Guia de Validacion-Formato 28-5-2010

GUIAS TECNICAS
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Fecha de Emisión
28/05/2010
Tema:
VALIDACIÓN DE MÉTODOS.
Revisión
0
Elaborado y revisado por: Aprobado por: Fecha de Aprobación
Comité de Validación Ing. Evelyn de Venegas
1.0 Introducción
La validación ha sido objeto de atención por ser requerida en normas sobre sistemas de
gestión de la calidad, sobre software y particularmente en la norma ISO/IEC 17025 sobre
requisitos generales para laboratorios de calibración y ensayo.
La aplicabilidad del requisito sobre validación de métodos, particularmente en la norma

ISO/IEC 17025, ha sido frecuentemente materia de controversia dado que cabe la
interpretación de que cuando se menciona o se describe un método en una norma,
entonces denominado método normalizado, no es ya necesaria la validación del mismo.
El propósito de este trabajo es discutir el concepto de validación, los elementos que lo

constituyen y los procesos para llevarla a cabo, con la esperanza de reducir las
controversias respecto a este tema.
Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, debe ser lo
suficientemente confiable para que cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con
confianza. Así, el desempeño del método debe validarse y debe estimarse la
incertidumbre del resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser
evaluada y establecida de una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de
forma interna y fácil de interpretar. La mayor parte de la información requerida para
evaluar la incertidumbre se puede obtener durante la validación del método.
La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas y

demostrativas de que un método de análisis es lo suficiente fiable y reproducible para
producir el resultado previsto dentro de intervalos o parámetros definidos y para el
propósito requerido.
Revisión Fecha de Emisión Página GUIAS TECNICAS
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2.0 Objetivos
Establecer una guía para las actividades de validación de métodos de ensayo no

normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que el laboratorio puede
aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Sistematizar los procedimientos para la realización de la validación de los métodos de

ensayo y de calibración.
Evitar las discrepancia respecto a cuando validar y la extensión de la validación según

sea el caso.
3.0 Alcance
Esta guía la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados por CONACYT y los
que soliciten la acreditación ante dicho organismo, los evaluadores y expertos técnicos
que actúan en los procesos de acreditación, y a todos los métodos de ensayo
establecidos dentro del alcance de acreditación.
4.0 Definiciones
Adecuación al propósito:
‘Grado al cual los datos producidos por un proceso de medición permiten a un Usuario
tomar decisiones técnica y administrativamente correctas para un Propósito establecido.’
(Guía EURACHEM)
Control de Calidad Interno:

‘Serie de procedimientos asumidos por el personal de un laboratorio para el continuo
seguimiento de las operaciones y de los resultados de las mediciones con el fin de decidir
si los resultados son lo suficientemente confiables como para ser emitidos‘. (Guía
EURACHEM)
Especificidad:
Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente al
analito de interés y no a otros componentes de la muestra.’(Guía de validación de
métodos analíticos, Colegio de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C.)
Incertidumbre de medida:
Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los
valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando (VIM 3.9).
Estabilidad analítica de la muestra:
Propiedad de una muestra, preparada para su análisis, de conservar su integridad física o
química y la concentración del analito, después de almacenarse durante un tiempo
determinado durante condiciones específicas. (Basado en la Guía de Validación de
Métodos analíticos del Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos, Biólogos, México
A.C. Edición 2002)
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Exactitud de una medición:

Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de
referencia aceptado. (Guía EURACHEM)
Intervalo:
‘Concentraciones incluidas entre la concentración superior e inferior del analito
(incluyendo estas), para las cuales se ha demostrado que el método analítico es preciso,
exacto y lineal.‘ (Guía de validación de métodos analíticos, Colegio de Químicos
Farmacéuticos Biólogos México, A.C.)
Límite de detección:
‘El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable o ‘La
menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero no
necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba.’ (Guía
EURACHEM)
Límite de cuantificación:
‘La menor concentración de un analito que puede determinarse con una precisión
(repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condiciones establecidas de la prueba.’
(Guía EURACHEM)
Linealidad:
‘Define la habilidad del método para obtener resultados de la prueba Proporcionales a la
concentración del analito. (Guía EURACHEM)
Nota: Se deduce que el intervalo lineal es el intervalo de concentraciones del analito
dentro del cual los resultados de prueba obtenidos por el método son proporcionales a la
concentración del analito.’
Material de Referencia (MR):
‘Material o sustancia en la cual uno o más valores de sus propiedades son
suficientemente homogéneos y bien definidos como para ser utilizados en la calibración
de aparatos, en la evaluación de un método de medición o para asignar valores a otros
materiales. (Guía EURACHEM)
Material de Referencia Certificado (MRC):

‘Material de referencia acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus
propiedades están certificados por un procedimiento que establece trazabilidad a una
realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de la propiedad y en el
que cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre con un nivel declarado de
confianza.’ (Guía EURACHEM)
Mesurando: Magnitud particular sometida a medición (VIM 2.6)
Métodos no normalizados:
Se refiere a los métodos que son proporcionados por el proveedor de un equipo y no
provienen directamente de un libro oficial, por lo que no pueden considerarse como
desarrollados por el laboratorio, pero sí pueden ser validados por él.
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Repetibilidad (de los resultados de las mediciones):

‘Precisión en condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones según las cuales los
resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo método, sobre
objetos de prueba idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el
mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo cortos.’ (Guía EURACHEM).
Precisión:
‘Es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas independientes
obtenidos bajo condiciones estipuladas.’ (Guía EURACHEM)
Nota: La precisión depende sólo de la distribución de los errores aleatorios y no se

relaciona con el valor verdadero o valor especificado. La medida de la precisión
generalmente se expresa en términos de imprecisión y se calcula como una desviación
estándar de los resultados de la prueba. “Resultados de prueba independientes” significa
que los resultados fueron obtenidos de tal forma que no son influenciados por cualquier
otro resultado previo sobre el mismo o similar objeto de prueba. Las mediciones
cuantitativas de la precisión dependen en forma crítica de las condiciones estipuladas. La
Repetibilidad y la Reproducibilidad son series particulares de condiciones extremas.
Precisión intermedia:
‘La precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio en: diferentes días,
diferentes analistas, diferente equipo, etc.’ (Guía EURACHEM).
Protocolo de Validación
Descripción de pruebas especificas para demostrar que un proceso da resultados que
cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistentes Guía de validación de
métodos analíticos, Colegio de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C.)
Prueba de Robustez:
‘Estudio dentro del laboratorio para evaluar el comportamiento de un proceso analítico
cuando se efectúan pequeños cambios en las condiciones ambientales y/o de operación,
semejantes a aquéllos que pudieran surgir en los diferentes ambientes de prueba. La
prueba de robustez permite obtener información de los efectos de cambios menores de
una forma rápida y sistemática (Guía EURACHEM).
Rango:
Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior para las cuales se ha
demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método. (Validación de
métodos analíticos; A.E.F.I.) 2001.
Reproducibilidad:
‘Precisión bajo condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones según las cuales los
resultados de prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba
idénticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes
equipos. (Guía EURACHEM)
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Recuperación (*):
‘La fracción de analito adicionada a una muestra de prueba (muestra fortificada o
adicionada) previa al análisis que es determinada efectivamente por el método; el
porcentaje de recuperación (%R) entre las muestras fortificadas y sin fortificar se calcula
como sigue:
%R = [(CF-CU)/CA] x 100
Donde CF es la concentración de analito medida en la muestra fortificada; CU es la

concentración de analito medida en la muestra sin fortificar; CA es la concentración del
analito adicionado (valor medido, no determinado por el método) en la muestra fortificada.’
(Guía EURACHEM).
Revalidación
La revalidación de un método analítico consiste en repetir de forma total o parcial su
validación, ya sea debido a modificaciones en el método, equipos, en la muestra a
analizar, etc. para garantizar la obtención de resultados fiables. (Validación de métodos
analíticos; A.E.F.I.) 2001.
Sesgo:
‘La diferencia entre el valor esperado de los resultados de prueba y un valor de
Referencia aceptado. (Guía EURACHEM).
Sensibilidad:
‘El cambio en la respuesta de un instrumento de medición dividido por el correspondiente
cambio del estímulo. (Guía EURACHEM).
Nota:
El estímulo puede ser por ejemplo, la cantidad del mensurando presente. La sensibilidad
puede depender del valor de estímulo. Aunque esta definición se aplica claramente a un
instrumento de medición, también puede aplicarse al método analítico como un todo,
tomando en cuenta otros factores tales como el efecto de los niveles de concentración.
Validación:
Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. (ISO 9000:2008/3.8.5)
Validación de un Método:
1. El proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un método
y la identificación de las influencias que pueden modificar esas características y hasta qué
punto. ¿Qué analitos puede determinar el método, en qué matrices, en presencia de qué
interferencias? ¿En esas condiciones, qué niveles de precisión y de exactitud pueden
alcanzarse?
2. El proceso de verificación de que un método es adecuado a su propósito, o sea, para
resolver un problema analítico particular. (Guía EURACHEM)
Nota:
La definición 1. Es aplicable cuando un método se desarrolla sin tener en mente ningún
problema en particular.
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La definición 2. Es aplicable cuando el método se está desarrollando con un propósito

específico. En química analítica otro uso comúnmente encontrado del término de
validación es en el contexto de instrumentación. La Validación de Instrumentos se usa
para describir el proceso de establecer que un instrumento en un momento dado es capaz
de desempeñarse de acuerdo a la especificación diseñada. Estos procesos podrán
alcanzarse, por ejemplo, mediante calibraciones o verificaciones de desempeño.
Verificación:
Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los
requisitos especificados. (ISO 9000:2008/3.8.4)
Valor verdadero convencional (de una magnitud):
‘Valor atribuido a una magnitud particular y aceptado, algunas veces por convención, por
tener una incertidumbre apropiada para un propósito dado. (Guía EURACHEM)
Nota:
“Valor Verdadero Convencional” algunas veces es denominado “valor asignado”, “mejor
estimado” del valor, “valor convencional” o “valor de referencia”. Frecuentemente, se
utiliza un cierto número de resultados de medición de una magnitud para establecer un
valor verdadero convencional.
5.0 Requisitos Generales
5.1. Pasos para la validación
Cada validación de un procedimiento consiste en tres pasos:

5.1.1 Establecimiento del protocolo de validación
5.1.2 Realización de la validación,
5.1.3 Elaboración del informe.
5.1.1. Establecer un protocolo de validación que contenga al menos la siguiente

información:
(Debe incluir número o código, el objetivo, la definición del sistema a validar, la
identificación de los parámetros, el diseño del plan experimental y los criterios de
aceptación. Debe ser especifico para cada tipo de muestra y método, debe ser firmado y
fechado por las personas responsables de la validación y aprobación).
A. OBJETIVO:
(Exposición de la finalidad de la validación y propuestas de fechas de inicio y final.)
B. ALCANCE
(Delimitación de tipo de muestra, matriz, analito, rango de concentración, técnica
analítica, etc.) Formula cuali-cuantitativa cuando aplique.
C. RESPONSABLES
(Equipo de Validación: Analista(s) responsable(s) de la Validación, Jefe de Laboratorio,
Responsable de Calidad.)
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D. PARAMETROS A ESTUDIAR
(Los parámetros de desempeño a estudiar se seleccionan en función de las
características de la muestra, tipo de método analítico y rango de concentración del
analito.)
E. MUESTRAS
El muestreo se realiza de acuerdo con procedimientos escritos, (si aplica) en los
cuales se indican los sistemas de identificación y tratamiento previo de las muestras, si
se precisan placebos.
F. EQUIPOS INVOLUCRADOS EN LA VALIDACION

Se mencionan los equipos implicados en el proceso de validación (pHmetros,
balanzas, cromatógrafos, etc.), y documentar que están convenientemente calificados y
calibrados, referenciando estos datos en el informe de validación.
G. DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO

(Debe describirse el método tal cual será puesto en el uso rutinario, detallando todos
los elementos abajo mencionado, y haciendo énfasis en puntos críticos de la
metodología, condiciones instrumentales y número de repeticiones, verificación de
idoneidad de las condiciones operatorias definidas, formulas para el cálculo de
resultados y su tratamiento estadístico si es necesario, bibliografía y referencias.
• REACTIVOS
• ESTANDARES
• MATERIALES
• INSTRUMENTACIÒN
• CONDICIONES AMBIENTALES
• MEDIDAS DE SEGURIDAD PARA EL USO DE REACTIVOS
• PREPARACION DE REACTIVOS
• PREPARACIÒN DE ESTANDARES
• PREPARACION DE LA MUESTRA
• PROCEDIMIENTO
• CALCULOS
H. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÒN DE LOS PARAMETROS A

EVALUAR
(Se puede hacer una tabla que permita visualizar los parámetros de desempeño, como
se hará la determinación de cada parámetro de desempeño y que se reportara para la
evaluación final
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Ejemplo de algunos parámetros, algunas determinaciones y estadísticos a calcular.
PARAMETRO
DE DETERMINACION REPORTAR
DESEMPEÑO
Un analista prepara solucione de estándar
Precisión del
al 100% de la concentración del analito
sistema Coeficiente de variación %
desde una solución más concentrada y la
instrumental
lee o inyecta 6 veces en forma consecutiva
Un analista debe preparar por lo menos por Coeficiente de determinación
triplicado 5 niveles de concentración de la (r2)
solución de referencia por dilución (a partir
de una solución más concentrada).La Pendiente (b)
concentración central debe ser la
Linealidad concentración que representa el 100% en
del sistema la muestra procesada para su medición. El
(1) intervalo debe incluir la especificación. Intervalo de confianza de la
Medir la respuesta analítica bajo las pendiente IC (β1)
mismas condiciones de medición, reportar
la relación concentración vs respuesta
analítica (Ejemplo. 60%,80%,100, Rango lineal
120%,140%)
Y de igual forma los otros parámetros
I. CRITERIOS DE ACEPTACIÒN
(Se establecerá a priori para cada uno de los parámetros, basándose en las necesidades
o finalidad del método y en la información recogida durante la fase de desarrollo del
procedimiento analítico.
Ejemplo de algunos parámetros, estadísticos a reportar y sus límites.
PARAMETRO DE
REPORTAR LIMITE
DESEMPEÑO
Precisión del
Coeficiente de variación ≤ 1.5%
sistema
Coeficiente de determinación ( r 2 ) ≥ 0.98
Pendiente (β1) ≠0
Linealidad del No debe incluir

Intervalo de confianza de la pendiente IC (β1)
sistema el cero
Rango lineal --------
Y de igual forma los otros parámetros
5.1.2. Realización de la validación.

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Una vez se ha aprobado el protocolo se procede a hacer la validación de acuerdo a lo

planificado. Aquí se incluye el proceso de cálculo estadístico de los distintos parámetros
evaluados.
5.1.3. Elaboración del informe y certificado de validación.
El informe de validación contendrá la información suficiente para poder concluir acerca

de la validación que se ha desarrollado. Debe incluir: Protocolo de validación (o hacer
referencia al mismo a través de un código), Resultados Analíticos, Resultados
Estadísticos, Interpretación de resultados, Conclusiones, la Declaración de Aptitud del
Método y cuando aplique el certificado de validación el cual podrá incluir:
- Analito evaluado
- Matriz o matrices ensayadas
- Técnica utilizada
- Documentos relacionados (protocolos, procedimientos, instrucciones de trabajo)
- Rango Validado
- Cuadro resumen con los resultados de los parámetros de desempeño evaluados.
- Analistas autorizados para la realización del ensayo.
Además será autorizado por o las personas asignadas por el laboratorio.
5.2. Establecimiento de las condiciones y alcance de la validación
5.2.1. Establecimiento de las condiciones
El laboratorio responsable del análisis o ensayo debe definir las condiciones y el alcance
de la validación de acuerdo a lo definido por esta guía y a su caso en particular.
En el caso de que el cliente lo solicite, el responsable del análisis o ensayo deberá

ponerse de acuerdo con el cliente sobre este aspecto.
5.2.2. Establecimiento del alcance de la validación
Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validación aumenta del primero al
tercero:
1. Se trata de un método de ensayo estandarizado y normalizado, que se aplica

exactamente como está descrito en la norma/procedimiento.
2. Se trata de una modificación a un método de ensayo normalizado o cuando se use

un método proporcionado por el proveedor de un equipo o sistema analítico.
Ejemplos: un método de extracción diferente u otra matriz, rangos distintos de
trabajo.
3. Se trata de un método de ensayo desarrollado en el laboratorio y que no se

encuentra en normas u otras colecciones de métodos.
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La validación en los casos descritos en el numeral 5.2.2 tiene objetivos distintos como
lo establece la tabla siguiente (tabla a).
Tabla a: Objetivos de la validación según el tipo de procedimiento de ensayos
Método de ensayo Objetivos de la Validación

Caso 1: método
Comprobación de que el laboratorio domina el ensayo y lo
Normalizado
utiliza correctamente
Comprobación de que la modificación introducida en el
método original no afecta la capacidad del laboratorio para
Caso 2: modificación
proporcionar resultados confiables. Ejemplos: Cambio del
de un método
método de extracción, otra matriz, cambios en el pH.
normalizado (no
Demostrar que el método proporcionado por el fabricante es
normalizado)
capaz de dar resultados confiables para el fin propuesto.
Caso 3: método Comprobación de que el método cumple con las

Desarrollado / interno. características necesarias para dar resultados confiables
para el fin propuesto.
Tabla b: Alcance de la validación según el tipo de procedimiento de prueba
Métodos Normalizados
Identificación Cuantificación Cuantificación de Evaluación de
de componentes características
Parámetros componentes minoritarios o establecidas*
mayoritarios impurezas en
trazas
Selectividad/ Especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la
+ + + +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Sí +
Linealidad del Método No + + +
Rango No + + +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección + No No No
Límite de Cuantificación No + + +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,
liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.
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Métodos Normalizados Modificados o No Normalizados

Identificación Cuantificación Cuantificación de Evaluación de
de componentes características
Parámetros componentes minoritarios o establecidas*
mayoritarios impurezas en
trazas
Selectividad/ Especificidad Sí + + +
+ + + +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Si +
Linealidad del Método No Sí Sí +
Rango No Sí Sí +
Límite de Detección + No No No
Límite de Cuantificación No + Sí +
Robustez + + + +
análisis o de las modificaciones que se le hagan al método.
Métodos Desarrollados / Internos

Identificación Cuantificación Cuantificación Evaluación de
de componentes de características
mayoritarios componentes establecidas*
Parámetros
minoritarios o
impurezas en
trazas
Selectividad/ Especificidad Sí Sí Sí +
Sí Sí Sí +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Sí +
Linealidad del Método No Sí Sí +
Rango No Sí Sí +
Límite de Detección Sí No + No
Límite de Cuantificación No + Sí +
Robustez + Si Sí +
análisis.
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6.0 Documentos de Referencia
1. Vocabulario Internacional de Términos Básicos de Metrología (VIM) , Segunda

edición 1993.
2. ISO 9000:2008 Sistema de Gestión de la Calidad – Conceptos y Vocabularios.
3. Norma NSR ISO/IEC 17025:2005 (NSR 03.00.07:06) Requisitos Generales para la
Competencia de los Laboratorios de Ensayo y Calibración
4. Métodos Analíticos Adecuados a su propósito 2 Edición de la Eurachem,
Publicación técnica CNM-MRD-PT-030, CENAM
5. Guía para la Validación de métodos de ensayo del OAA DC-LE-05
6. Validación de métodos analíticos; Asociación Española de Farmacéuticos de la
Industria A.E.F.I., Barcelona marzo del 2001.
7. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM.
8. Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos
Farmacéuticos Biólogos. México Primera Edición mayo de 2002.
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ANEXO 1: Ejemplos para la Determinación de Parámetros Estadísticos para

Métodos Químicos de Análisis.
1. Selectividad/ Especificidad
Procedimiento de determinación de la selectividad
En el estudio de la selectividad, como norma general se comparan los resultados del

análisis de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos
de degradación, sustancias relacionadas, excipientes (matriz o placebo), y dependiendo
del tipo de muestra, tipo de técnica analítica, instrumento de medición.
Partiendo de la experiencia en el análisis de la muestra, se deben establecer las posibles

sustancias y/o elementos y adicionar cantidades conocidas de éstas, solas o combinadas
a la muestra y evaluar su respuesta al método, bajo las mismas condiciones de
análisis.
Para métodos de Identificación

- Se deben seleccionar sustancias que potencialmente interfieran en la
determinación con base en la estructura molecular del analito, precursores,
sustancias relacionadas, vías degradativas, entre otros.
Para métodos de Contenido/Valoración de impurezas.

- Si se dispone de las impurezas se deben adicionar éstas al analito y/o a la
muestra analítica en niveles que incluya la especificación. Analizar como lo indica
el método.
- Cuando no se dispone de las impurezas, la muestra que contiene el analito debe
someterse a condiciones que generen su inestabilidad química (luz, calor,
humedad, hidrólisis, ácido-básica y oxidación) y aplicar el método a la muestra
resultante.
Para métodos de límite de impurezas

Proceder a analizar, como lo indica el método los siguientes:
- Muestras individuales de la impureza (orgánicas, inorgánicas, o solventes
residuales).
- El producto (de pureza aceptable)
- Y la mezcla de estos.
Para métodos indicadores de estabilidad
Si se cuenta con los productos de degradación, preparar muestras

- La matriz sola
- con matriz adicionada de estos
- la matriz adicionada del analito
- la matriz adicionada analito y de productos de degradación.
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Analizar como lo indica el método.

Para análisis farmacéuticos si no se tienen los posibles productos de degradación se
pueden emplear, dependiendo de la naturaleza química del analito y si es posible, las
siguientes condiciones para favorecer la inestabilidad del analito en la muestra:
Condiciones
1. En un horno desde 70ºC a 120ºC o a
20ºC por debajo del punto de fusión del
analito 2 a 4 semanas
2. Exponer a luz UV, fluorescente y/o
humedad relativa, por un tiempo
apropiado
Analito, matriz y muestra 3. Hacer soluciones, ajustando el pH de 1
a 2 (HCl 0.1N)y/o de 10 a 12 (NaOH
0.1N) y someterlas a 60ºC por un tiempo
apropiado
4. Para muestras liquidas o semisólidas
(formas farmacéuticas) adicionar
peróxido de hidrogeno (3%) para
favorecer la oxidación del analito.
Estos estudios no se deben llevar a cabo para analitos que según la bibliografía, tengan
propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las
muestras a las condiciones antes mencionadas.
El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a niveles de
un 15 a 30%.
En el caso de métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos que utilizan sistemas
de medición volumétricas, la especificidad para los componentes de una muestra, es
sustentada con los resultados de exactitud y linealidad del método cumplidos los criterios
de aceptación.
Cuando haya duda en la demostración de la especificidad de un método analítico, se
sugiere que sea investigada por otra metodología de soporte.
Los resultados del estudio de selectividad están vinculados principalmente al
origen de la muestra, su preparación y las condiciones instrumentales. Cualquier
cambio en estos factores supone reconsiderar el estudio realizado.
Criterios de aceptación
La respuesta del método debe ser únicamente debida al analito.
2. Estabilidad analítica de la muestra
El analista debe establecer la etapa de análisis en la cual se desea evaluar la estabilidad,

además de determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras dependientes) o
no (muestras independientes) y las condiciones de almacenaje.
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Muestras dependientes
El analista debe procesar hasta la etapa preestablecida por lo menos por triplicado una
muestra homogénea.
Fraccionar cada una de las preparaciones de acuerdo a las condiciones de almacenaje
(Ambiente, Refrigeración, t ºC , etc. durante un tiempo determinado ) de interés.
Terminar el análisis de una de las fracciones de cada preparación.
Proseguir el análisis de cada una de las fracciones al término de cada condición de
almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el método
contempla el uso de una solución de referencia.
Reportar el resultado.
Muestras independientes
A partir de una muestra homogénea, el analista debe analizar por triplicado hasta
completar el análisis y obtener el resultado.
Simultáneamente y de la misma muestra, procesar el número de muestras necesarias
para cada condición de almacenaje hasta la etapa preestablecida (preparaciones) por
triplicado.
Proseguir el análisis de cada una de las preparaciones al término de cada condición de
almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el método
contempla el uso de una solución de referencia.
Reportar el resultado
Cálculos
• Calcular la media aritmética del análisis inicial y de cada condición de almacenaje
• Calcular la diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de

almacenaje respecto del análisis inicial
• │di │≤ 2% para métodos cromatografitos y volumétricos
• │di │≤ 3% para métodos químicos o espectrofotometritos
• │di │≤ 5% para métodos biológicos
• No mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en

la muestra.
• Otros criterio de aceptación, deben ser justificado.
3. Linealidad del Sistema
Un analista debe preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentración

(Intervalo o rango) de la solución de referencia ya sea por dilución (a partir de una misma
solución concentrada o por pesadas independientes (cuando no sea posible prepararlas
por dilución).
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La concentración central debe ser igual a la que se prepara la solución de referencia en el

método.
El intervalo debe incluir la especificación para el caso de aquellos métodos utilizados para
evaluar muestras que se conoce el contenido estimado de activo (ejemplo formas
farmacéuticas, Principios activos)
Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones de medición, reportar la relación
concentración vs. respuesta analítica (Ejemplo: Concentración vs. Área, Concentración
vs. Absorbancia).
Calcular el valor de la pendiente (b), la ordenada en el origen (a), el coeficiente de
determinación ( r2 )y el intervalo de confianza para la pendiente ( IC(b)). Si el método
presenta un ajuste distinto a la línea recta, utilizar la estadística apropiada y justificarla.
El intervalo (rango) esta en función del propósito del método, y por lo general se expresa
como concentración.
Es crítico que el intervalo no excluya valores de concentración que potencialmente
puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra.
En análisis farmacéutico:
• Para Contenido/valoración/Potencia , sugiere un mínimo de ± 20%
• Para Contenido / Valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un “20%
por arriba de la especificación.
• Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120%.
• r2 ≥ 0.98
• IC (β1), no debe incluir el cero
• Otros criterios de aceptación debe ser justificado.
4. Linealidad del método y Rango
Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar una matriz.
Un analista debe preparar una matriz con el tipo de componentes que generalmente están
presentes en la muestra.
A la cantidad de matriz analítico equivalente a una muestra analítica por triplicado,
adicionarle la cantidad de analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria)
correspondiente al 100% de este en la muestra.
Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y
preparar el matriz adicionado al menos por triplicado a cada nivel, manteniendo constante
la cantidad de matriz analítico en los tres niveles.
Los matriz adicionados deben ser analizados por un mismo analista bajo las mismas
condiciones, utilizando como referencia, la sustancia empleada en la adición al matriz
analítico.
Como lo indica el método, preparar 3 soluciones estándar al 100% de la concentración
teórica.
Realizar una determinación de cada matriz adicionado, de acuerdo a la siguiente

secuencia :
0 28/05/2010 17 de 33
• Estándar
• Matriz adicionado nivel inferior
• Matriz adicionado 100%
• Matriz adicionado nivel superior
• Hasta terminar los 3 bloques
Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia a
su estándar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
No se conocen los componentes de la muestra
Un analista debe analizar la muestra con el método, para determinar el contenido del
analito.
El mismo analista debe preparar por lo menos 3 muestras adicionadas, por ejemplo
utilizando la mitad de la muestra analítica que originalmente requiere el método y
adicionar el analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) hasta completar lo
que represente el 100% de éste en la muestra.
Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y
preparar la muestra adicionada al menos por triplicado a cada nivel, manteniendo
constante la cantidad de muestra en los tres niveles.
Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas
condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra.
Realizar una determinación de cada preparación de muestra, de acuerdo a la siguiente

secuencia :
• Estándar
• Muestra adicionada nivel inferior
• Muestra adicionada 100%
• Muestra adicionada nivel superior
• Hasta terminar los 3 bloques
Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia a
su estándar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adición

pude ser llevada a cabo en alguna etapa del método. Se recomienda que la adición se
lleve a cabo en las primeras etapas del método, para poder asegurar que las etapas
posteriores, no den lugar a resultados incorrectos.
Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adición
se lleve a cabo antes de extraer; ya que si existiera algún problema con la extracción o
con la filtración, puede dar lugar a resultados incorrectos si el analito se adiciona a la
muestra o matriz analítico hasta antes de diluir.
El intervalo (rango) de la concentración del analito adicionado, depende del propósito del
método y debe incluir la especificación, los limites según una normativa en particular.
0 28/05/2010 18 de 33
En análisis farmacéutico según la guía ICH Q2A se recomienda los rangos según el
propósito de método cuantitativo.
Propósito del Rango recomendado para

Especificación
método estudiar la linealidad
Valoración del En especialidades farmacéuticas 80 -120%
contenido de de 90 – 110% a caducidad
principio activo respecto al valor nominal
En materia prima 98 – 102% o 99
– 101%
Uniformidad 85 -115% 70 -130% (*)
de contenido
Disolución de Siendo Q la especificación
± 20% respecto a la especificación
principio activo establecida .(según USP) Rango= (Q+20%, Q-20%)
Cuantificación Depende de cada impureza Desde el límite de cuantificación o
de Impurezas desde el 50% de la especificación
limite de cada impureza hasta un
120% de dicha especificación
(*) En el caso de que el procedimiento analítico para el análisis del contenido y el de
uniformidad coincidan, puede aprovecharse el mismo rango y evaluar la linealidad una
sola vez entre el 70 – 130%
Reportar la relación cantidad adicionada vs cantidad recuperada o señal obtenida
Utilizando el método de estimación por mínimos cuadrados, calcular el valor de la

pendiente ( b ), la ordenada en el origen ( a ), el coeficiente de determinación ( r2 ), el
intervalo de confianza para la pendiente ( IC(b)), el intervalo de confianza para la
ordenada al origen ( IC(a)), y el coeficiente de variación de regresión (CV y/x ).
Calcular
Promedio aritmética, la desviación estándar (S), el coeficiente de variación (CV) y el
intervalo de confianza para la media poblacional IC ( µ ) del porcentaje de recobro.
Cantidad adicionada vs cantidad recuperada
r2 ≥ 0.95 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), debe incluir la unidad
IC (a), debe incluir el cero
El (CVy/x) del porcentaje de recobro no > 2% si el método es volumétrico o
cromatográfico, no > 3% si el método es químico o espectrofotométrico
0 28/05/2010 19 de 33
Cantidad adicionada vs. señal obtenida
r2 ≥ 0.95 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), no debe incluir el cero
El (CVy/x) del porcentaje de recobro no > 2% si el método es volumétrico o

cromatográfico, no > 3% si el método es químico o espectrofotométrico
Porcentaje de recobro
De acuerdo al anexo 2.
5. Intervalo o Rango
Para cualquier método cuantitativo es necesario determinar el intervalo de

concentraciones del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los cuales el
método puede aplicarse. En el extremo inferior del intervalo de concentración los factores
limitantes son los valores del límite de detección y/o de cuantificación. En el extremo
superior del intervalo de concentración las limitaciones serán impuestas por varios efectos
que dependen del sistema de respuesta del instrumento.
Análisis Tratamiento de datos Comentarios

Fortificar alícuotas de un A partir de los resultados El límite de cuantificación
blanco de muestra a varias calcular el límite de forma efectivamente el
concentraciones del analito cuantificación extremo inferior del rango ó
cercanas al límite de intervalo de trabajo.
detección.
Es aconsejable investigar la varianza a lo largo del intervalo de trabajo. La relación entre

la respuesta del instrumento con la concentración no tiene que ser perfectamente lineal
para que un método sea efectivo, pero la curva debe ser repetible día con día. Observe
que los intervalos de trabajo pueden ser diferentes para distintas matrices de acuerdo al
efecto de las interferencias que produce la matriz.(7)
6. Exactitud :
6.1 Veracidad
La evaluación práctica de la veracidad se fundamenta en la comparación de la media de

los resultados de un método con relación a valores conocidos, es decir, la veracidad se
determina contra un valor de referencia.
0 28/05/2010 20 de 33
Se dispone de dos técnicas básicas: Verificación con respecto a los valores de referencia
de un material caracterizado y comparación con otro método caracterizado.
Para verificar la veracidad utilizando un material de referencia, se determina la media y la

desviación estándar de una serie de réplicas de una prueba y se compara contra el valor
caracterizado del material de referencia. El material de referencia ideal sería un material
certificado de matriz natural, muy semejante a la muestra de interés. Claramente la
disponibilidad de éstos materiales es limitada. Los materiales de referencia para una
validación pueden ser:
a) Preparados por adición de materiales típicos con materiales de referencia con pureza
certificada u otros materiales de pureza y estabilidad adecuada.
b) Materiales típicos bien caracterizados, de estabilidad verificada internamente y
conservados para control de calidad interno.

Efectuar 10 réplicas del Comparar con un contraste Contraste “t” de un valor
material de referencia estadístico adecuado el valor conocido contra una media
usando el método a medio con el valor del material poblacional
validar. de referencia utilizado.
Efectuar 10 réplicas del Comparar con un contraste Contraste “t” de
material de referencia estadístico adecuado los Comparación de dos
usando el método a valores medios del material de medias
validar y un método oficial referencia obtenido por ambos
o validado. métodos
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM
6.2 Porcentaje de Recobro
Debe evaluarse en al menos tres réplicas de tres niveles de concentración, incluidos en

el rango de trabajo del método. (Ver linealidad del método)
7. Precisión.
La precisión es medida mediante la repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia.

REPETIBILIDAD: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis
sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (un mismo analista,
mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un tiempo de tiempo
corto.
PRECISION INTERMEDIA: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de

análisis sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes
analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.
0 28/05/2010 21 de 33
REPRODUCIBILIDAD: Estudia la variabilidad método bajo condiciones operativas

diferentes y en distintos laboratorios.

10 réplicas de un Determinar la desviación Determina la
material de referencia estándar de los resultados repetibilidad.
utilizando mismo
analista, equipo y
laboratorio, en un
período de tiempo corto.
10 réplicas de un Determinar la desviación Determina la precisión
material de referencia, estándar de los resultados intermedia
utilizando diferente
analista, equipo, y
mismo laboratorio y
período.
10 réplicas de un Determinar la desviación Determina la
material de referencia estándar de los resultados reproducibilidad
utilizando diferentes
analistas, equipos y
laboratorio en período de
tiempo prolongado.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM
8. Límite de Detección y Límite de Cuantificación.
Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un

resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.
Según Un resultado "positivo" no es suficiente para que el analista considere detectado

un analito. Se precisa además, conocer el límite de detección en las condiciones del
método; de lo contrario se puede incurrir en un falso positivo: suponer el analito
presente en la muestra cuando de hecho no lo está.
El límite de Cuantificación es un término cuantitativo (menor cantidad medible)

mientras que el límite de detección es cualitativo (menor cantidad detectable).
Numéricamente es mayor el límite de Cuantificación y representa la menor cantidad de

analito que puede analizarse con un % de Coeficiente de Variación y de Recuperación
aceptables. Concentraciones menores pueden detectarse pero no cuantificarse.
Si las concentraciones a determinar son elevadas, se puede sustituir su estudio por la

determinación de la precisión y la exactitud a la concentración más baja que presente el
analito en la práctica.
0 28/05/2010 22 de 33
DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE DETECCION Y CUANTIFICACION.
a- Relación señal-ruido.
Se compara la respuesta del blanco de la muestra (matriz de la muestra conteniendo

todos los excipientes excepto el analito a estudiar) con la respuesta de muestras
preparadas por la adición de pequeñas cantidades de analito al blanco.
Se obtiene, primero el nivel medio de ruido del blanco y se multiplica por 2 ó 3 para el
límite de detección y por 6 ó 10 para el límite de cuantificación. Estos valores se
comparan con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallándose finalmente
la concentración de analito que corresponde al valor de la señal.
b- Estudio de la menor cantidad detectable.
El límite de detección se determina mediante el análisis de muestras con cantidades o

concentraciones conocidas de analito y estableciendo el nivel mínimo en el que este
puede detectarse fiablemente.
Este se emplea en cromatografía en capa fina para hallar el límite de detección de las
impurezas y/o productos de degradación en una materia prima.
Primero se determina experimentalmente la máxima cantidad de materia prima (carga

máxima) que se separa correctamente en las condiciones cromatográficas establecidas
(sin colas, ni distorsión en la mancha). Después se halla experimentalmente la menor
cantidad de impureza o producto de degradación que puede detectarse fiablemente
sin interferencia de la mancha principal.
Para ello, se preparan una serie de soluciones conteniendo una cantidad constante de
materia prima, del orden de la carga máxima y cantidades decrecientes del analito que se
desea estudiar.
El límite de detección se calculará a partir de la dilución en que no se pueda distinguir la

respuesta del analito de la del blanco.
El resultado se expresa en valor absoluto o bien en forma de porcentaje respecto a la

carga máxima de materia prima. Este último es el utilizado habitualmente por las
farmacopeas en los ensayos de pureza por cromatografía en capa fina.
c- Estimación del límite de detección mediante el valor de la ordenada en el

origen expresada en unidades de concentración.
Si la recta del ensayo de linealidad ( y = bx + a ) se ha confeccionado con un rango

de concentraciones bajo, se admite utilizar el término independiente "a", para
estimar, aproximadamente el límite de detección. El límite inferior de la respuesta se
toma como 3 ⎜a⎪ y el límite de detección expresado en las mismas unidades que las
abscisas en la recta de calibración es 3⎪a⎪/ b.
0 28/05/2010 23 de 33
d- Análisis repetido del blanco de la muestra.
Se analizan una serie de blancos de la muestra (n = 10) y se calcula la media y blanco y

la desviación estándar Sblanco de las respuestas obtenidas. A partir de estos
valores existen diferentes expresiones en las que intervienen la sensibilidad
(pendiente de la recta de calibración) y que dan una estimación de los límites de
detección y cuantificación expresados en unidades de concentración.
Las fórmulas a utilizar varían en función de:

- el procedimiento (métodos con corrección de lecturas frente al blanco o métodos sin
corrección).
- el grado de ajuste de la recta de calibración (si el ajuste es defectuoso intervienen las
desviaciones estándares de la pendiente (Sb) y del término independiente (Sa).
- del número de réplicas que se efectúan al analizar la muestra problema (medición
única o n mediciones).
d.1- Con corrección de la lectura frente al blanco (Caso de muchos procedimientos

espectroscópicos por ej. UV-VIS, espectrofluorimetría, etc., en los que la lectura problema
se obtiene por comparación con un blanco.
K • S blanco
CL = b (A)
Donde: CL= límite de detección o cuantificación.

K = constante K = 3 para límite de detección.
K = 10 para límite de cuantificación.
S blanco = Desviación estándar de la respuesta de los n blancos.
b = Pendiente de la recta de calibración.
d.2- No existe corrección de la lectura frente al blanco (Caso de los procedimientos

cromatográficos, CG y HPLC).
y + K S blanco
CL = blanco
b
(B)
CL, K, S blanco, b igual a la ecuación (A)

Y blanco = media de la respuesta de los n blancos.
d.3- Las fórmulas anteriores sólo son válidas si la mayor fuente de error es la desviación
estándar del blanco o sea cuando se cumple que S blanco >> Sa y Sb.
Cuando los test de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibración revelan falta

de ajuste hay que sustituir la desviación estándar del blanco Sblanco en las fórmulas
(A) y (B) por:
0 28/05/2010 24 de 33
2
( S blanco + S 2a + a( b )2 • S b2 ) 1/2
(C)
Esta expresión tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de
sesgo.
Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimación obtenida por (C) será
poco fiable; y al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar
los límites de detección y/o cuantificación por un método que suponga menos trabajo
experimental (relación señal-ruido).
Si en el método analítico se efectúa la medición final por duplicado o triplicado,

disminuye la incertidumbre de la medición y mejora la precisión.
1
Por este motivo, el límite de detección es menor y se introduce el factor
n
(n = número de mediciones) en las ecuaciones (A) y (B).
K • Sblanco 1
CL = b
x
n
(D)
yblanco + K • Sblanco 1
CL = b
x
n
(E)
e- Determinación por extrapolación a concentraciones cero de muestras

conteniendo bajas concentraciones de analito.
Los límites de detección y cuantificación pueden estimarse también por extrapolación

a partir del análisis de muestras conteniendo concentraciones bajas:
Partiendo de la respuesta de cada concentración, se extrapolará gráfica o
matemáticamente la respuesta para concentración 0, la cual se tomará como
estimación de la respuesta de un blanco hipotético ( y blanco ).
Se determinará la desviación estándar de la respuesta a concentración 0 por la

extrapolación gráfica o bien por cálculo matemático, la cual se tomará como estimación
de la desviación estándar de la respuesta de un blanco hipotético. (S blanco).
Conociendo y blanco y S blanco se aplicarán las mismas fórmulas descritas
anteriormente.
Los límites de detección y/o cuantificación obtenidos por cálculos en los literales c,
d y e han de comprobarse posteriormente, mediante el análisis de muestras
conteniendo el analito en concentración igual o próxima a los límites estimados, los
resultados de Porcentaje de Coeficiente de Variación y porcentaje de recuperación
deberán ser coherentes con el tipo de análisis que se realiza y del nivel de concentración
del analito en la matriz.
0 28/05/2010 25 de 33
ANEXO 2: Criterios de precisión y exactitud en función de la concentración de

analito
Concentración de analito vrs precisión.

Proporción
Analito % Unidades CV%
de Analito
100 1 100% 1.3
10 10-1 10% 2.8
1 10-2 1% 2.7
0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va.,
USA (1998).
% de recuperación de Analito a distintas concentraciones

Ingrediente Proporción Recuperación
Unidades
Activo (%) de Analito Promedio (%)
100 1 100% 98-102
10 10-1 10% 98-102
1 10-2 1% 97-103
0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
-
0.001 10 5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va.,
USA (1998).
0 28/05/2010 26 de 33
ANEXO 3: Formulas y Pruebas Estadísticas

−
- Media de los resultados. ( X )
− ∑x
X = i
n
- Desviación estándar de los resultados ( S )

−
S=
∑ ( Xi − X ) 2
n−1
- Coeficiente de variación.
S
Cv = × 100
−
X
Prueba de Fischer.- Se utiliza para determinar si existe diferencia significativa entre

los resultados de los analistas que emplearon el mismo método.
Se determina como sigue:
S1 - Desviación estándar de la condición 1.

S2 - Desviación estándar de la condición 2.
Se calcula:
2
S
F = 2 de forma tal que F ≥ 1
1
S2
El valor critico (F tabulado) debe consultarse en las tablas estadísticas. Para emplear
estas tablas debe hallarse primero el número de grados de libertad, el cual es igual a
n-1, donde n es el número de muestras para un analista individual. Si Fexp < Ftab
(F n1-1/n2-1, P = 0.05) no existe diferencia significativa entre la precisión alcanzada
por los analistas.
Prueba de significación de t (student): para determinar si existe diferencias

significativas entre las medias obtenidas por las 2 condiciones.
Condición 1 Condición 2
Media − −
X 1 X 2
Desviación estándar S 1 S 2
Número de muestras N1 N 2
0 28/05/2010 27 de 33
− −
( X 1 − X 2)
t=
1 1
S +
N1 N 2
2 2
2 = ( N 1 − 1) × S1 + ( N 2 − 1) × S 2
S ( N 1 + N 2) − 2
Si texp < ttab (P = 0.05, GL = N1 + N2 -2 ) no existe diferencia significativa entre las medias
obtenidas por las dos condiciones.
Límites de confianza (95%).-
Este estadígrafo determina el rango en el cual el resultado verdadero estará en el 95%
de los casos y se calcula según:
S
t×
n
Notación.
X= media de los juegos de resultados del estudio de reproducibilidad.
t = t de Student.
S = Desviación estándar del conjunto de valores.
n = número de muestras (el total de los análisis).
−
S
Limite de confianza para el 95 %= X ±t
n
Las fórmulas anteriores se pueden utilizar también con porcentajes de recuperación,

basta sustituir el valor medio por el porcentaje de recuperación R, el valor verdadero m
por 100 y la desviación estándar S por el coeficiente de variación Cv.
100 − R n
t exp =
Cv
Para determinar si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados se

utiliza un test de igualdad de varianzas de los grupos muéstrales del mismo tamaño.
En este ejemplo, se utiliza el test G de Cochran:
2
S
G exp = 2 max 2 2
S1 + S 2 + S 3
0 28/05/2010 28 de 33
Gtab = ( P = 0.05, K = 3, n=3 )
Si Gexp <Gtab las varianzas de las tres concentraciones son equivalentes, o lo que es
lo mismo que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados. En
este caso se calcula la recuperación media y el coeficiente de variación.
Tabla Diseño experimental para el estudio de la linealidad de un método analítico.
x (ug) Y xy x2 y2
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22
x3 y3 x3y3 x32 y32
x3 y3 x3y3 x32 y32
x3 y3 x3y3 x32 y32
x4 y4 x4y4 x42 y42
x4 y4 x4y4 x42 y42
x4 y4 x4y4 x42 y42
∑x ∑y ∑xy ∑x2 ∑y2
− −
x y
Cálculo de b:
∑
x∑ y
∑ xy −
b= n
2 (∑ x )
2
∑ x −
n
Cálculo de a:
a=
∑ y − b∑ x
n
Ecuación: y = bx + a
Coeficiente de correlación r.
El coeficiente de correlación refleja el grado de relación o ligazón entre las variables x
(concentración), y (respuesta). Su valor máximo es 1.
0 28/05/2010 29 de 33
Si r es cercano a la unidad, significa que existe correlación con una probabilidad elevada.
(Existen tablas de r que dan el grado de significación del valor obtenido para el
coeficiente de correlación).
Fórmula para hallar r.
∑ x∑ y
∑ xy −
r= n
⎛ 2 (∑ x) 2 ⎞⎛
∑
2⎞
⎜∑ x − ⎟⎜ ∑ y − ( y )
2
⎟
⎜ n ⎟⎜ n ⎟
⎝ ⎠⎝ ⎠
El cuadrado del coeficiente de correlación se denomina coeficiente de

determinación e indica la proporción de la varianza total de y, que es explicada por el
modelo lineal de regresión.
Cálculo de los factores de respuesta.
x (ug) y f (y/x)
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x4 y4 f4
x4 y4 f4
x4 y4 f4
⎛ −⎞
Media de f: ⎜ ⎟ = ∑f
⎜f⎟ n
⎝ ⎠
−
∑( f i − f ) 2
Desviación Estándar de f: Sf =
n−1
0 28/05/2010 30 de 33
Sf × 100
Coeficiente de variación de f:
−
f
Significación estadística de la varianza de la pendiente b (de la recta de regresión).
La pendiente b se llama también coeficiente de regresión: a mayor pendiente, mayor

sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de concentración del analito).
La varianza de la pendiente Sb2 se utiliza como expresión matemática de la
linealidad: a menor varianza mejor linealidad. Se determina según:
2
2 = S y ,x
Sb
2 − (∑ x )
2
∑x n
Donde S2y, x = varianza del error experimental total.

= varianza residual.
= varianza de regresión de y sobre x.
El valor de S2y, x se obtiene según:
2
2 ∑y − a ∑ y − b∑ xy
S y, x = n−2
Para expresar la linealidad también se utiliza la desviación estándar o error estándar

de la pendiente Sb y la desviación estándar relativa Sb rel (%) cuyas fórmulas son:
2
Sb = Sb
S b × 10 0
S b rel (% ) = b
- Los límites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresión: b ± tSb

donde t es el valor de la distribución de Student para n-2 grados de libertad a la
probabilidad escogida (generalmente P = 0.05).
-Otro test estadístico de b se deduce de la expresión:
0 28/05/2010 31 de 33
b
t exp =
S b
En la tabla de t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad.
Hipótesis nula: b = 0.
Test de proporcionalidad.
El valor de a, intercepción con el eje de ordenadas u ordenada en el origen, indica el error
sistemático del método. En el caso ideal debe ser cero.
La varianza del término independiente se deduce de las fórmulas:
2
2 2 ∑ x2 S y ,x ∑ x2
Sa = Sb × = ×
2 − (∑ x )
n 2 n
∑x n
Siendo S2y, x la varianza del error experimental total.
- La desviación o error estándar del término independiente es:
2
S a = S a
- La desviación estándar relativa del término independiente es:
Sa
S a rel (% ) = a
× 100
A.- Los límites de confianza del término independiente son:

a ± t Sa
siendo t el valor de la distribución de Student para n - 2 grados de libertad a la

probabilidad escogida (generalmente P = 0.05).
Si estos límites incluyen el cero se cumple la condición de proporcionalidad.
B.- La significación estadística de a se puede deducir también de la expresión:
a
t exp =
Sa
0 28/05/2010 32 de 33
En la tabla de t se halla el grado de significación para n - 2 grados de libertad.
Hipótesis nula a = 0
Límites de confianza de un valor de y en la recta de regresión para un valor determinado

de x ( x = xo ).
Para un valor dado de x = xo se obtiene (aplicando la fórmula de la recta de regresión el
valor y. Los límites de confianza se obtienen aplicando uno las siguientes fórmulas:
2
⎛⎜ − − ⎞⎟
Límites de tolerancia = 1 ⎝ x o x⎠
b x o + a ± t S y ,x 1 + + 2
n
∑
⎛⎜ x − − ⎞⎟
⎝ x⎠
2
⎛⎜ − − ⎞⎟
Límite de confianza = 1 ⎝ x o x⎠
b x o + a ± t S y,x + 2
−
n ⎛
∑ ⎜ x − x⎟
⎞
⎝ ⎠
En ambos casos se halla t para n-2 grados de libertad y al nivel de probabilidad

escogido, generalmente P = 0.05.
Los límites de tolerancia son los límites de confianza de los valores individuales de y
en la recta de regresión.
Los límites de confianza son los límites de confianza de los valores medios de y en la
recta de regresión.
Dando a x diferentes valores xo , x1 , x2 , se obtienen los correspondientes límites de

tolerancia o confianza para los respectivos valores de y en la recta de regresión.
0 28/05/2010 33 de 33
BIBLIOGRAFIA DE ANEXOS.
1. Comité de expertos de la OMS en especificaciones para las preparaciones

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