Histoqumica de los Carbohidrats (Kiernan).

Aunque los carbohidratos se aplican a todos los azcares y sus

derivados, algunas sustancias estn disponibles en secciones de
tejidos fijados son aquellos en los que parte de los azucares
forman lpidos, cidos nuclecos y mucosubstancias. Entre
Mucosubstancias, desde un trmino colectivo se encuentran:
polisacridos, glicoprotenas y proteoglicanos que forman parte de
este captulo.
Azucares constituyentes de las mucosustancias.
Las mucosustancias son identificadas histoqumicamente y en
virtud de sus propiedades de los azucares que la constituyen. Los
monosacridos, son las unidades que con mayor frecuencia se
encuentran en polisacridos, glicoprotenas, y proteoglicanos.
La formula estructural de los monocaridos se muestran como
anillos que se encuentran en un plano perpendicular al papel (fig
11.1). Todos los azucares ilustrados existen como 6 eslabones
de anillos de piranosa . El sistema de numeracin es mostrado por
la -D-glucosa. En los -anmeros los azucares de la D-serie. , el
grupo hidroxilo que se encuentra en la posicin C1 se dirige hacia
abajo. La formula de los L-enantimeros se obtienen al prever las
imgenes en un espejo en el plano del anillo. En los -L
azucares, el grupo hidroxilo encontrado en la posicin C1 se dirige
hacia arriba y C6 se encuentra por debajo en lugar de por encima
de C5. Los anmeros difieren slo en la configuracin de la posicin
del carbono C1. Los epimeros difieren en la direccin del grupo
hidroxilo en uno de los tomos de carbono que no sea C1. Por lo
tanto, -D-glucosa y -D-glucosa son anmeros. Galactosa y
Manosa son epimeros de la glucosa, pero no el uno del otro. Otras
estucturas dan una falsa impresin de que los anillos son planos,
pero l simplifica el reconocimiento de unidades de monosacridos y
los o enlaces , y la presencia de azucares L-serie ( como la
fucosa y el acido idurnico) en algunas mucosustancias de
importancia biolgica.
En los carbohidratos complejos, las unidades de monosacridos se
unen por enlaces glicosdicos. Cada una de las unidades o residuo
pueden ser llamados como grupo glicosdico. El tomo del carbn
C1 de un azcar se conecta a travs de un tomo de oxigeno a uno
de los carbonos ( comnmente C3,C4, o C6) de otra azcar. En los
glucsidos el enlace indicado en su forma abreviada tales como -1
4, que muestra a que tomo de carbono se une y que
 configuracin est en C1. En los monosacridos libres o en el
trmino de la cadena con C1 que no participa del enlace
glicosdico, la estructura del anillo (hemiacetal) esta en equilibrio
con la cadena abierta (aldehdo) ismero, como se muestre en la
-D-glucosa.
Clasificacin y composicin de mucosustancias.

Los hidratos de carbono moleculares pueden ser clasificados en

base a su qumica, su comportamiento en determinados test
histoqumicos, o bien su distribucin en la naturaleza. Pears (1985)
present un sistema de clasificacin en que se hizo un intento de
correlacionar la composicin qumica con propiedades
histoqumicas discernibles, pero con el advenimiento de tcnicas
para la demostracin individual de residuos de monosacridos, este
sistema es un poco anticuado. Clasificaciones basadas nicamente
en las propiedades de la tincin son utilizadas en el diagnstico
patolgico, pero conducen a identificaciones que no se
corresponden con saber de entidades qumicas. En efecto, se sabe
que no todas las mucosustancias pueden ser distinguidas a travs
de mtodos histoqumicos. Los diferentes enfoques de las dos
disciplinas han llevado tambin a una gran cantidad de terminologa
confusa.
Polisacridos.
Compuestos enteramente por
Hidratos de carbono (poliglicosidos)

Proteoglicanos.
Largas cadenas laterales de
Mucosustancias(*) polisacridos (glicosaminoglicanos) que
Poseen unidades repetidas de
Disacridos, unido a un ncleo
Proteico relativamente pequeo.

Glicoprotenas
Protenas que contienen
covalentemente cadenas de
oligosacridos.

(*) Compuestos macromoleculares, formados en su totalidad o en parte por

hidratos de carbono.

a) Polisacridos: Un polisacrido consiste en muchas unidades de

monosacridos unidos por enlaces glicosdicos. Los hidratos de carbono
macromoleculares no se unen covalentemente a protenas. Los polisacridos
siguientes son homopolisacridos, compuestos por muchas unidades idnticas
de monosacridos. Las cadenas pueden ser ramificadas, tpicamente cuando
el mismo enlace glicosidico ocurre en toda la molcula, o ramificado cuando
algunas de las unidades estn conectadas a travs de mas de un grupo
hidroxilo.

**Glicgeno: -D-Glc(-14)D-Glc( -14)-. La cadena se ramifica por que

hay algunos -D-Glc(-16)D-Glc- unidos en cada molcula de glicgeno. Este
polisacrido es bastante soluble en agua, y es el mejor preservado por los
fijadores alcohlicos. El nico grupo funcional en el glicgeno es OH.
Adyacentemente los grupos hidroxilos se producen en C2 y C3 en todas las
unidades de monosacridos (como por ejemplo -glucosa), esto se conoce
como formacin de glicol (tambin llamado vicinal diol, vic-glicol o 1-,2-diol) y
se presenta en muchas otras Mucosustancias.

**Almidn: el polisacrido de las plantas posee la misma estructura qumica

que el glicgeno, difieren slo en el tamao, ramificacin y conformacin de
estas molculas. Su forma ramificada es la amilasa, y el tipo de ramificacin,
que es similar al glicgeno es la amilopectina (Pectina: el principal polisacrido
de la lmina media de las paredes celulares de plantas, se compone
principalmente por unidades de cido galactournico).

**Celulosa: -D-Glc(-14)D-Glc( -14)-. Este es el principal componente de

las paredes celulares de las plantas, ausente en el tejido animal, con excepcin
en el exoesqueleto de los tunicados. Se diferencia del glicgeno y el almidn
en ser un en lugar de un poliglucsido. La celulosa es insoluble en
reactivos comnmente utilizados en microtcnicas.

**Quitina: -D-GlcNac(-14)D-GlcNac( -14)-. Este es el principal

componente del exoesqueleto de los insectos, crustceos y varios otros
invertebrados. Tambin se produce en algunos hongos y algas.
Aproximadamente la mitad del peso seco es material del exoesqueleto, con
un balance consistente en gran medida de protenas y sales insolubles de
calcio.

B) Proteoglicanos: Los componentes de los hidratos de carbono que forman

los proteoglicanos son heteropolisacridos, cada uno de largas cadenas
compuestas de unidades repetidas de 2 o mas unidades de monosacridos
diferentes. Las cadenas de polisacridos de los proteoglicanos, considerada
de forma aislada, son a menudo nombradas como glicosaminoglicorunanos o
Glicosaminoglicanos (GaGs). El termino mucopolisacrido fue utilizado
formalmente como sinnimo ya sea para proteoglicano o el componente del
heteropolisacrido. Las unidades repetidas siempre incluye un nitrgeno que
contiene azcar y un cido del azcar. Este ltimo puede ser cido urnico o
un ster-sulfato de una hexosa, que le confiere afinidad catinica al colorante.
Las unidades de repeticin que figuran a continuacin de alguno GAGs
individuales no son completamente constantes: pequeas cantidades de otros
monosacridos esta presentes en la molcula y la distribucin de los grupos
ster-sulfato son un poco variables.
1- Hialuronan (cido Hialurnico): La unidad repetida es:
-D-GlcUa (-13)D-GlcNAc(-14); (-D cido glucornico y
D-aceitlglucosamina). Este GAG existe en estado variable de polimerizacin.
Este polmero de bajo peso molecular es soluble en agua y tiene una baja
viscosidad. Los polmeros altos son ms viscosos y menos fciles de extraer
con agua. Glicol y los grupos carboxilos se presenta en el -D-cido
Glucornico componente de cada unidad repetida.
2- Condroetn 4-Sulfato: (sinnimo Condroetn sulfato A), La unidad repetida
es : -D-GlcUa(-13)D-GalNac-4-OSO.3H(-14).( -D cido glucornico y -
N-acetilgalactosamina-4-Sulfato). Insoluble en todos los reactivos de uso
histolgico general y en glicol, carboxilo, y grupos ster-sulfato.
3- Condroetn 6-Sulfato: ( sinnimo: condroetn sulfato C): La edad repetida
es : -D-GlcUa(-13)D- GalNac-6-OSO.3H(-14).( -D cido glucornico y -
N-acetilgalactosamina-6-Sulfato), Qumica y fsicamente este es similar al
condroetn 4-sulfato, difiriendo solo en la posicin del grupo ster-sulfato.
4- Dermatn Sulfato: (antiguamente Condroetn sulfato C), La unidad repetida
es: -L-ldUA(-13)D-GalNac-4-OSO.3(->4)-.( L cido idurnico y N-
acetilgalactosamina-4-Sulfato), este es otro proteoglicanos sulfatado , difiriendo
del condroetn 4-sulfato solo en la configuracin de la posicin de C5 en el
cido urnico.
5. Queratn Sulfato: La unidad repetida es: -DGal(-14)D-GlcNAc-6-
OSO.3H(-13), (Galactosa y N-acetilgalactosamina-6-Sulfato), el tipo I estas
unido por un enlace N-glicosidico de aspargina en asociacin a un ncleo o
core de protenas del proteoglicano galactosamina. El tipo II est unido desde
serina a galactosamina, y la molcula base de la protena es mayor que la de
tipo I. El queratn sulfato tambin contiene pequeas cantidades de manosa,
mucosa y cido sialico. Estos proteoglicanos estrechamente relacionados son
insolubles en todos los reactivos histolgicos de uso comn. Los grupos ster-
sulfato estan presentes pero las formaciones de glicol estan ausentes en la
porque en la posicin C3, la galactosa participa de un enlace glicosidico.

6. Heparina: La base de la molcula de protena tiene varias cadenas largas

de heteropolisacridos., las principales unidades repetidas son: (scanear)

Todos los enlaces glicosdicos son -14. Las unidades de monosacridos

son varios derivados sulfatados de los cidos L-idurnico y L-glucornico y
N-acetil-D-glucosamina. Pequeas cantidades de D-Galactosa y D-Xilosa estn
presentes. Todos los grupos funcionales orgnicos que se producen en las
mucosustancias estn presentes en la heparina, pero predominantemente en
los grupos ster-sulfato.
La Heparina se produce principalmente en los grnulos citoplasmticos de los
mastocitos, pero es posible que la reduccin de las concentraciones tambin
estan presentes en otras clulas y en el tejido conectivo. La heparina es
utilizada clnicamente como anticoagulante.

7- Heparn Sulfato: Este es un grupo se sustancias que se producen dentro y

en las superficies de las clulas animales. El heparn sulfato ha sido estudiado
principalmente por mtodos qumicos y farmacolgicos .Es un subproducto de
la fabricacin de la heparina de los tejidos animales. Al menos 4 diferentes
tipos de GaGs unidos por nombres. Ellos son similares con la heparina pero
contienen menos Sulfato y mas grupos N-Acetil. El heparn sulfato, que
tambin ha sido llamado como heparitina sulfato y cido heparina
monosulfrico, es producida en la gran mayora de las clulas animales y no
es considerado como un precursor metablico de la heparina. En al menos el
1% del poder del anticoagulante es heparina.
Una molcula de proteoglicanos consiste en molculas de condroetn,
dermatn, queratn o heparn sulfato, que tpicamente poseen un largo de
50-200 nm, unidos a un core (o ncleo) de protenas de unos 300 nm de largo.
Las cadenas de oligosacridos similares a las glicoprotenas (5-15 unidades de
azcar), se adjuntan al core de protenas. En la matriz extracelular (MEC), las
molculas de proteoglicanos de unen a travs de pequeas molculas de
protenas, a las hebras de hialuronan (>2m) de longitud indefinida. La mayor
parte de los enlaces protena-hidratos de carbono corresponden a enlaces
glicosdicos lateral a una cadena de serina, pero tambin a algunos de ellos
se unen a aminocidos bsicos. Proteoglicanos y el hialuronan en su forma
macromolecular tridimensional de mall ocupa espacios entre las fibrillas de
colgeno. La MEC de los tejidos vara en sus proporciones de colgeno,
proteoglicanos y hialuronan, y en abundancia relativa de diferentes
glicosaminoglicanos.
Los Proteoglicanos se preservan qumicamente intactos por todos los fijadores
no oxidantes, aunque puede haber extraccin de algunos heteropolisacridos,
casa uno polmeros mas pequeos de hialuronan.(cido hialurnico). Un
proteoglicanos encontrado en el cerebro de una rata, por ejemplo, se ha
demostrado histoqumicamente despus de la fijacin con formalina-cido
actico o Bouin, pero no despus de la fijacin en soluciones puras de
formaldehdo. El cloruro de cetilpiridinio , ha sido propuesto como fijador
especial para la precipitacin de proteoglicanos, a pesar de que puede
disminuir la tincin por competicin con las coloraciones catinicas. El cloruro
cianrico se combina covalentemente con los grups hidroxilos , tambin ha
sido utilizado como fijador para mucosustancias, aunque se espera que impida
muchas reacciones histoqumicas.

Glicoprotenas.

Estas mucosustancias son unos de los variados polisacridos y

proteoglicanos. La cadenas de oligosacdiso consiste en unidades de 2-12
monosacridos. Los azcares mas comunes en las glicoprotenas son : -
D-galactosa, -D-manosa, y -N-acetilglucosamina, y -
N*acetilgalactosamina, -L-fucosa y cido sialico. Los dos ltimos nombres
siempre ocupan posiciones terminales ( ms lejanas desde las protenas).
En el lado de la cadena ramificada, sin embargo, estos azcares terminales
pueden estas mas cercanos a un core de polipptidos que hacia algunos
residuos del interior de la cadena. Ejemplos de estas glicoprotenas son:

a) Suero Protenas: Estas incluyen a las inmunoglobulinas.

b) Sustancias especficas de los grupos sanguneos: Esto
ocurre en la superficie de los eritrocitos.
c) Productos de secrecin: Ambas glandulas, endocrinas y
exocrinas, secretan glicoprotenas. Algunas de ellas, especialmente las
que se encuentran en el canal digestivo, contienen azcares sulfatadas
y cido sialico. Los Mtodos histoqumicos , no pueden determinar si
tales sustancias son solo protenas o mezclas de ellas.
d) Constituyentes de Glicocalix: Las glicoprotenas forman capas
de celulas por fuera de la superficie del plasmalema de cada clula. El
glicocalix es una parte integral de as membranas celulares.
e) Colgeno: Es inusual que en las unidades de glucosilo se
forman una gran parte de los componete de los hidratos de carbono. La
histoqumica tradicional demuestra que las glicoprotenas se basan la
presecia de grupos carboxlios, hridroxilos y grupos ster-sulfato. Estos
se preservan en la gran mayora de los fijadores, pero las mezclas de
fijadores contienen agentes oxidantes ( que podrian atacar la formacin
de glicol), no deberan ser utilizados. Los componentes de los hidratos
de carbono de los glicolpidos son similares a las de las glicoprotenas, y
dos de los grupos de sustancias pueden ser confundidos uno con el otro
cuando se utilizan cortes congelados. En muchos sitios, especialmente
el mucus que recubre y lubrica superficies epiteliales, varias
glicoprotenas estas presentes.La histoqumica puede identificar y
localizar varios grupos funcionales y algunos residuos de
monosacridos individuales, pero no puede determinar si esto ocurre
molculas iguales o distintas.
 Amiloide.

El amiloide es llamado de esta forma por su parecido al almidn, ambas

sustancias dan una reaccin de color azul con el yodo. Ha sido
considerado en ste captulo por conveniencia, a pesar de que es el
componente predominante de las protenas, Los depsitos acumulativos
de amiloide in varios rganos trae como consecuencia enfermedades
inflamatorias crnicas y en enfermedades cerebrales como el alzheimers.
Una rara enfermedad conocida como amiloidosis primaria se encuentra de
vez en cuando por los patlogos.
Estos depsitos consisten en protenas fibrilares y otras, incluyendo
bsicamente componentes de la membrana como colgenos tipo 4 y
perlecan, y un proteoglicano como el heparn sulfato. Las protenas estn
-plegadas en la conformacin de hoja y estn organizadas como fibrillas
de 7-13 nm de dimetro, que se producen en paquetes entrelazados. Uno
de los principales componentes de las protenas es el amiloide P, el cual
es diferente de cada uno de los ms de 20 tipos de amiloidosis.
Las tcnicas histoqumicas para hidratos de carbono caen en tres
categoras: aquellos en que los colorantes y reactivos estn relacionados
cuando son utilizados, mtodos qumicos y mtodos relacionados con el
uso de lectinas. Todos los tipos de mtodos pueden ser utilizados en
conjunto con el bloqueo qumico de procedimientos de grupos de
reactivos y con degradacin enzimtica de mucosustancias especficas.
Varias tcnicas existen que no han sido descritas en este captulo.
Tambin es posible demostrar muchas mucosustancias a travs de
mtodos inmunohistoqumicos, que pueden detectar proteoglicanos y
glicoprotenas

11.3 Mtodos histoqumiocs utilizados en coloraciones.

Cuatro tcnicas sern discutidas: el uso de azul de alcin, la observacin

de metacromcia, tincin con coloraciones catinicas en conjunto con
sales de metales, y el uso de colorantes aninicos con molculas grandes.

a) Azul de Alcin: este colorante se une a los grupos carboxilos y sulfato-

ster a un Ph de 2.5, pero solo esta ltima a pH 1.0. Con la solucin de cido
mas fuerte, los grupos carboxilos no estn ionizados y por lo tanto no puede
atraer electroestticamente los cationes del colorante. Por lo tanto, es posible
identificar con algn grado de certeza que la acidez total de las
mucosustancias se debe a su grupo carboxilo, pero no es posible saber si
sustancia tie a un nivel de pH, por lo tanto se debe su acidez solo a los
grupos sulfatos o bien ambos sulfato o carboxilos. Sin embargo si una seccin
se somete antes de la tincin a un adecuado tratamiento en caliente, el
metanol acidificado, los grupos Ester-sulfato y probablemente la gran mayora
de los cidos sialicos podrn ser removidos, asimismo los grupos carboxilos se
encontrarn esterificados
(** Proceso mediante el cual se sintetiza un ster(*)) (* Ester: compuesto
derivado formalmente de la reaccin qumica entre un grupo carboxlico y
un alcohol).
Nada va a ser teido por el Azul de Alcin. La siguiente seccin puede objeto
de un procedimiento de saponificacin, lo que generar una hidrlisis de los
esteres de metilo y la restauracin de los grupos carboxilos. Estos recuperarn
su coloracin con azul de Alcin a un pH de 2.5. Los esteres de sulfato, sin
embargo, se han eliminado irreversiblemente y ya no sern detectables. Por lo
tanto, siempre que al menos 6 secciones del mismo tejido est disponible, es
posible determinar su afinidad con el azul de Alcin un pH 1.0 y 2.5 es
solamente a los esteres de sulfato o a ambas grupos sulfato Ester y grupos
carboxilos coexistiendo en el mismo sitio.
Es factible para estudiar mucosustancias cidas por tincin con coloraciones
catinicas que no sea con azul de Alcin. La principal razn para utilizar azul
de Alcin en histoqumica de carbohidratos es el hecho de que esta coloracin
por lo general no tie ncleos o depsitos de citoplasma de secciones de
RNA, aunque se sabe que es capaz de unirse con los cidos nucleicos en
solucin.
Estudios con modelos moleculares, han revelado que cuatro grupos tetrametil
Isothiouronium adjuntos a un anillo de ftalociacina del azul de Alcin 8G, puede
hacer que la molcula de colorante en forma muy grande entre las bobinas de
la hlice de ADN. La atraccin electroesttica entre los grupos fosfato y el
auxocromo est debilitado por la distancia y no puede haber una corta
distancia de interaccin (fuerzas de Van der Waals) entre los anillos
aromticos del colorante y los anillos de purinas y pirimidinas del DNA. El
acceso de catines grandes del azul de Alcin a los grupos fosfatos de los
cidos nucleicos en el tejido fijado se ve dificultada por la presencia de la
asociacin a nucleoprotenas. El impedimento estrico tambin puede explicar
el fracaso del azul de alcin para teir ARN. En algunas ocasiones,
especialmente en tejidos de animales muy jvenes, los ncleos se tien con
azul de alcin a Ph2.5. Esta coloracin puede deberse en parte a
mucosustancias cidas presentes en cromosomas de clulas en divisin. Otra
ventaja del azul de alcin sobre la mayora de los colorantes catinicos la
solubilizacin de los grupos tetrametilisothiouronium se pierde, teniendo como
resultado la hidrlisis catalizada por una base, cuando las secciones teidas
son lavada con agua destilada. El pigmento resultante ( ftalocianina de cobre),
no es extraido por el agua, alcoholes, cidos, u otras soluciones de colorantes
utilizadas para la contratincin. El procedimiento de PAS es frecuentemente
aplicado en tejidos ya teidos con azul de Alcin.
Soluciones Requeridas:

Algunos lotes de Azul de Alcian son insatisfactorios cuando se encuentra

nuevo. El uso de colorantes certificados BSC es muy recomendado.
Algunos lotes inicialmente satisfactorios se deterioran con el
almacenamiento, incluso en forma de polvo seco.

1) Azul de Alcian, Ph 1.0:

- Alcian Blue 8G ( CI 74240) . 1.0g
- Acido Clorhdrico 0.1 M .. 100 ml

La estabilidad de esta coloracin es variable. A veces todo el material

coloreado precipita despus de 2 a 3 semanas. Otros lotes son estables por
mas de 1 ao. Filtrar antes de utilizar.

2) Azul de Alcian, Ph 2.5 :

- Alcian Blue 8G ( CI 74240) . 1.0g
- Agua 97 ml
- Acido Actico Glacial 3.0 ml

Toma alrededor de un hora disolver (agitador magntico). Filtre en una

botella limpia, Se mantiene por varios aos pero eventualmente se
descompone y precipita. Si el almacenamiento de la solucin necesita
filtrado, probablemente se ha deteriorado lo suficiente, por lo cual es
necesario reemplazarla.

Procedimento:
1- Desparafinar e hidratar las secciones.
2- Teir en cualquiera de las soluciones A o B por 30 min.
3- Enjuague en HCl 0.1 M o en Acido Actico al 3% (el solvente de
la coloracin), luego lavar con agua directamente del grifo por 3 min.
4- **Opcional: Aplicar contraste rosado o rojo si se desea.
5- Deshidrate en concentracin de alcoholes. El azul de Alcian no es
removido por el alcohol, pero el contraste puede ser diferenciado.
6- Limpiar con Xilol y montar.

Resultados:
Todas las mucosustancias Acidas son teidas a un Ph 2.5, solo las
mucosustancias sulfatadas son teidas a un Ph 1.0.

Notas:
 1) Una colorancon marcada con la variante Azul de Alcian-Piridina
es mas efectiva que el mtodo azul de Alcian 8 G.
2) Las mucosustancias con grupos carboxilos o sulfato-ester se
pueden distinguir si el control de las secciones han sido metiladas y
saponificadas. Neuroaminidasas y leves hidrlisis acidas pueden ser
utilizadas para identificar glicoprotenas debido a su acidez por
presencia de acido sialico.
3) Colorantes Cationicos rojos ordinarios como la safranina, puede
ser utilizado en conjunto con el azul de Alcian. Los efectos de la tincin
diferencial han sido descritos en estructuras que contienen
carbohidratos tales como los grnulos de los mastocitos.
4) El Azul de Alcian a sido tambin utilizado en mesclas con sales
inorgnicas (usualmente clorhidrato de magnesio) con diferentes
fuerzas inicas. Los cationes de la sal compiten con los del colorante
para los sitios de unin en el tejido. La coloracin es utilizada a un alto
Ph (5-6) para que los resultados no sean tan complicados por ionizacin
incompleta de los grupos carboxilos. Los cidos altamente disociados
(OSO en este caso) puede obligar a la tincin en presencia de altas
concentraciones de sal, mientras que el acido mas dbil (COO) no
puede. La afirmacin constituye la base de la Concentracin de
Electrolitos Crtica (CEC), con la que cada mucosustancia acida se le
puede asignar una concentracin de MgCl2 por encima del cual no se
puede teir con azul de Alcian. Esta interpretacin qumica de los
efectos del CEC ha sido cuestionada (Horobin y Goldestein 1974).
Horobin sugiere que esa coloracin al aumentar la fuerza inica estan
obligados por sustancias que aumentan la porosidad en lugar de
aumentar la acidez. Soluciones de azul de Alcian 8G con MgCl2 a Ph
5-6 son estables solo por un par de horas. La variante Azul de Alcian-
Piridina es mas estable y funciona mejor en mtodos CEC.

b) Metacromcia: Cuando las coloraciones catinicas imparte su propio color

a un objeto, se dice que la tincin es ortocromtica. En algunas circunstancias
el lmite de iones en un colorante tienen una alterada longitud de onda de
absorcin, de modo que el color mostrado del objeto teido es diferente de la
coloracin. Este fenmeno es conocido como Metacromaciay las sustancia
que tien metacromticamente son denominados Cromtropos. En la mayora
de los casos el color metacromtico de la coloracin es mayor que la longitud
de onda del colorante ortocromtico. Tinciones Azules como la thionina y el
Azul de Toluidina tien materiales cromotropicos en tonos rojos y purpuras. Los
colores rojo y purpura producidos por esas tinciones ha sido denominados
como y - metacromasia, respectivamente, pero esta distincin es
probablemente de menor importancia. Solo la -metacromasia posee
importancia en histoqumica de muscosustancia. El cambio de color es debido
al cambio de (un cambio hipsocromico) en la absorcin del espectro de la
coloracin y asociado a una reduccin en la intensidad del color.

Los efectos metacromticos son producidos cuando los iones coloreados de la

tincin se presentan en las proximidades de uno y el otro. Esto ocurre cuando
radicales ionicos del sustrato estn juntos, como en algunos proteoglicanos. El
complejo colorante-sustrato de la tincin metacromtica se muestra en la fig
11.3

Las molculas de Agua interpuestas entre los colorantes inicos apilados, se

cree que necesariamente modifican la distribucin de los electrones en el
sistema de cromforos de tal manera que reduce la en la que la luz aborbida
es mxima. La coloracin con efectos metacromticos puede ser obtenida con
tiazinas, oxazinas, xantenos y azinas. Estos son molculas planas capaces
de apilarse muy cerca fig 11.3 y pueden ser formulados con la posibilidad de
cambiar los grupos auxocromicos en cada lado de los sistemas de anillos
fusionados. Cuando los Auxocromos son ms voluminosos que el grupo
N(CH3)3, la tincin metacromtica no puede ocurrir, probablemente por que
no hay espacio para la interposicin para las molculas de agua. El agua ligada
se ve obligada a resistir la extraccin por agentes deshidratados, de hecho, es
generalmente aceptado que la metacromacia debe persistir deshidratada, las
preparaciones aclaradas si es que tiene alguna importancia en relacin a las
macromolculas de carbohidratos.
Otra causa de la metacromacia puede ser la formacin de dmeros por las
molculas de la coloracin en la solucin y la posterior colocacin de estos
dmeros en los sitios anicnicos del tejido. Esto no parece un mecanismo muy
probable, sin embargo, debido a la metacromacia de la solucin colorante se
genera una pantalla nica cuando se concentran, pero la tincin histolgica
metacromtica es fcilmente obtenida de soluciones muy diluidas.
Las mucosustancias cidas no son las nicas fuentes de metacromacia
encontrada en el tejido animal. Los cidos nucleicos son cromtropos en
algunas ocasiones, aunque su metacromacia revierte la ortocromacia despus
de la deshidratacin. A pesar de la baja especificidad histoqumica de la tincin
metacromtica con colorantes catinicos, el mtodo es til para estudiar la
morfologa de estructuras que se sabe que contienen glicoprotenas
sulfatadas ( alguno tipos de mucus), heparina (grnulos de los mastocitos) y
proteoglicanos en la matriz intracelular del cartlago y en algunos otros tejidos
conectivos.

Soluciones Requeridas.
 A) 1.Solucin de Azul de toluidina ( CI 52040) 0.05-0.25%
2. Azure A ( CI52005) o tionina (52000) al 1% en solucin Acuosa de Acido
Actico.
Esta solucin se puede mantener por varios aos, pero este pierde la
potencia con el uso repetido. Filtrar ante de cada utilizacin.

Procedimiento:

1. Desparafinar e hidratar las secciones de parafina.

2. Teir por 1-5 minutos ( ver la nota 1)
3. Lavar en agua
4. Deshidratar en alcohol al 70%, 90% y en dos cambios de etanol
absoluto ( ver la nota 2)
5. Limpiar en Xilol y montar.

Resultados:

- Coloracin Ortocromtica ( ncleo, citoplasma de alguanas

clulas u los cuerpos de Nissl de las neuronas): Azul
- Coloracin Metacromtica: Rojo.

Notas:

1. Si se colorea excesivamente, adicionar al azul de toluidina mas

acido actico ( tinciones de soluciones envejecidas pierden la acidez
con el almacenamiento). El Ph de la solucin puede ser
aproximadamente de 4.0. U n Ph mas bajo puede dar una coloracin
ortocromtica dbil.
2. La coloracin es diferenciada en etanol de 70%. Las secciones
deben ser azul plida antes de ser limpiadas. Si la coloracin es
inicialmente dbil, tomar las cintas directamente del agua al primero de
los tres cambio de alcohol al 100%. Alternativamente, manchar las
seeciones despus del lavado y deshidratacin en dos cambios ( cada
3-5 minutos) en N-butanol.

11.3.3 Mtodo de coloracin de Aluminio Bsico segn Heath.

Una dilucin (aproximadamente 10- M) de una solucin catinica de sulfato

de aluminio a la 0.1-0.5 M da una tincin selectiva de estructuras que
contienen mucosustancias sulfatadas. Heath (1962), investig este
fenmeno a fondo. Los colorantes afectivos resultaron ser los N-metil azinas
y tiazinas incluyendo el rojo neutro y el azul de toluidina. Las coloraciones
con largas molculas incluyendo los triarilmetanos, dan una coloracin
especfica para mucosustancias sulfatadas, pero el color se pierde
rpidamente con e lavado y la deshidratacin. Heath tambin encontr el
mismo resultado que puede ser obtenido por el tratamiento de las secciones
con sal de aluminio antes de la tincin, y ese aluminio puede ser
reemplazado por otros metales forman fcilmente compuestos por
coordinacin. La especificidad por los esteres sulfatos se confirm por
determinacin que la coloracin puede prevenirse por metilacin del tejido, y
no se restaura por saponificacin. Los grupos cidos fuertes artificialmente
introducidos en los tejidos (por sulfatacin de hidroxilos u oxidacin de
cistina) tambin se tieron por combinaciones de la coloracin de aluminio
bsico.

Solucin Requerida.

A) Solucin de la tincin de Aluimnio:

- Rojo Neutro ( CI 50040) o Azul de Toluidina ( CI 52040): 0.1g.
- Agua 100ml
- Sulfato de Aluminio (Al2(SO4)3.18H2o): 5.0g.

Hervir, dejar enfriar, y filtrar para eliminar el material insoluble, luego

adicionar (Al2(SO4)318H2o) acuoso al 5%, para hacer 300ml.

B) Etanol al 70% , para la diferenciacin de las secciones teidas.

Procedimiento:

1. Desparafinar e hidratar las secciones. Recuerde remover los

depsitos de mercurio, si es necesario.
2. Teir por 5-30 minutos
3. Lavar en agua.
4. Diferenciar en etanol al 70% por 20-30 segundos, o hasta que el
fondo ( nucleo, citoplasma, colgeno) este coloreado
5. Si desea, aplicar un contraste adecuado, tal como eosina o Fast
Green FCF
6. Completar la deshidratacin, en 95% y 2 cambios de alcohol de
100%, limpiar con Xilol y cubrir , utilizando medio de montaje.

Resultados:

- Stios de mucosustancias sulfatadas ( mastocitos , matriz del

catlago, clulas caliciformes, etc) rojo con el rojo neutro, o rojo a
purpura ( metacromasia) con azul de toluidina.
Nota:

- Heath (1962) prob 57 coloraciones utilizando este mtodo y es

fuertemente recomendado el denominado Fast red Nuclear.
Probablemente esta coloracin es realmente un rojo neutro. La
coloracin de antraquinona es usualmente conocida como fast red
nuclear (CI 60760), no es adecuadamente, sin embargo, debido a que
no es un colorante catinico y el complejo de aluminio tie el ncleo. La
confusin sobre la identidad de una adecuada coloracin puede explicar
la falta de popularidad del mtodo de Heath sea simple y seguro, que
utiliza reactivos baratos y que merece ser utilizado extensamente.

11.3.4 Mtodos de Coloracin para Glicgeno y Amiloide.

Las coloraciones aninicas existen en solucin como largas

molculas o agregados de molculas son utilizadas para teir
colgeno, como fue explicado en el capitulo 5 y 7. Algunas de estas
coloraciones pueden ser tambin utilizadas para la demostracin de
polisacridos. Los polisacridos neutros como el glicgenono posee
grupos cargados, asi que se vinculan y retienen la coloracin
necesariamente por mecanismos no inicos. La clsica tincin de
este tipo de glicgeno es la Tecnica de Bests Carmin, en donde la
coloracin se disuelve una mescla de agua y alcohol. La formula
estructural del carmn, muestra una gran molcula con numerosos
sustituyentes hidroflicos (carboxlicos, fenlicos, hidroxlicos,