Extraccin de plsmido Plsmidos = molculas de ADN

pGLO y GFP extracromosmicas en clulas

bacterianas, hongos, levaduras
Brindan una ventaja competitiva
a partir de cultivo de E.Coli H-101 para las clulas portadoras

Objetivos:
1.- Medir y comparar el crecimiento en los
GFP (Green Flourescent Protein) =
diferentes medios preparados, usando el medio
Protena monomrica de 230
LB como referencia
aminocidos de estructura terciaria
2.- Extraer y comprobar la extraccin del
(barril beta) Funciona como marcador o
plsmido de las bacterias transformadas con un
seal luminosa
gel de electroforesis
3.- Extraer y comprobar las bacterias protena
verde fluorescente con un gel de poliacrilamida
Extraccin de protena Gel de poliacrilamida
Inoculacin bacteriana Se agregaron luego de El gel se dej correr a 110
1.-Se tomaron 45 mL de cada medio con centrifugar... volts por dos horas, luego
antibitico ampicilina (100 g / mL) *10 ul de buffer de lavado se sac de la cmara de
2.-Se tom una colonia de los cultivos (100 mmol/l TrisHCl pH 8.0). electroblotting y se ti con
slidos previamente crecidos, y se inocul *10 ul de buffer de extraccin azul de Coomasie por una
en cada uno de los caldos de tubo. de buffer de extraccin (Tris hora, posteriormente se
3.-Se dejaron incubar a 37 C durante 24 HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 10 lav con solucin
horas mM, NaCl 10 mM, 2% SDS). desteidora por 2 horas.
Se centrifugaron y se
recuper la fraccin soluble.
Extraccin de plsmido Se agreg 10 ul de buffer de
*Los pellets resultantes se re suspendieron en 100 l de carga a la muestra.
solucin fra 1 (Glucosa / Tris / EDTA GTE).
*Se aadieron 250 l de solucin fra 2 (NaOH / SDS) a cada
uno de los tubos
*Se aadieron 350 l de solucin fra 3 (acetato de potasio 5 M)
Finalmente, los pellets se re suspendieron en 50 l de solucin
1X TE y se almacenaron a -20C

Gel de electroforesis de agarosa
1.-Se prepararon 30ml de gel de agarosa, se pesaron 0.30g de Conclusin
agarosa y se disolvieron con calor en 30 ml de buffer TAE 1X. Las extraciones del
2.-Se aadieron 3 l del colorante de ADN GelRed 10,000 X a la plsmido pGLO se
solucin de agarosa-TAE. llevaron a cabo con xito
3.-Se mezclaron 5 l de la muestra con 1l de buffer de carga. La extraccin de la GFP
no fue lo suficientemente
pura, por lo tanto en el gel
de poliacrilamida no se
pudo ver la banda del
peso molecular esperado.
Referencias
1.-Add Gene. What is a plasmid? Recuperado
de la red el 07 de mayo del 2017:
https://www.addgene.org/mol-bio-
reference/plasmid-background/
2.-Add Gene. Antibiotic Concentrations for
Bacterial Selection. Recuperado de la red el 07
de mayo del 2017:
https://www.addgene.org/mol-bio-
reference/antibiotics/
3.-Isolation of plasmid DNA. Recuperado de la
red el 07 de mayo del 2017:
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyag
ok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch10s0
5.html
4.-Academic Journals (2013). Rapid mini-prep
isolation of high quality small and large
plasmids from phytopathogenic Gram negative
bacteria. Recuperado de la red el 07 de mayo
del 2017:
http://www.academicjournals.org/journal/AJMR/
article-full-text-pdf/D17C1F012876