Protoplastos

--Obtención, aislamiento, purificación, fusión y

cultivo in vitro--
Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Integrantes:
Ana Cobos, Solange Chicaiza, Hadassa Lara, Nathaly Mora y Diana Rosero
 Características
Son células excluidas de su pared celular.
Boergesenia protoplast formation
.

Poseen los orgánulos típicos de una célula, membrana

plasmática, núcleo y vacuolas.

Pueden dividirse, formar colonias y bajo condiciones

adecuadas regenerar una nueva pared celular

Sufrir división mitótica para producir células hijas del que

se puede regenerar una nueva planta.
2
 ⩥ En las soluciones hipertónicas las membranas plasmáticas de las
células se contraen desde sus paredes.
⩥ Luego al eliminar la pared celular se liberan grandes poblaciones de
protoplastos esféricos que son osmóticamente frágiles.

Creation of protoplasts from cells

growing in hypertonic conditions
3
Material de ➢ El estado fisiológico del tejido fuente influye
en la liberación de protoplastos viables.

origen ➢ Brotes, plántulas y suspensiones de células

embriogénicas cultivadas in vitro.

Una ventaja es que los protoplastos se

pueden aislar de radículas, hipocótilos,
tejidos de cotiledones, raíces y pelos
radiculares a los pocos días de la
germinación de la semilla in vitro.

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 Algunos ESTUDIOS
Autores Material de origen usado para el aislamiento de protoplastos
Keskitalo, 2011 A partir de brotes cultivados de Tanacetum vulgare y Tanacetum
cinerariifolium se tuvo más éxito durante el invierno y la primavera.
Mliki y col., 2003 En variedades de uva, los rendimientos más altos fueron de hojas de
brotes cultivados 4 a 5 semanas después de la transferencia de los
brotes a un nuevo medio.
Dovzhenko y col, 2003 Informaron de un sistema de obtención basado en cotiledones rápido y
reproducible para Arabidopsis thaliana.
Sinha y col. (2003) Cotiledones de plántulas de altramuz blanco cultivadas in vitro dieron
rendimientos más altos en comparación con hojas, hipocótilos y raíces.

Davey MR, Anthony P, Power JB, Lowe KC. Plant protoplasts: status and biotechnological
perspectives. Biotechnol Adv. 2005;23(2):131-171. doi:10.1016/j.biotechadv.2004.09.008 5
 PROTOCOLO DE LABORATORIO
REACTIVOS: INSUMOS:
•Hipoclorito de Sodio 3% •Papel de germinación de alto gramaje
•Solución Pretratamiento •Papel aluminio
•Solución de mezcla de enzimas •Bandejas de goma
•Solución de lavado •Pinzas, bisturí
•Recipientes de plástico
•Placas Petri
•Tubos cónicos Falcon 50 ml
•Colador de células de 40 μm
•Tubos de microcentrífuga 1,5 ml
EQUIPOS: Agitador, cámara de crecimiento, estereomicroscopio
MUESTRA: Semillas de maíz

Ortiz-Ramírez, C., Arevalo, E. D., Xu, X., Jackson, D. P., & Birnbaum, K. D. (2018). An Efficient Cell Sorting Protocol for Maize
Protoplasts. Current protocols in plant biology, 3(3), e20072. https://doi.org/10.1002/cppb.20072 6
 Soluciones para el tratamiento
Para 25 ml de solución de pretratamiento: Para una solución de 25 ml de mezcla de
⩥ 0,75 g de sorbitol enzimas:
⩥ 62 μl de L-cisteína 1 M ⩥ 1,82 g de manitol
⩥ 0,097 g de MES (ácido 2-morfolin-4-
iletanosulfónico)
Para una solución de 25 ml de lavado:
⩥ 0,5 ml de KCl 1 M
⩥ 1,82 g de manitol
⩥ 0,097 g de MES ⩥ 0,3 g Celulasa “onozuka” RS
⩥ 0,3 g de Celulasa "onozuka" R10
⩥ 0,5 ml de KCl 1 M
⩥ 0,09 g de pectoliasa Y-23
⩥ Ajustar la solución de pH a 5.7 con TRIS
⩥ 0,1 g de macerozima R-10
1M (pH8) (Trizma)
⩥ Ajustar la solución de pH a 5.7 con TRIS
⩥ 0,25 ml de CaCl2 1 M
⩥ 0,025 g de BSA 1M (pH8) (Trizma)
⩥ 0,25 ml de CaCl 2 1 M
⩥ 0,025 g de ASB 7
Germinación y crecimiento de plántulas
⩥ Desinfección: hipoclorito de sodio al 3% durante 8 min en un vaso de precipitación (agitación)
⩥ 5 enjuagues en agua destilada.

⩥ Se incuba por 6 días a 27°C, 16 h de luz/24°C, 8 h de oscuridad ≈ 50 % humedad.

⩥ Transcurrido el tiempo, se desenrolla el papel y se evalúa el crecimiento de las raíces primarias y
presencia de raíces secundarias y seminales.
⩥ Se usan las plántulas con apariencia saludable para la obtención de protoplastos. 8
1. Aislamiento Y
PURIFICACIÓN
 “
Pretratamiento Purificación

Digestión enzimática

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 Pretratamiento
pH de la Condiciones
Tipo de tejido Concentración
solución osmóticas de
utilizado de las enzimas
enzimática las soluciones.

⩥ Se trata el material de origen del protoplasto → digestión

enzimática
⩥ De hojas → las más extendidas y jóvenes
⩥ De raíces → las más completas
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 Digestión enzimática
⩥ Los protoplastos se aíslan por medio de mezclas
de diferentes enzimas hidrolíticas
→ degradan pared celular
⩥ Mezcla de celulasas, hemicelulasas y pectinasas
⩥ No existen soluciones estándar → se debe encontrar
una adecuada con respecto al material vegetal.
⩥ Las enzimas requieren pH (4-6) y T (40-60°C)

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 Purificación
Protoplastos libres,
Después de la
restos
digestión Purificación
de tejido vegetal
enzimática y desperdicio celular

⩥ La viabilidad de los protoplastos mejora cuando se purifica las enzimas

de la sales e impurezas vegetales.
⩥ Los protoplastos aislados reflejan propiedades morfológicas y
fisiológias -> células provenientes
⩥ Se debe llevar de manera aséptica el proceso (cámara de flujo laminar)
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PROTOCOLO

Ortiz-Ramírez, C., Arevalo, E. D., Xu, X., Jackson, D. P., & Birnbaum, K. D. (2018). An Efficient Cell Sorting Protocol for Maize
Protoplasts. Current protocols in plant biology, 3(3), e20072. https://doi.org/10.1002/cppb.20072
Pruebas de viabilidad
La viabilidad de protoplastos recién aislados es el
factor fundamental y decisivo para llevar a cabo la
fusión o hibridación somática.
Procedimiento
➢ Se preparan 500 μl de colorante azul de Evans y se
realizan montajes de las suspensiones de los
protoplastos recién aislados en portaobjetos,
mezclando 50 μl de muestra de protoplastos y 5 μl de
colorante.
➢ Se incuban en una estufa a 45 °C durante 30min.
➢ Luego, se observan en un microscopio óptico para
determinar la viabilidad

Principio del método

Se basa en que el reactivo en dilución no tiene la
Figura 1. Protoplastos aislados de A) V. planifolia
y B) V. pompona. 400x
capacidad de traspasar la membrana celular.
Los protoplastos viables no tendrán tinción, mientras que
los muertos se verán en color azul.

Ortega, L., Georgina, L., Beltrán, J., & Ramirez, M. (2016). Aislamiento y fusión de protoplastos de Vanilla planifolia Jacks. Ex Andrews y 15
Vanilla pompona Schiede. Revista de La Asociación Colombianan de Ciencias Biológicas, 16–24.
 2. Fusión
- Técnicas de aislamiento y cultivo de
protoplastos, que permiten la obtención de
células desprovistas de pared celular gracias a
la acción de enzimas líticos obtenidos de
microorganismos y su posterior crecimiento
(división celular, formación de microcallos y
regeneración de plántulas por vía
organogénica o embriogénica)
 PROTOCOLO

Espejo, Rosa, Cipriani, Giselle, Rosel, Genoveva, Golmirzaie, Alí, & Roca, William. (2008). Híbridos somáticos obtenidos por fusión de
protoplastos entre Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum y la especie silvestre Solanum circaeifolium Bitter. Revista Peruana de
Biología, 15(1), 73-78. Recuperado en 30 de agosto de 2020, de http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-
99332008000100010&lng=es&tlng=es. 17
18
19
20
3.CULTIVO IN VITRO DE
PROTOPLASTOS

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⩥ Debe tratarse de cultivos celulares en suspensión, y para
obtener una elevada frecuencia de infección en los tejidos
habrá que destruir las rigidez de las paredes celulares
⩥ Los protoplastos han podido ser cultivados en medio
líquido cuyos nutrientes dependen de la especie vegetal
utilizada e incluso de su variedad.

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Las condiciones a las que se someten los protoplastos durante el cultivo in vitro, no van a
ser las mismas cuando se está cultivando una planta completa.

⩥ Pueden llevar a la ⩥ Líneas celulares estables

expresión de nuevos ⩥ Las líneas celulares no
genes son siempre estables y
⩥ Conocimiento previo de pueden mutar
las rutas biosintéticas ⩥ Puede modificar la
cantidad de principio
activo
⩥ Descubrimiento de
nuevos metabolitos

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Se cultivan primero las células Varios subcultivos de cada una
en medio sólido de esas colonias

Se lleva a cabo una selección Exámenes

indirecta mediante ensayos macroscópicos y microscópicos
analíticos (selección directa)
Protocolo en YUCA (Manihot esculenta Crantz)
Se agregaron 20 µl de diacetato de fluoresceína (FDA) 0,5% (p/v) a 500 µl una solución con protoplastos, luego se incubó por 10 min

La suspensión de protoplastos se probó en dos cultivos :uno líquido y con gotas de agarosa.

El medio líquido: 6 ml de medio TM2G suplementado con NAA 0,5 mg/L y ribósido de zeatina 1 mg/L

En el sistema de cultivo de gotas de agarosa se hicieron experimentos preliminares con cuatro versiones diferentes del medio TM2Gl:

Combinación PZ: picloram 12 mg/L, ribósido de zeatina 1 mg/L.

Combinación DNB: 2,4-D 0,5 mg/L, NAA 0,5 mg/L, BAP 0,5 mg/L.

Combinación KNB: kinetina 2 mg/L, NAA 1 mg/L, BAP 1 mg/L.

Combinación NZ: NAA 0,5 mg/L, ribósido de zeatina 1 mg/L.

La solución con protoplastos fue agregada a 34°C, con la que se sirvieron 10 gotas en cajas Petri profundas (100 x 25 mm)

10 ml de medio líquido a cada caja para suministrar sustancias necesarias para el desarrollo y prevenir la deshidratación.

La concentración inicial de glucosa en el medio TM2G fue de 0,33 mol/L, pero esta fue paulatinamente reducida.

Para las cajas con gotas de agarosa, cada 10 días se refrescaba el cultivo añadiendo medio TM2G con 0,33 mol/L

Para los cultivos en medio líquido, se realizó la misma reducción gradual de la concentración de glucosa.

Al terminar este proceso, se reemplazó el medio TM2G con medio SH líquido y el cultivo permaneció 4 semanas a 28°C sin luz.

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Microcallos formados en gotas de agarosa fueron transferidos a medio ME007 Agar, y aquellos obtenidos en medio líquido se tra nsfirieron a medio MSN.
26
 Aplicaciones
Investigación en biología y fitopatología
• Investigación en procesos de
transporte y división celular,
morfogénesis, mutagénesis,
selección, etc.
• Para estudiar la etiología de los virus,
especificidad y modo de actuación de
hongos y bacterias y la obtención de
clones resistentes a patógenos.

Guzmán, H., Fernández, M., & Gonzales, M. (2009). Regeneración de protoplastos de Saccharomyces cerevisiar, Candida utilis,
Aspergillus niger y Aspergillus oryzae obtenidos con los ácidos: Tánicos, Fórmico y Acético. Revista Cubana de Química, 3-7. 27
 Transformación genética por hibridación o fusión somática

Mejoramiento genético de plantas,

desarrollar nuevos colores de flores,
resistencia a patógenos,
variación somaclonal,
genómica funcional
y transformación genética.

Monckeberg, F. (1998). La nueva revolución agrícola. Chile: Editorial Mediterráneo.

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 Uso de ADN recombinante

• Mediante el traspaso de genes se puede

lograr plantas con resistencia a
enfermedades, herbicidas, pesticidas,
resistencia a salinidad o a bajas
temperaturas.
• Uno de los vectores o transportadores
más utilizados es Agrobacterium
tumefaciens.

Monckeberg, F. (1998). La nueva revolución agrícola. Chile: Editorial Mediterráneo.

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¡GRacias! ¿Alguna
pregunta?

No, bueno
30