Ingenieria genética II

Trabajo Práctico 2: Tinción y montaje de células. Microscopía de las transfecciones y

fotos. Cuantificación de los resultados utilizando el programa ImageJ.
Cosechado/lisis de células.

Cuantificación de los resultados utilizando el programa ImageJ

El programa Image J es un software gratuito desarrollado por el NIH que se puede bajar
del sitio http://rsb.info.nih.gov/ij/. Este programa permite editar, analizar, procesar,
guardar e imprimir imágenes de 8-bit, 16-bit y 32-bit. Además, puede leer imágenes en
diferentes formatos TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS, etc. Permite analizar una serie
de imágenes en una misma ventana, puede calcular áreas e intensidad de pixeles en
valores estadísticos y hacer mediciones de distancias y ángulos. Puede crear
histogramas de densidad y perfiles de lineas. Posee funciones de procesamiento básico
de imágenes tales como manipulación del contraste, definición, límites de detección,
filtrado medio, entre otras funciones.
Materiales:
 Células transfectadas en el T.P 1 fijadas.
 Portaobjetos
 Gelvatol
 Tritón X-100 en PBS 0,1%
 PBS
 Hoechst (dilución 1/1000 de solución stock 0,1%)
 Microscopio de fluorescencia
 Cámara de fotos digital
 Computadoras con el programa Image J o Cell Profiler

Metodología:

Protocolo de fijación: (realizado previamente por los técnicos)

1) Sacar el medio de las placas y agregar Paraformaldehído 4%
2) Incubar 10 minutos a Temperatura ambiente y realizar 2 lavados con PBS.

Protocolo de tinción:
1) Retirar PBS de los Wells.
2) Permeabilizar las células con Tritón X-100 0,1% en PBS por 5 minutos (200ul por
well).
3) Realizar 2 lavados con PBS.
4) Agregar 200ul de colorante Hoëscht por cada well.
5) Incubar 20 minutos en oscuridad.
6) Retirar el colorante y realizar 2 lavados con PBS de 5 minutos cada uno.
7) Colocar 10ul de Gelvatol en un portaobjetos.
8) Retirar el cubreobjetos y montar boca abajo sobre la gota de Gelvatol.
9) Dejar secar y sellar con esmalte de ser necesario

Protocolo de fotografiado:
1- Cada grupo procederá a tomar fotografías de los preparados que contienen sus
células transfectadas.
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2- De cada preparado deberá tomar dos imágenes representativas, una de ellas con
el filtro de Hoechst y la misma imagen con el filtro para ver EGFP.
3- Descargar las imágenes en la computadora.
4- Abrir el programa ImageJ y desde el menú File/Open abrir la imagen a cuantificar.
5- Ir al menú Plugins y seleccionar la opción Cell Counter. Mediante ella contar el
total de células (contando núcleos a partir de la tinción con Hoechst) y luego
contar las células verdes.
6- Para contar las células usted deberá hacer click con el mouse sobre las células a
contar, una vez finalizado el recuento presione results.
7- Calcule el porcentaje de células transfectadas en función del tiempo y del
tratamiento

NOTA: Si no aparece la opción Cell Counter en el menú, deberá descargar el plugin de la

página de internet http://rsb.info.nih.gov/ij/.

Completar la siguiente tabla respecto del porcentaje de células positivas

Plásmido a Método de transfección Tiempo de

transfectar Fosfato de calcio expresión (hs)
pTriEx2-EGFP 72
pc-EGFP 72

Una vez finalizado el recuento, graficar el porcentaje de células positivas por tiempo. En
el eje Y se grafica el porcentaje de células positvas y en el eje X el tratamiento, Genejuice
y cloruro de calcio.

¿Qué conclusiones saca de cada uno de ellos?

Cosechado y lisis de células

Para poder recuperar proteínas intracelulares es necesario lisar las células. Existen
diversos métodos para ello que dependen tanto del material de procedencia como de
la localización de las proteínas en la célula. Si la proteína se localiza en el citosol, su
liberación sólo requiere la apertura de la célula por ruptura (lisis), el método más sencillo
y suave de efectuar.

El buffer RIPA es uno de los más utilizado para lisar tanto células adheridas a una
superficie como células en suspensión. Permite extraer proteínas tanto de la fracción
citosólica como de la membrana ó del núcleo y es compatible con numerosas
aplicaciones posteriores tales como purificación, inmunoensayos, etc.

Entre los componentes más importantes de este buffer se encuentra Tris-HCl y

NaCl, que mantienen un pH y osmolaridad óptimas para la estabilidad de la mayoría de
las proteínas, y detergentes no iónicos (NP-40 o Triton X-100) para penetrar la
membrana plasmática y liberar el contenido citoplasmático. Algunas formulaciones
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llevan cantidades bajas de detergentes iónicos (SDS, desoxicolato de sodio) que son más
efectivas para disolver membranas, pero también tienden a desnaturalizar proteínas
(todo depende el uso al que se le dará a la proteína liberada)

Debido a que las proteínas son fácilmente suceptibles a la degradación de

proteasas presentes en el interior celular y que se liberan en el proceso de lisis, debe
agregarse inhibidores de proteasas a la solución que se utilice en la lisis celular. Los
inhibidores más utilizados son:

 Leupeptina, compuesto orgánico producido por actinomiocitos. Inhibe serin

proteasas (tripsina y otras) y cisteín proteasas (papaina, catepsina B)
 Fluoruro de fenilmetil-sulfonilo (PMSF), inhibidor de algunas serin-proteasas.
 EDTA, quelante de calcio que inhibe la actividad de proteasas dependientes
de calcio.
 Aprotinina conocida como inhibidor pancreático de tripsina bovina
 Pepstatina, inhibidor de aspartato proteasas como pepsinas y catepsinas.

Materiales
 Línea celular CHO transfectada con los plásmidos pTriEx2-EGFP y pc-EGFP, 72hs
antes. Estas células serán provistas por los docentes
 PBS
 Micropipetas automáticas
 Tips todos los tamaños
 Pipetas de cultivo autoclavadas
 Campana de flujo laminar
 Inhibidores de proteasas
 Buffer RIPA (Ver Anexo 6)
 Hielo
 Tubos eppendorf de 1,5 ml
 Guantes
 Etanol 70%

Metodología:
1- Preparar el Buffer de Lisis: mezclar 10 ul de PMSF, 10 ul de Ortovanadato de Sodio y
10ul-20ul de inhibidores de proteasas con 1 ml de Buffer RIPA. Conservar en frío
hasta usar.
2- Retirar el medio de cultivo de las células
3- Lavar suavemente dos veces la monocapa con PBS
4- Agregar 0,5 ml de buffer de lisis directamente sobre la placa.
5- Dejar reposando 20-25 minutos en hielo.
6- Subir y bajar con la pipeta sin generar espuma hasta observar lisis total de las células.
7- Traspasar el lisado a un tubo eppendorf limpio y colocarlo inmediatamente en hielo.
8- Centrifugar a 10000g durante 10 minutos a 4°C y separar el sobrenadante.
9- Almacenar ambas fracciones a -20 grados hasta su utilización.

Nota: si la solución de lisis tiene consistencia muy viscosa, debe sonicarse antes de
sembrarse en el gel.