AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS INTRODUCCION Los Estafilococos pertenecen a Familia Micricococcaceae y son organismos

redondos u ovales, agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados y Gampositivos en los cutivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forunculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, solo dos tienen importancia medica. Solo la especie patgena S. aureus produce una enzima llamada coagulasa. MARCO TEORICO Este gnero Estafilococos pertenece a la familia Staphylococacceae, orden Bacillales, clase Bacilli, Phylum Firmicutes. Dentro del gnero Staphylococcus hay 55 especies y subespecies, siendo las ms importantes desde el punto de vista clnico las siguientes: - Staphylococcus aureus subsp. aureus - Staphylococcus epidermidis, y - Staphylococcus saprophyticus subsp. Saprophyticus El microorganismo ms importante por su patogenicidad es Staphylococcus aureus, que se caracteriza por poseer una enzima que coagula el plasma: la coagulasa. Esta prueba permite distinguir a S. aureus del resto de especies de estafilococos que aparecen clnicamente, que no poseen dicho enzima. Los estafilococos de inters en patologa humana que no pertenecen a ninguna de las especies anteriores se informan en el laboratorio como estafilococos coagulasa negativos (SCN) y aunque son colonizadores habituales del ser humano no producen enfermedad tan importante como los anteriores. Patgenos comunes S. haemolyticus S. lugdunensis Patgenos infrecuentes S. capitis S. saccharolyticus S. hominis S. warneri S. auricularis S. cohnii Algunas especies de gneros diferentes, anteriormente relacionados taxonmicamente, como Micrococcus luteus o Kocuria rosea, que raramente producen infecciones en humanos, tienen caractersticas fenotpicas muy similares desde el punto de vista morfolgico y bioqumico a los estafilococos, por lo que conviene saber diferenciar ambas especies de las del gnero Staphylococcus.

Caractersticas microscpicas y de tincin . Las bacterias pertenecientes a esta especie son cocos, con forma casi esfrica. Forman masas arracimadas, vindose como bacterias Gram positivas. No tienen flagelos, no forman esporas y excepcionalmente pueden tener cpsula. En los cultivos viejos los estafilococos pueden aparecer como bacterias Gram negativas. Caractersticas de cultivo . Son poco exigentes en sus necesidades; crecen bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Son aerobios y anaerobios facultativos, con una temperatura ptima de crecimiento entre 30-37C. Una particularidad de los miembros de este gnero es que crecen en medios con una elevada concentracin de ClNa que no soportan el resto de los microorganismos (son bacterias halfilas). Esto permite la creacin de medios de cultivo casi especficos para los estafilococos. Las colonias son visibles fcilmente, sobre todo en agar sangre, con forma redonda y aplanada, bordes netos, superficie lisa y brillante, consistencia variable y en algunas ocasiones, hemolticas. Algunas cepas pueden producir un pigmento carotenoide que les da una coloracin amarillenta (S. aureus). La produccin de este pigmento es mucho ms evidente en agar chocolate o a temperatura ambiente. En caso de partir de una muestra con flora polimicrobiana, ser conveniente utilizar medios diferenciales o inhibidores que nos permitan evitar el crecimiento de aquellos microorganismos no deseados, o visualizar mejor las colonias de S. aureus cuando stas aparezcan en el medio.

Entre los medios especficos para su recuperacin tenemos el medio de Chapman, que posee manitol y una alta concentracin de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH cido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado. El medio de Baird-Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros grmenes Gram positivos, presentndose las colonias de S. aureus negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un halo brillante de 2 a 5 mm de dimetro. El agar sangre con inhibidores (Acido Nalidxico) tambin se utiliza para la recuperacin de este microorganismo, apareciendo las colonias de la misma manera que lo hacen en agar sangre. En C.L.E.D. las colonias de S. aureus aparecen con una coloracin amarillenta no debida a la pigmentacin, sino a la fermentacin de la lactosa que lleva incorporada el medio y al cambio de color del indicador. El agar DNasa contiene DNA, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en bacterias. S. aureus producir una lisis del DNA presente en la placa si posee este enzima, con el consiguiente aclaramiento del medio. Pruebas bioqumicas para identificacin del gnero Staphylococcus Adems de la tincin de Gram, que debe mostrar un frotis con cocos Gram positivos, arracimados, existen otras pruebas que nos van a permitir identificar correctamente a los miembros del gnero Staphylococcus. La distincin fundamental debemos hacerla con aquellas bacterias que muestren unas caractersticas morfolgicas y de tincin semejantes, como son Micrococcus, Kocuria, Streptococcus y Enterococcus.

Las dos pruebas ms importantes para poder discernir entre los gneros aludidos anteriormente son:

Catalasa: La prueba de la catalasa se utiliza para diferenciar microorganismos procedentes de cultivos en los que, al hacer una tincin de Gram, se observan cocos Gram positivos. La prueba de la catalasa es positiva para los gneros Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria y negativa para Streptococcus y Enterococcus, que morfolgica y tintorialmente pueden aparecer de forma similar. Lisostafina: La lisostafina es un enzima que rompe la pared de Staphylococcus y no tiene accin sobre Micrococcus / Kocuria; por esta razn se utiliza para diferenciar estos gneros. En presencia de lisostafina, una suspensin (turbia) de estafilococos acabar lisndose, y por lo tanto perder esa turbidez inicial. La lisostafina, al no ejercer ningn efecto sobre Micrococcus / Kocuria; mantendr la misma turbidez que originalmente tena la suspensin. Otras pruebas que nos pueden ayudar a diferenciar con precisin entre ambos gneros se muestran en la siguiente tabla: Staphylococcus Micrococcus / Kocuria Fermentacin de glucosa (*) + Lisostafina (*) S R Lisozima R S Oxidasa modificada - + Sensibilidad a Nitrofurantona (*) S R Sensibilidad a Bacitracina (*) R S Crecimiento anaerobio - + Diferenciacin de especies del gnero Staphylococcus Enfermedades producidas por los estafilococos Los estafilococos son parte de la flora bacteriana normal de piel, mucosas y tracto respiratorio superior. Sin embargo en determinadas ocasiones son capaces de lesionar gravemente al husped dando lugar a diversos cuadros infecciosos, entre los cuales destacan: - Absceso cutneo: foco localizado de infeccin en la piel, - Sndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ), - Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco drmico, - Endocarditis: infeccin de vlvulas cardiacas, - Osteomielitis: infeccin del hueso, - Neumona: 2 a gripe o a bacteriemia, - Infecciones urinarias: ms frecuentes en mujeres, - Conjuntivitis: infeccin de la conjuntiva, y - Sndrome del shock txico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes. Las toxinas estafiloccicas responsables de la mayor parte de los efectos perjudiciales de estos grmenes sobre el husped son: - Hemolisinas y leucocidina (actan sobre clulas sanguneas) - Enterotoxinas (responsables de las toxiinfecciones alimentarias) - Exfoliatina (responsable del sndrome de piel escaldada) - Exotoxinas pirgenas (productoras de hipertermia)

- Enzimas estafiloccicas: Coagulasa, hialuronidasa y estafiloquinasa. La inmunidad que dejan las infecciones estafiloccicas es generalmente escasa y poco duradera. Susceptibilidad antimicrobiana de los estafilococos En general, los estafilococos son microorganismos bastante sensibles a la mayora de los antimicrobianos tradicionales. Sin embargo la aparicin de resistencia ante un antibitico parece extenderse a todos los dems, resultando algunas cepas resistentes a la mayora de los antimicrobianos utilizados. La presencia de un enzima -lactamasa (codificada y trasmitida mediante plsmidos), condiciona la resistencia de estos microorganismos a todos los antibiticos beta lactmicos (penicilina y derivados). La aparicin de penicilinas que resistan la accin de las beta lactamasas, como oxacilina o meticilina, pareci solucionar el grave problema que representaba la inutilidad teraputica de la penicilina G. En la actualidad se utilizan sustancias no antibiticas que se unen irreversiblemente a las betalactamasas impidiendo su accin posterior. Son el cido clavulnico y el sulbactam. En estos ltimos aos ha aparecido en Espaa un aumento de resistencia de los estafilococos a la meticilina, considerndose un grave problema a nivel hospitalario. Estas cepas se denominan MRSA (Staphylococcus aureus meticilin resistentes). Antibiticos tradicionales tales como vancomicina o lincomicina siguen siendo buenas opciones para el tratamiento de las infecciones producidas por estos microorganismos. Sin embargo nuevas molculas como roxitromicina o teicoplanina aparecen para aliviar la presin que sufren los hospitales ante este aumento de resistencias a los antibiticos comnmente utilizados. El siguiente cuadro resume la susceptibilidad actual de S. aureus a los antimicrobianos ms importantes: Resistencia <10% Oxacilina Clindamicina Vancomicina Imipenem Ciprofloxacino Gentamicina Amikacina Cloranfenicol Resistencia variable Eritromicina Tetraciclina Cefalosporinas Meticilina Resistencia > 90% Penicilina G Ampicilina Aztreonam

CUESTIONARIO: 1. Que factores condicionan la patogenicidad de Staphylococcus aureus.

Contiene varias caractersticas en sus factores de virulencia. En su estructura se encuentran los cidos teicoicos y lipoteicoico, y lospptidoglicanos. Los cidos le sirven para adherirse a superficies corporales junto con las especies de estafilococo que tienen cpsula, y en conjunto los cidos teicoicos y el pptidoglicano tienen la caracterstica que activan el sistema inmune del complemento y sirven adems de evasores de la fagocitosis. Entre sus factores de virulencia que le sirven para la invasin estn: 2. La presencia de catalasa. La presencia de coagulasa en el caso del S. aureus (patognomnico). La fermentacin del azcar Manitol especfico como la coagulasa del estafilococo aureus (el ms importante). Presencia de B lactamasa, que rompe el anillo b lactmico de los antibiticos con esta estructura Que caractersticas fisiolgicas identifican a Staphylococcus aureus. Al gram se evidencia como una coccea gram positiva de 1um dispuesta en racimos, aunque tambin se le puede evidenciar en cadenas cortas o diplococos. Es inmvil y no forma esporas. Es anaerobio facultativo y crece bien en agar sangre a 37C. Es habitual encontrar una colonia mediana, a veces Bhemoltica, de bordes definidos, blanca o en ocasiones dorada, conocindose tambin como el Staphylococcus dorado. El hombre es portador asintomtico entre un 20 y un 40% de los adultos sanos y forma parte de la flora normal de muchos sitios del organismo como piel y nasofaringe y tracto gastrointestinal, causando diversas manifestaciones clnicas.

3.

Mencione de que cuadros infecciosos son causantes las especies de Staphylococcus. Absceso cutneo: foco localizado de infeccin en la piel, - Sndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ), - Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco drmico, - Endocarditis: infeccin de vlvulas cardiacas, - Osteomielitis: infeccin del hueso, - Neumona: 2 a gripe o a bacteriemia, - Infecciones urinarias: ms frecuentes en mujeres, - Conjuntivitis: infeccin de la conjuntiva, y - Sndrome del shock txico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes. Cul es la composicin del Medio hipertnico de Chapman. El medio de Chapman, posee manitol y una alta concentracin de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH cido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado.

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Volumen III de la segunda edicin del Manual Bergey de Bacteriologa Sistemtica, en la seccin de "Bacterias Gram positivas con bajo porcentaje de contenido en G+C" 1989, USA.

Katia Abarca V., Patricia Garca. y Pablo Vial C. Microbiologa Clnica. Ediciones Universidad Catlica de Chile, Santiago de Chile Chile, 2001. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STREPTOCOCCUS INTRODUCCION El genero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo y otros son saprofitos. Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en base a ala hemolisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los globulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente daados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxigeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la diferenciacin de las especies de Streptococcus. MARCO TEORICO El gnero Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos grampositivos pertenecientes al filo firmicutes y al grupo de las bacterias cido lcticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada divisin celular ocurre a lo largo de un eje. De all que su nombre, del Griego streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena. Los Streptococci son oxidasa y catalasa negativos. Las especies de estreptococus que producen enfermedades son: Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e imptigo. Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer. Neumococo: Streptococcus pneumoniae, es la principal causa de neumona adquirida en la comunidad. Streptococcus viridans, es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales. Streptococcus mutans, causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de estreptococos viridans.

Algunas especies de los grupos C y G tienen en su pared la protena G, que, por su capacidad de unin a anticuerpos, tiene importantes aplicaciones en biotecnologa. Caractersticas La mayora de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos crecen nicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono (crecimiento capnoflico). Sus exigencias nutricionales

son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos produciendo cido lctico y tambin son catalasa negativos a diferencia de los estafilococos.

Clasificacin Vase tambin: Sistema de Lancefield. La diferenciacin de las especies que componen este gnero es complicada debido a que utilizan tres sistemas diferentes: Propiedades serolgicas (grupos de Lancefield). Grupos de la A a la W Hemlisis completa (hemlisis beta *+) Hemlisis incompleta (hemlisis alfa *+) Ausencia de hemlisis (hemlisis gamma *+) Pruebas bioqumicas Patrones hemolticos:

Propiedades bioqumicas

Los grupos de Lancefield (creados por Rebeca Lancefield en 1933) se basa en la identificacin de antgenos especficos de grupo la mayora de los cuales son carbohidratos de pared celular. Algunos pueden identificarse con pruebas inmunolgicas instantaneas, por ejemplo, en la identificacin de Streptococcus pyogenes para iniciar el tratamiento antibitico. Desgraciadamente muchos estreptococos -hemolticos y no hemolticos carece de los antgenos de pared celular y no son especficos. Patognesis A pesar de las enfermedades infecciosas que causan algunas especies de estreptococo, otras no son patgenas. Los estreptococos forman parte de la flora saprfita de la boca, piel, intestino y el tracto respiratorio superior de los humanos. Por regla general, las especies individuales de los estreptococos se clasifican basados en sus propiedades hemolticas. Estreptococo Alfa-Hemoltico Neumococo S. pneumoniae, causante de neumona bacteriana, otitis media y meningitis.

Son diplococos gram positivos. Al microscopio ptico se ven como cocaceas gram positivas de aspecto lanceolado (forma de grano de arroz). En cultivo en agar sangre de cordero se observan a la lupa de luz como colonias umbilicadas (elevacin central) Viridans y Otros S. mutans, un contribuyente para caries dental.

S. viridans, causa de endocarditis y Abscesos dentales. S. thermophilus, usado en la manufactura de algunos quesos y yogurts. S. constellatus, patgeno humano ocasional, notable como colonias con crecimiento en Agar Sangre con fuerte olor a caramelo.

Estreptococos Beta-Hemolticos Grupo A S. pyogenes (tambin conocido como GAS) es el agente causal en las infecciones estreptoccicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis estreptoccica (amigdalitis), fiebre reumtica aguda, fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante. Si la amigdalitis no es tratada, puede desarrollarse fiebre reumtica, una enfermedad que afecta las articulaciones y lasvlvulas cardiacas. Otras especies de Streptococcus tambin pueden poseer el antgeno del Grupo A, pero las infecciones en humanos por cepas no-S. pyogenes GAS (algunas cepas S. dysgalactiae subsp. equisimilis y del Grupo S. anginosus) parecen no ser comunes. La infeccin por Estreptococos Grupo A es diagnosticada generalmente con una Prueba Rpida de Estreptococos o mediante Cultivo. El mtodo ms comnmente empleado en los laboratorios clnicos para la identificacin presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemoltico del grupo A (Streptococcuss pyogenes) es la prueba de susceptibiidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antgeno A mediante enzimoinmunoanlisis o inmunoaglutinacin. Grupo B S. agalactiae, o GBS, causa neumona y meningitis en neonatos y en las personas ms jvenes, con bacteremia sistmica ocasional. Estos tambin pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisin al infante. El Colegio Americano de Obsttras y Gineclogos, la Academia Americana de Pediatras y los Centros para el Control de las Enfermedades recomiendan a todas las mujeres embarazadas entre 35 y 37 semanas de gestacin la evaluacin para GBS. Las mujeres que obtengan un examen positivo debera recibir antibiticos profilcticos durante la labor, con lo cual usualmente prevendr la transmisin al infante. En el Reino Unido, los clnicos han sido lentos en la implementacin de los mismos estndares como en los Estados Unidos, Australia y Canad. En el Reino Unido, solamente un 1% de unidades de maternidad han verificado la presencia del Estreptococo Grupo B. Aunque el Real Colegio de Obstetras y Gineclogos expidieron normativas basadas en el riesgo en 2003 (dada la revisin en 2006), la implementacin de estas normativas ha sido irregular. Algunos grupos sienten que como resultado 75 infantes en el Reino Unido mueren cada ao por enfermedad relacionada con GBS y otros 600 o ms sufren infeccin seria, la mayora de los cuales pudieran ser prevenidos; no obstante, esto debe an ser probado por RCT en el escenario del Reino Unido y, dada la evidencia para la eficacia de la evaluacin y tratamiento desde otros pases, podra ser que el necesario ensayo a gran escala no recibira respaldo ni aprobacin tica. Grupo C S. equi, el cual causa enfermedad en caballos, y S. zooepidemicus, el cual causa infecciones en varias especies de mamferos incluyendo al ganado y caballos. Este tambin puede ocasionar muerte en gallinas y alces. Muchos habitantes de las montaas en Canad han encontrado cadveres de alces yaciendo en la

mitad del camino; las pruebas post mrtem han establecido la presencia de estreptococos del grupo C en su sangre.

Grupo D (Enterococos) *hemolsis de tipo variable Muchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en el Gnero Enterococcus (incluyendo S. faecalis, S. faciem, S. durans, y S. avium). Por ejemplo, Streptococcus faecalis se conoce en la actualidad como Enterococcus faecalis. Las cadenas remanentes no-enteroccicas del Grupo D incluyen Streptococcus bovis y Streptococcus equinus. Estreptococos no hemolticos Los estreptococos no hemolticos rara vez causan enfermedad. Sin embargo, estreptococos del grupo D betahemolticos dbilmente hemolticos y Listeria monocytogenes no deben ser confundidos con estreptococos no hemolticos.