/= z ) en todos los niveles
de confianza. La segunda ecuacin quedar convertida en :

(u) = XMEDIA +/- t s / (n)1/2

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Grados de Libertad

Los denominadores de las siguientes ecuaciones

(Sigma )2 = = SUMATORIA ( Xi - u )i=1 i = N

n
y (s2) = SUMATORIA ( Xi - XMEDIA )i=1 i = N
n1

Se llaman habitualmente grados de libertad de la poblacin y de la muestra

respectivamente.
En el caso de la poblacin, el grado de libertad siempre es igual al nmero total de miembros
o sea (n). Sin embargo, en la varianza de la muestra, la sustitucin de (u) por (XMEDIA)
elimina un grado de libertad del clculo.

Estos deben determinarse de acuerdo al mtodo y modificaciones realizadas en el mismo

los cuales son definidos en el protocolo de validacin RAN-CD-FOR 024

Cuando los mtodos son modificados es de esperarse un posible efecto debido a una
modificacin del mtodo de ensayo de acuerdo a lo descrito en la tabla 3:

Tabla 3: Efecto de modificaciones al mtodo de ensayo sobre los parmetros a determinar

Modificacin Ejemplos de los Posibles Efectos Sobre:

Mtodo de extraccin Porcentaje de recuperacin

Matriz de la muestra
Cambios en el pH
Cambio de operador
Deteccin
Especificidad, porcentaje de recuperacin
Robustez
Repetibilidad Lmite de deteccin exactitud
(Sesgo)
Intervalo de trabajo / linealidad, eventualmente
especificidad

5.1.3. VALIDACIN DE MTODOS CLNICOS

Para realizar la validacin se requiere material de control de calidad interno, muestras de

pacientes, calibradores de concentraciones conocidas y se debe verificar las condiciones
de almacenamiento, temperatura, tiempo y embalajes, garantizando la integridad y
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estabilidad de los especmenes muestreados. Para los mtodos cuantitativos se

realizarn las siguientes estimaciones:

5.1.3.1. Evaluacin de imprecisin bajo condiciones de

repetibilidad

Realizacin de varias medidas en las mismas condiciones de medicin, mismo

reactivo, mismo evento de calibracin, mismo analizador y de medio ambiente por el
mismo operador en un periodo corto de tiempo.

- Duracin del estudio: 1 da.

- Nmero de pruebas a realizar: 10 por cada nivel de control.

- Material requerido: Materiales de control de calidad interno de diferentes niveles

del mtodo a evaluar, reactivos para cada equipo, printer del equipo.

- Procesamiento del material de control: Realizar 10 corridas de cada

concentracin del material de control el mismo da en orden diferente evaluando la
prueba en cuestin. Mantener las condiciones de conservacin y estabilidad del
material de control, especificadas por el fabricante. Recopilar los datos obtenidos y
realizar la estimacin cuantitativa de media, Desviacin Estndar (DS) y Coeficiente
de variacin (%CV).

- Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variacin obtenidos bajo

condiciones de repetibilidad deben ser 0.25 del error total permitido por el estndar
establecido, sea variabilidad biolgica, CLIA, Rhoads, por manufactura o algn otro.

5.1.3.2. Evaluacin de imprecisin bajo condiciones de precisin

intermedia

- Duracin del estudio: 5 das.

- Nmero de pruebas a realizar: Mnimo 10.

- Material requerido: Materiales de control de calidad de diferentes

concentraciones, reactivos para cada equipo, printer del equipo.

- Procesamiento del material de control: Procesar 1 muestra de cada nivel del

material de control al arranque y al final de la corrida o AM y PM, durante 5 das o cada
nivel por corrida analtica durante 10 das, Anexar el printer del equipo. Recolectar
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datos y realizar la estimacin cuantitativa de media, Desviacin Estndar (DS) y

Coeficiente de variacin (%CV).

- Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variacin obtenidos bajo

condiciones de reproducibilidad deben ser 0.33 del error total permitido por el
estndar establecido, sea variabilidad biolgica, CLIA, Rhoads, por manufactura o
algn otro.

5.1.3.3. Evaluacin de exactitud del mtodo: Comparacin de

mtodos

- Duracin del estudio: 5 das.

- Nmero de pruebas a realizar: Mnimo 10.

- Material requerido: Muestras de pacientes cuyos resultados cubran el rango

dinmico del mtodo, reactivo de los equipos, formatos de registro y printer del
equipo., muestras de pruebas de evaluacin externa ya reportadas

Procesamiento de muestras: Seleccionar 10 muestras de material de control (5 por

duplicado) que cubran el rango dinmico del mtodo y que hayan sido recolectadas y
conservadas en condiciones ptimas para su procesamiento. Esta evaluacin puede
realizarse con material de referencia o muestras de pruebas de evaluacin externa
previamente analizadas.

Criterio de aceptabilidad: Recolectar y realizar la estimacin cuantitativa de:

Herramienta
estadstica Criterio de Aceptabilidad Sensibilidad
Error sistemtico proporcional: si varan
Pendiente
0,90 - 1,10 de forma proporcional al valor de la
(Slope:B)
magnitud medida.

Lo ms cercano a 0, o dos veces Error sistemtico constante. Si se trata de

Intercepto (A)
el limite de deteccin un mismo valor de la magnitud de medida.
R Coeficiente de Intensidad entre la asociacin y la relacin
0,95 - 1,00
variacin de las variables.
Evaluacin del error sistemtico entre los
Ecuacin de la recta y= bx + a
mtodos
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SESGO Menor del error total permitido

(BIAS) (Yc-Xc)/Xc*100
Reemplazar en la ecuacin de la
Error sistemtico en recta X por el nivel de decisin y
Error sistemtico en los niveles de
los lmites de estimar el valor de Y, luego
decisin
decisin clnico calcular e sesgo en %, este debe
ser menor que el error permitido

Para las pruebas cualitativas no se realiza comparacin de mtodos se realiza

verificacin del cut off

5.1.3.4. Verificacin del punto de corte

Se determina usando material de control provisto por la casa comercial (control

de calidad dependiente) o un control independiente cercano al punto de corte
con n de 30, siguiendo las especificaciones de la gua CLSI EP12

Duracin: 1 da

Materiales: control positivo, control negativo, diluciones del control positivo

cercanas al punto de corte, y reactivos para la ejecucin del ensayo, printer del
equipo

Nmero de pruebas realizadas: 10 por cada dilucin.

Procedimiento:

Obtener muestras cercanas al punto de corte, a partir del control positivo de

concentracin conocida y realizar las diluciones hasta obtener el valor C50 +-
20%

Tabla diluciones para evaluacin del punto de corte

MUESTRA VOLUMEN DE MR VOLUMEN DILUYENTE

C1 0,1 0,9
C2 0,2 0,8
C3 0,3 0,7
C4 0,4 0,6
C5 0,5 0,5
C6 0,6 0,4
C7 0,7 0,3
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C8 0,8 0,2
C9 0,9 0,1
C10 1 0

Analizar 10 veces cada dilucin, el mismo da, en orden diferente, Procesar

control positivo y control negativo al mismo tiempo que se procesan las
diluciones

Imprimir los resultados del equipo (printer del equipo) y realizar el anlisis
estadstico: Proporcin (%) de resultados positivos y negativos en cada nivel
de dilucin
5.1.4. VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS

En el rea de microbiologa se utilizan dos caractersticas de medicin: La

investigacin de Presencia /Ausencia en un peso determinado de muestra y el
recuento de unidades formadoras de colonias (UFC). Para la construccin de dichos
protocolos se tendrn encuentra las normas ISO 16140 e ISO 11133- 1 Y 2, con la
ltima versin vigente y la informacin publicada por el INVIMA.

Los procesos de medicin en microbiologa presentan caractersticas diferentes con

respecto a otros, los recuento se realizan sobre placas que tienen un nmero
pequeo de UFC, esto plantea problemas importantes sobre todo cuando existe un
nmero pequeo inferior a 15 ufc, por que la distribucin es discreta y no continua,
por ello el modelo de distribucin Gaussiano no es aplicable y debe seguirse otro
tipo de distribuciones como Poisson o Binomial Negativa (J.Laso)

5.1.4.1. Etapas definidas en el proceso de validacin

Seleccin de medios de composicin qumica especfica y temperatura de

incubacin que permitan seleccionar en funcin de sus caractersticas unos
microorganismos de otros.
Observacin de las caractersticas morfolgicas y fsica de los
microorganismos en los medios utilizados
Realizacin de pruebas bioqumicas complementarias que diferencia unos
microorganismos de otros

5.1.4.2. Parmetros de validacin

Los parmetros dependern del tipo de mtodo utilizado y definirn aquellas

caractersticas que sean tiles para el uso previsto.
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Se definen dos tipos de metodologas cualitativas (Cuyo objetivo es detectar

ausencia o presencia) y mtodos cuantitativos (El objeto es detectar un valor
numrico expresados como UFC de microorganismo objetivo, en estos se
incluyen los mtodos de Nmeros ms probables (NMP) que son
semicuantitativos.

5.1.4.3. Parmetros de metodologas cualitativas

- Limite de Deteccin
- Falsos positivos
- Falsos negativos
- Sensibilidad
- Especificidad
- Eficiencia

5.1.4.4. Parmetros metodologas cuantitativas

- Exactitud expresada como recuperacin

- Precisin expresada como coeficiente de variacin
- Limite de deteccin
- Limite de Cuantificacin

Para los procedimientos de validacin se incluyen mnimo tres niveles de contaminacin

o fortificacin de matrices as:

- 100 UFC, 10 UFC y 1 UFC para el lmite de cuantificacin,

- 0 UFC, 1 UFC, 5 UFC, 10 UFC y 20 UFC para el lmite de deteccin.

Los estudios de inclusividad y exclusividad no aplican para recuentos de mesfilos,

recuento de mohos y levaduras.

5.1.4.5. Tipos de muestras para la validacin

Para llevar a cabo los ejercicios de validacin de mtodos cuantitativos y

cualitativos se utilizan matrices naturalmente contaminados, previamente
analizados en el laboratorio con nivel de contaminacin no muy altos. La
seleccin de las categoras de alimentos utilizados depende del tipo y grupo de
microorganismos y del alcance de la validacin de acuerdo a la norma ISO
16140: 2008 Anexo B, en el caso de muestras clnicas se tomaran las muestras
empleadas en el ensayo para el uso previsto por la casa comercial.

5.1.4.6. Nmero de muestras

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Se establece un n mnimo de 20 muestras, y el nmero de matrices dependern

del uso previsto, igualmente se deben incluir muestras negativas mnimo 6

5.1.4.7. Material de referencia certificado

De acuerdo a la metodologa a validar se selecciona el detector de inters

(medio o caldo de cultivo) siguiendo el procedimiento tcnico oficial o la norma
de referencia del mtodo. Por ejemplo para el recuento de Estafilococo
coagulasa positivo la norma de referencia es ICMSF Vol I segunda edicin
2000 Mtodo 1 pginas 231 a 236 la cual indica en el tem de Materiales y
mtodos la referencia el detector Baird Parker.

Se prepararan las suspensiones bacterianas de la cepa de inters en las

concentraciones 10 UFC, 5 UFC, 1 UFC y 0 UFC, a partir de la dilucin de cepa
de inters

Para obtener las concentraciones anteriores se debe aplicar la frmula de

C1.V1= C2.V2
Donde:
C1: Concentracin inicial (100 ufc),
V1: Volumen de la dilucin a determinar para preparar la concentracin
requerida.
C2: Concentracin en ufc a preparar (20 ufc, 10 ufc, 5 ufc. 1 ufc)
V2: Volumen final de la suspensin con la concentracin requerida

El volumen a calcular corresponde a la cantidad de suspensin necesaria para

las repeticiones requeridas.

Los inculos se deben procesar el mismo da de su preparacin.

Los resultados obtenidos despus de la lectura se registran las hojas de trabajo

y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel

Una vez transcritos los datos se procede hacer el clculo del lmite de deteccin

5.1.4.8. Repetibilidad y precisin intermedia

Fortificacin de las matrices:

Una vez pesadas la muestras se identifican y se fortifican con los inoculo
previamente preparados agregando 1mL de la suspensin correspondiente a la
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matriz pesada, luego se homogeniza cumpliendo el procedimiento tcnico a

validar.

Procesamiento de Muestras:

Las matrices elegidas fortificadas se procesan de acuerdo al procedimiento

tcnico de la metodologa a validar, realizando minino dos repeticiones por
matriz

La repetibilidad ser evaluada con los resultados de las repeticiones realizadas

por el analista responsable del ensayo.

La precisin intermedia se evala entre los analistas.

Los resultados obtenidos despus de la lectura se registran en las hojas de

trabajo y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel

Una vez transcritos los datos se procede hacer las estimaciones estadsticas

5.1.4.9. Sensibilidad y especificidad

Para realizar los clculos de sensibilidad y especificidad la fortificacin de las

muestras se realiza igual que para la estimacin de la repetibilidad y precisin
intermedia hasta el procesamiento. Con los resultados obtenidos se aplica la
tabla de contingencia de 2 x2.

Dichos resultados se ubican en la tabla asi:

A. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas
deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado positivo.
B. Muestras que son negativos (Sin Fortificar o con ausencia del
microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado
positivo.
C. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas
deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado negativo.
D. Muestras que son negativas (Sin Fortificar o con ausencia del
microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado
negativo.

A = Verdaderos Positivos
B = Falsos Positivos
C = Falsos Negativos
D = Verdaderos Negativos
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Valor de la Caracterstica
Resultado de la
Prueba con el
Mtodo a Validar PRESENTE AUSENTE Total

Positivo A B A +B

Negativo C D C+D

Total A +C B+D A +B + C+ D

Una vez diligenciada la tabla de 2x2 se aplican las siguientes formulas:

Sensibilidad: A / A+C x 100
Especificidad: D/ B+D x 100

La tabla de contingencia tambin permite hacer el clculo de valor predictivo

positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) as como la eficiencia de la
prueba:

VPP: A/ A+B x 100

VPN: D/C+D x 100
Eficiencia: A+D/N x 100
Donde N = A+B+C+D

5.1.5. INFORME DE VALIDACIN DE UN MTODO

Cada validacin debe ir acompaada de un informe:

El mismo debe ser preparado por el profesional de laboratorio / operador / tcnico y

revisado por la Direccin Tcnica. El contenido del informe se establece en el
formato informe de validacin F-SA-141

6. REGSTROS
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Registro Responsable Como Donde Tiempo de Disposicin

conservarlo conservarlo conservacin final
Segn Listado Segn Listado Segn Listado
F-SA-140 Maestro de Maestro de Maestro de
Director Tcnico documentos F- documentos F-MC- documentos F-MC-
Protocolo de MC-04, Segn F- 04, Segn F-MC-03 - 04, Segn F-MC-03
/Profesional de Medio fsico y/o
Validacin Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de
electrnico
maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla
registros y/o tabla retencin documental de retencin
de retencin documental
documental
F-SA-141 Segn Listado Segn Listado Segn Listado
Informe de Maestro de Maestro de Maestro de
Director Tcnico documentos F- documentos F-MC- documentos F-MC-
validacin MC-04, Segn F- 04, Segn F-MC-03 - 04, Segn F-MC-03
/Profesional de Medio fsico y/o
Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de
electrnico
maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla
registros y/o tabla retencin documental de retencin
de retencin documental
documental

7. ANEXOS

Anexo No.1 Referencias

Gua para la validacin de mtodos de ensayo. Organismo Argentino para la Acreditacin

(OAA).
NTC-ISO/IEC 17025:2005 Requisitos Generales de Competencia de Laboratorios de
Calibracin y Ensayo.
Curso sobre Validacin de Metodologas Analticas, Sanidad del Ambiente, INS.
Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, EURACHEM / CITAC, GUIDE CG 4,
THIRD EDITION 2012
ASTM (American Society for Testing and Materials 1992): D3868-79, D1179-93.
J.Laso Sanchez 2005. Situacin de la Validacin de los ensayos microbiolgicos en los
laboratorios.
NCCLS. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods;
Approved GuidelineSecond Edition. NCCLS document EP5-A2 (ISBN 1-56238-542-9).
NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087- 1898 USA,
2004.
NCCLS. Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical
Approach; Approved Guideline. NCCLS document EP6-A (ISBN 1-56238-498-8). NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference Testing in Clinical
Chemistry; Approved GuidelineSecond Edition. CLSI document EP7-A2 (ISBN 1-56238-
584-4). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400,
Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005.
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PGINA: 26 DE 26

NCCLS. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved
GuidelineSecond Edition. NCCLS document EP9-A2 (ISBN 1-56238-472-4). NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2002.
NCCLS. Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation;
Approved Guideline. NCCLS document EP17-A (ISBN 1-56238-551-8). NCCLS, 940
WestValley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2004.
Garzn Gonzlez Alba Cecilia. Validacin, verificacin o evaluacin de mtodos? Lo
realmente importante es ser una herramienta de seguridad para el paciente. Agosto de
2013

8. HISTORIAL

VERSIN VIGENCIA IDENTIFICACIN DE LOS

CAMBIOS
1 14/10/2015 Versin inicial