MICROSCOPA

Trabajo Prctico N
N 6

MICROBIOLOGA
(Octubre 2012)

Claudia Herrmann
cherrmann@iibintech.com.ar

1
 MICROSCOPA
Campo claro
Campo oscuro
Microscopio ptico Contraste de fase
Fluorescencia
Confocal

De transmisin (MET)
Microscopio Electrnico
De barrido (MEB)

Microscopio de Fuerza Atmica

2
3
1) Microscopio de campo claro

Ocular (X10)

Objetivo
(X20, X40, X60, X100)

Muestra

Condensador
Fuente
L
Luz

4
1) Microscopio de Campo Claro

La muestra debe ser delgada (casi transparente) Fijacin Tincin

Para aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos

y el medio en las muestras es necesario realizar tinciones.

Levaduras sin teir Bacterias Tincin Gram

5
2) Microscopio de campo oscuro

Objetivo - Se coloca una placa opaca en el

condensador.
d d

- Solo los rayos

y reflejados
j o
Muestra
difractados entran al objetivo.

- Se obtiene una imagen con fondo

oscuro y la muestra iluminada.
Condensador

Placa Opaca - No es necesario fijar las muestras

Fuente
Luz
(Buen contraste entre la muestra y el
fondo)

6
FUNDAMENTO

Rayos No
Lente del Objetivo
Desviados

Rayos Desviados
por la muestra

Muestra

Lente del
Condensador
Placa Opaca

Fuente de Luz

7
Campo Claro vs. Campo Oscuro

Levaduras Chlamydomonas

8
3) Microscopio de Contraste de fase

- Se basa en el retraso de las ondas de luz al Anillo de fase

Objeetivo
atravesar objetos de distintos ndices de refraccin
(densidades), aprovechando y amplificando dichos
retrasos.

- Convierte
C i t pequeas difdiferencias
i en ndices
di d
de
Muestra
refraccin variables y detectables por el ojo.

- Permite observar estructuras sin necesidad de

fijar las muestras. Condensador

- Las partes oscuras de la imagen corresponden a

las porciones densas de la muestra; las partes Disco Anular
claras de la imagen corresponden a porciones Fuente
menos densas Luz

9
3) Microscopio de Contraste de Fase
La luz,, al atravesar objetos
j con distintos ndices de refraccin,, experimenta
p retrasos
(desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder percibirlos.
El MCF, mediante el diafragma anular y el anillo de fase, acenta dichos retrasos,
haciendo que zonas con distintos ndices de refraccin se traduzcan en una variacin
de contraste la cual puede ser observado.

Se observan imgenes
con el fondo claro
(rayos no desviados) y
las muestras oscuras
rayos con limites bien
en fase -1/4
/ definidos.
-1/4

ANILLO DE FASE Objetivo Los rayos desviados se

cancelan con los no desviados
Discos transparentes
con un diseo en relieve

10
3) Microscopio de Contraste de Fase
Cl l Vi
Clulas Vivas

Microscopio
p de p de
Microscopio
Campo Claro Contraste de Fase

No hay buen contraste con el fondo Buen contraste de clulas con el fondo
No se observan hay lmites claros Lmites celulares evidentes (oscuros)
No se distinguen estructuras internas Se distinguen estructuras internas

11
4) Microscopio de fluorescencia

Filtro de emisin

Muestra

Condensador de
Campo Oscuro

Lmpara
p

Filtro de
excitacin

12
MUESTRAS
- Pueden presentar autofluorescencia estar teidas con fluorforos:
- Anticuerpos
A ti conjugados
j d
- Hoecht (tie DNA)
- Expresin de protenas de fusin fluorescentes (GFP)

- Pueden estar vivas o fijadas Microscopio Invertido

- Son exitadas excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud
de onda mayor.

13
 5) Microscopio confocal

- Las muestras deben estar teidas

con fluorforos o presentar
autofluorescencia

- Las muestras pueden estar vivas o

fij d
fijadas

- Las muestras son excitadas a una

longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.
- Solo
S l llos h
haces dde lluz que pasan por
el foco llegan al detector.

- Se observan planos.
planos

14
5) Microscopio confocal
- Un Rayo Lser se hace pasar a travs
del pinhole, este haz de luz pasa a
travs del espejo y luego a travs del
l t objetivo
lente bj ti ell cuall llo enfoca
f sobre
b lla
muestra.

- La
L lluz emitida
itid por lla muestra
t es
recibida por el lente objetivo y
reflejada por el espejo.

- Esta luz pasa a travs de la apertura

pinhole que no permite el paso de la
fluorescencia originada por los planos
fuera de foco.

- Slo la luz del plano focal llega al

detector.

15
Al
Algunas Aplicaciones
A li i

1) Anlisis de colocalizacin.
2) Inmunofluorescencias y deteccin de sondas.
3) Series Z (Reconstrucciones 3-D).
4) Time Series (Series Temporales).
5) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).

16
5) Microscopio confocal
1- Observacin de una imagen desde el eje z.
2- Se registran imgenes correspondientes a diferentes planos xy.
3- Se reconstruyen imgenes de la muestra observadas desde los ejes x y.

17
5) Microscopio Confocal

Microscopia de fluorescencia Microscopia Confocal

Escherichia coli

18
6) Microscopio Electrnico de Transmisin (TEM)
- Se
S utiliza
tili un h
haz d
de electrones
l t e imanes
i como lentes.
l t Fuente emisora
de electrones
-Los electrones se transmiten a travs de la muestra (poca
penetracin: aprox. 10 - 100 nm) Condensador
- Muestra extremadamente fina y de baja densidad
Contraste con el fondo dbil.
Muestra
TINCIN: absorbe electrones y produce una imagen
ms oscura de la regin teida (osmio, tungsteno,
plomo o uranio)
- Se ggenera vaco p
para evitar q
que los electrones colisionen con
Objetivo
los tomos del aire y se desven.
- Tratamiento de las muestras: Lente
- Fijacin proyectora
- Corte con micrtomo/criofractura
- Tincin con sales de metales pesados. Pantalla

- No explora superficies. El haz de electrones incidente atraviesa la muestra observada

y los detalles finos o ultra-estructuras son capturadas en una pantalla (fsforo).

19
20
CARACTERSTICAS del MET
Objetos
Obj t < 00.2
2 um (virus,
( i estructuras
t t celulares
l l iinternas,
t etc.)
t )d deben
b observarse
b
por ME (no pueden ser discriminadas con la resolucin del MO)
El poder de resolucin del ME es mucho mayor que el de los MO debido a que la
longitud de onda de los electrones es 100.000 veces menor que la de la luz visible.
El contraste es el resultado de la dispersin diferencial de electrones por la
muestra. El ggrado de dispersin
p es funcin del nmero y masa de tomos en la
trayectoria de los electrones.
Las clulas (mamfero y bacterias) son demasiado gruesas para ser examinadas
satisfactoriamente en preparaciones enteras
enteras. La observacin de su estructura interna
exige que sean fijadas, deshidratadas, embebidas en plsticos y seccionadas (50 nm
aprox). Los cortes luego se tien con sales de metales pesados y se montan.
En el MET los rayos X generados revelan la estructura interna, tamao y
distribucin de partculas, red cristalina, interfases y defectos puntuales de la red
atmica, etc.
El MET permite estudiar la composicin qumica de la muestra. Puede hacerse
un detallado estudio cristalogrfico del material investigado.

21
6) Microscopio electrnico de transmisin (TEM)
Clula eucariota

Bacteria
(Brucella)

1 uM

22
 7) Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
-Se utiliza un haz de electrones e imanes como lentes.

-Se genera vaco para evitar que los electrones colisionen con los tomos del aire y
se desven.

-Se captan los electrones emitidos por el objeto (no transmitidos).

-Tratamiento de las muestras:

-Fijacin
-Deshidratacin
-Cobertura con metales pesados.

-Se observan topologas de superficies.

23
24
La muestra es irradiada con
un haz muy estrecho de
electrones hace que la
muestra desprenda
electrones de baja energa
(secundarios) que pueden
ser recogidos sobre una
placa cargada positivamente
(nodo) generando de este
modo una seal elctrica
que es puede ser utilizada
para ggenerar una imagen
p g de
la muestra.
El generador de barrido
hace que el haz de
electrones atraviese la
muestra siguiendo un
rastreo de barrido

25
7) Microscopio electronico de barrido (SEM)

Bacterias (Rhizobium)
Pelos
l radiculares
di l

26
7) Microscopio de Fuerza Atmica (MFA)
Microscopio mecano-ptico
Resolucin < 1nm
Registra la topologa de la muestra
FUNDAMENTO:
FUNDAMENTO Se S basa
b en la
l deteccin
d i de
d las
l fuerzas
f atmicas
i (d l orden
(del d ded los
l
nanoNewton) moleculares de interaccin entre una punta y la superficie del
material estudiado.
El MFA ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnologa

COMPOSICIN
Cantilever: dimensin aprox. 200 um.
Lser: La flexin del cantilever es registrado
mediante un haz lser (medicin ptica) que se
refleja en su parte posterior para luego
alcanzar un fotodetector.
Punta: cristal de forma piramidal o cnica
cnica.
Sus dimensiones bordean los 5 nm y 100 A de
dimetro.

27
7) Microscopio de fuerza atmica (MFA)
La muestra es movida en las tres direcciones,
mientras el cantilever traza la superficie de la
muestra en detalle
detalle.

Todos los movimientos son controlados por

una computadora.
d

La fuerza de interaccin entre la superficie

p
de la muestra y la punta hacen que el
cantilever se flexione.

Un detector mide esta flexin conforme la

punta barre la superficie y con ello se
obtiene
bi un mapa topogrfico.
fi

28
7) Microscopio de fuerza atmica (AFM)

Algunos artefactos de la MFA

Muestra Imagen Muestra Imagen

29
7) Microscopio de fuerza atmica (AFM)

Protena de unin a ADN (23 kDa)

ADN (500 pb)

30
 Microscopa

Algunas muestras requieren de TINCIONES para ser

obser adas por un
observadas n determinado microscopio

Cules son las tinciones ms comunes que podemos utilizar en

microbiologa para observar y distinguir entre distintos
microorganismos?

31
 TINCIONES

Catinicos: se combinan con los constituyentes

celulares cargados negativamente tales como
cidos nuclicos, polisacridos cidos y superficies
celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta,
l Safranina.
f
Colorantes Aninicos: se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente,
positivamente tales como
numerosas protenas. Ejemplos: Eosina, Fucsina
acida y Rojo congo.
Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas.
Ejemplos: Sudan negro.

32
 Tinciones

Simples: uso de un solo colorante.

Positivas: Colorantes que
tien al microorganismo
y no al medio.
2 TIPOS
Sirven para distinguir formas.
formas
Diferenciales: uso de un colorante
iniciall y lluego un colorante
l d
de
contraste. Sirven para diferenciar
distintos tipos de clulas (Ejemplo:
tincin Gram)

Negativas: Colorantes que no tienen afinidad por los

componentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tien al medio y
no a las bacterias, sirven para ver clulas con cpsulas de
mucopolisacridos.
mucopolisacridos

33
 Tincin Gram
LLas bacterias
b i gram+ y gram- se tien i ded forma
f di i
distinta d bid a las
debido l
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares (PC).

La PC bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as

como para prevenir la lisis osmtica.

El componente de la PC que confiere rigidez es el peptidoglicano.

Gruesa capa de peptidoglicano (80-90%)

(80 90%)
Gram+
cidos teicicos
PC
Gram- Delgada capa peptidoglicano (10-20%)
Fosfolpidos
Membrana exterior Li
Lipopolisacridos
li id
Lipoprotenas

34
Tincin Gram
Permite distinguir
g dos grandes
g grupos
g p de bacterias que
q
poseen diferencias estructurales en la PC.

Peptidoglicano
Polimero de N-acetilglucosamina
y N-acetilmurmico unidos por
pptidos.

35
 GRAM
POSITIVO

GRAM
NEGATIVO

36
37
Esquema de la PC Bacteriana

Gram POSITIVAS

Gram NEGATIVAS

38
 TINCIN GRAM

Protocolo

1) Preparar un extendido

A partir de cultivos en medio lquido: Se toma un poco de

cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto
portaobjeto.

A partir de cultivos en medio slido (FRESCOS): Se apoya el

ansa sobre
b una colonia,
l i lluego se coloca
l una gota
t dde agua
sobre el portaobjeto y se desparrama el material con el ansa.

39
 TINCIN GRAM

2) Fijar el material Gram + Gram -

EEsperar a que lla muestra

t seque,
Pasar el portaobjeto sobre el mechero.

3) Cubrir con Cristal violeta

Dejar el colorante 60 segundos.

4) Lavar con agua

40
 TINCIN GRAM
5)) Agregar ell mordiente
d (LUGOL)
( )
Gram + Gram -
Lugol: solucin de I2 y KI
Dejar actuar por 60 seg
seg.
Lava con agua.

6)) Agregar ell decolorante

d l
Decolorante: solucin de acetona y etanol.
Aplicar por 5 segundos

El decolorante pproduce una DESHIDRATACIN de la p pared de

pptidoglicano. Este se contrae, se cierran los poros y se transforma
en una barrera fsica impermeable al solvente la cual impide el
lavado del cristal violeta que queda atrapado en el interior de las
bacterias Gram+.

41
 TINCIN GRAM
7)) Agregar ell colorante
l de
d contraste (Safranina)
( f )
Gram + Gram -

8)) Lavar con agua

g
Gram + Gram -

Violeta Rosado
Azulado

42
43
44
 TINCIN GRAM

Rosa (Gram -) Violeta (Gram +)

45
 TINCIN DE ESPORAS (Tcnica Schaeffer-Fulton)
Endospora bacteriana:
Estructura altamente resistente al calor y a condiciones ambientales desfavorables.
El principal desencadenante de la formacin de esporas es la falta de nutrientes
nutrientes.
Se observan en los gneros Bacillus y Clostridium (Gram +).
Altamente resistentes al calor,
calor desecacin
desecacin, cidos
cidos, lcali y desinfectantes
desinfectantes.

Estructura

46
Clasificacin en funcin de su posicin

Bacillus cereus: central, ovalada, no deformante

Bacillus subtilis: subterminal,

subterminal cilndrica
cilndrica, no deformante

Clostridium: terminal, ovalada, deformante

47
Tincin de Esporas

Protocolo

1) Preparar el extendido y fijar por calor.

2)) Cubrir con verde de malaquita
q y calentar por
p 3 minutos.
3) Lavar con agua.
4) Agregar
A colorante
l t de
d contraste
t t (safranina).
( f i )
5) Lavar con agua.

48
49
 Tincin de cido Resistencia (Ziehl-Neelsen)
Permite distinguir bacterias del gnero Mycobacterium.
Mycobacterium Estas poseen
en su pared acido miclico (hidroxilpido de cadena ramificada) que se
encuentra acomplejado al pptido glicano de la pared celular.

50
51
REACTIVOS:

1. Fucsina Fenicada:
Colorante soluble en los componentes lipdicos
Cuando se aplica calor a la muestra logra atravesar
la barrera de cido miclico y tie de rojo los
componentes lipdicos de la PC.

2. Alcohol cido: decolorante

3. Azul de Metileno: Colorante de contraste. Tie las

bacterias que no son cido resistentes.

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 Tincin de cido Resistencia (Ziehl-Neelsen)

Protocolo:
1) Preparacin del extendido y fijacin por calor.
2) Cubrir el portaobjeto con fucsina fenicada (fucsina bsica con fenol).
3) Calentar hasta emisin de vapores.
4) Lavar con agua.
5) Agregar decolorante (HCl 3%, EtOH 95%).
6) Lavar con agua
agua.
7) Agregar el colorante de contraste (Azul de metileno).
8) Lavar con agua.

53
54
Etapas de Formacin de la Espora

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