Microscopia electrnica de transmisin

Introduccin.
El microscopio electrnico no es mas que uno de los muchos aparatos cuyo
fundamento es la ptica electrnica. El nombre que resulta justificado por la
estrecha analoga existente entre su formulacin terica y la de la ptica clsica. No
hay posibilidad de estudiar la ptica electrnica sin enfrentarse con una de las
consecuencias aparentemente paradjicas de la fsica terica moderna: la dualidad
onda-corpsculo, cuando los electrones inciden como paquetes de ondas sobre los
tomos de una muestra, las colisiones pueden representarse, y a veces con gran
precisin

como colisiones del tipo bola de billar. Sin embargo, Si la muestra

contiene un cristal en una cierta orientacin, los electrones debern representarse

por ondas para dar cuenta de las reflexiones.
La prueba crucial para demostrar la existencia de las propiedades ondulatorias de
los electrones fue la observacin de la difraccin y de la interferencia de las ondas
de los electrones.
Al final del siglo se haban reunido muchos datos sobre la emisin de la luz por
los tomos de un gas al ser excitados por una descarga elctrica. Observada a traves
de un espectroscopio con una abertura en forma de rendija estrecha. Las bandas
formadas obedecen a las diferentes longitudes de onda que conforman el espectro
luminoso. En similar forma y utilizando el espaciado conocido de los tomos de un
cristal se calculo la longitud de onda que poda producir dicho mximo y se
encontr la correspondencia con la energa de los electrones que eran utilizados. El
electrn

haba

adquirido

un

comportamiento

ondulatorio.

Este comportamiento de onda puede ser tratada en igual forma que el

tratamiento hecho sobre la luz por medio de una lente de vidrio. En contra
posicin, el vidrio no actuara de igual forma sobre la onda de electrones, era
necesario utilizar otro tipo de lente (las magnticas).

Los electrones procedentes de un filamento caliente

se ven acelerados por una gran diferencia de tensin
en el tubo. El haz de electrones se hace paralelo
mediante lentes de enfoque magntico. los electrones inciden sobre un blanco muy
delgado y luego se enfocan mediante una segunda lente magntica que es
equivalente a la lente objetivo de un microscopio ordinario. La tercera lente
magntica juega el papel del ocular de un microscopio. Proyecta el haz de electrones
sobre una pantalla fluorescente donde se realiza la observacin de la imagen.

1.

Breve Historia.

Las ideas que llevaron a la puesta a punto del microscopio electrnico de alta
resolucin tuvieron su origen en muy diversos estudios, el descubrimiento del
electrn como partcula cargada con masa en reposo; los haces de estas partculas
se pueden desviar y concentrar mediante campos elctricos y magnticos con este
principio se construyo el primer oscilgrafo y dio pie para que Luis de Broglie en
1924 lanzara su extraordinaria hiptesis segn la cual haba de asociar una
naturaleza ondulatoria a cada partcula material, Y en particular a los electrones.
Dedujo la formula para la logitud de onda de dichas ondas materiales donde

es la

constante de Planck, la masa de la partcula y su velocidad. Si se sustituyen valores

de esta ecuacin para un electrn acelerado por un potencial de 60.000 voltios,
resulta una longitud de onda de solo 0,05 , lo que representa 1/100.000 de la luz
visible. Poco despus, en 1926, E. Schrdinger comenzo el desarrollo de la mecnica
ondulatoria haciendo uso de las analogas

mecnico-pticas demostradas por W.R.

Hamilton en 1830, y combinndolas con las ideas de De Broglie.

En 1927 La

hiptesis de De Broglie fue confirmada experimentalmente con haces electrnicos

por Davisson y Germer en los Estados Unidos y por Thomson y Reid en Inglaterra.

Los

primeros en desarrollar el microscopio electrnico fueron Ersr Ruska y Max Knoll,

hacia la dcada de 1930 (Bozzula y Bartlerr, 1997).
Con el desarrollo del microscopio electrnico se lleg al territorio celular
desconocido hasta el nivel del nanometro, pero el escaso poder de penetracin del
haz de electrones hizo necesario el desarrollo de tcnicas que dejaran las muestras
a examinar de extraordinaria finura (una millonsima de centmetro) y su examen
debe realizarse bajo intenso vaco. Adems de la construccin de instrumentos
necesarios

para

reducir

las

muestras

cortes

ultra

finos

(Duve,

1988).

El primer microscopio electrnico fue usado por ingenieros y fsicos. El uso del
microscopio en el campo de la Biologa, fue en sus inicios para estudios puramente
descriptivos, pero con el tiempo se ha usado en estudios experimentales. Para el
desarrollo y origen de la Biologa Celular fue determinante la aparicin del
microscopio electrnico. Actualmente su uso es multidisciplinario (Bozzula y
Bartlerr, 1997). En 1926 despus de 15 aos de estudio sobre la trayectoria de los
electrones en campos magnticos, H. Busch publico un articulo en el que mostraba
que un campo elctrico o magntico con simetra axial era capaz de actuar como
una lente para los electrones u otras partculas cargadas. El trabajo de Busch atrajo
la atencin de los fsicos del momento hacia una consecuencia prctica importante
de las teoras de De Broglie y Schrdinger, y dio origen a una nueva ciencia de
instrumentacin que se conoce desde entonces como ptica electrnica, ciencia que
busco el desarrollo de la microscopia electrnica ( Electron Microscopy, EM).

2.

Contextualizacin y funcionamiento del microscopio

electrnico de transmisin.

En el campo de la ciencia fsica moderna es primordial

entender el
comportamiento tanto del haz de luz como el de electrones, todas las aplicaciones
pticas en cuanto a capturas y ampliacin de imgenes que usan este principio
prestan gran utilidad para el desarrollo de las ciencias que incursionan en el
microcosmos.. Son diversas las tcnicas que cumplen con estos propsitos, entre
ellas,
son
dignas
de
ser
citadas
las
siguientes:
2.1
Microscopia Confocal y de fluorescencia: propia para la observacin de

imgenes topogrficas con carcter tridimensional de sus estructuras en diferentes

tipos de muestras.

2.2

Microscopia electrnica de Barrido y

micro anlisis de rayos X: Explora las
superficies de las muestras realizando
un paneo sobre la misma y capturando
la radiacin reflejada la cual se codifica
en datos computacionales con la idea
de
reconstruir
la
imagen
del
espcimen.

2.3
Microscopia
electrnica
de
Fuerza
Atmica: Una aguja de punta muy fina casi a
nivel atmico explora la superficie de la muestra
generando entre ambas un campo electro-magntico. El campo sufre variaciones
correspondientes a las variaciones de rugosidad de la superficie muestreada. Las
variaciones electromagnticas ocasionadas generan una informacin de corriente
elctrica que debidamente tratada reconstruye la imagen de la superficie
observada.
2.4 Microscopia electrnica de Efecto Tunel: Conserva el mismo principio que el
microscopio de fuerza atmica salvo que la intensidad del campo es mayor y realiza
exploraciones
bajo
la
superficie.
2.5
Microscopia electrnica de transmisin: A diferencia de los anteriores
microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones
incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles finos
o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con propiedades de
emisin de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada
preparacin de la muestra da lugar a una excelente definicin de imagen. Son
mltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. As, en control
de calidad sealamientos morfolgicos, conformacin de agregados, tcnicas
forenses, determinacin de estratos en restauracin y diferenciacin histolgica
entre

otros.

En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con

resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas. Con
todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son
magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la figura 2.
Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen dos,
mientras otro grupo de aparatos posee solamente una lente proyectora. Aunque los
detalles de construccin varen de un tipo a otro, se puede obtener una visin
cualitativa
de
conjunto
de
sistema
ptico.
La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo de volframio en forma de

horquilla, rodeado por una pantalla cilndrica polarizada negativamente respecto al

filamento( figura 3). Despus de atravesar el nodo conectado a tierra, la mayor
parte de los electrones del haz se pierden en las paredes y aberturas excepto un
estrecho
cono
que
atraviesa
el
diafragma
del
condensador.
La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa, como
para variar la abertura de iluminacin relativa en el objeto. Los dimetros de los
diafragmas del condensador varan segn el tipo de instrumento, pero suelen estar
comprendidos entre 0,1 y 0,5 mm. Despus de atravesar el objeto, donde muchos
electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la lente objetivo que produce
una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de
10 a 100 de dimetro para interceptar los electrones esparcidos , pero
generalmente esta precaucin se omite en el estudio de muestras muy delgadas en
las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre
lente e imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a
X300, sera necesario el uso de una o mas lentes protectoras que vuelvan a
aumentar la imagen primaria. Algunos instrumentos llevan incorporada una
pantalla intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este
accesorio aquellos aparatos dotados de dos lentes proyectoras. La imagen final se
observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del haz,
se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales
para un microscopio de transmisin pueden ser: Del filamento a la lente
condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que del
objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el
sistema completo deber ser rgido y capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg
con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias.
Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido
representadas en los diagramas son la fuente de alimentacin para crear un
potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores
de vaco, tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y
enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas inmediato se centra en la tcnica
de preparacin de muestras.
Comparacin entre microscopia electrnica
de
transmisin
(MET)
y
microscopia

electrnica
(MEB).

de

barrido

Preparacin
muestras

de

las

El proceso comienza con el

tejido altamente hidratado y
termina
con
el
tejido
virtualmente libre de agua y
preservado en una matriz de
resina.
Existen muchos caminos para
la preparacin de tejidos para
Microcopia
electrnica
de
transmisin, pero los mtodos
siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca
preservar la estructura del
tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHOCH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:
(COOH-protena-NH2)2 +

CHO-

CH2-CH2-CH2-CHO

Entonces:
COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH
+H2O
La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido
es atravesado en una hora por el glutaraldehido.
2.

Lavado:
Normalmente
se
hace
con
un
buffer.
Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente
durante el proceso de fijacin. El uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4)
los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y
cacodylate.

3. Fijacin secundaria: es llevada a

cabo por la accin del tetrxido de
osmio,
el
cual
reacciona
principalmente con los lpidos. El
tetrxido de osmio generalmente
no penetra mas de 0,5 mm en una
hora.
4. Deshidratacin: La filosofa de
la deshidratacin es el reemplazo
del agua usando etanol en series
70% 85% 95% y etanol absoluto.
5.
Infiltracin
con
solventes
transicionales: procedimiento por
el cual hay transmisin de fluidos
gradualmente reemplazado por
soluciones
intermediarias
altamente
miscibles
con
los
agentes deshidratantes, la mayora
de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la
resina.
6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas
reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin
del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de
resina hasta llegar a la resina pura.
7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin
aumentando la temperatura.

Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente

las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algn tipo de convencin
que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo

del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn).
Procesador automtico de tejidos.

3.

Tcnicas

aplicaciones

La novedad(1) de las condiciones requeridas para la formacin de la imagen optoelectrnica, comparada con la rutina establecida con los microscopios pticos
radica en las dificultades inherentes de la formacin de una imagen por
electrones , los posibles efectos destructivos de la desecacin en vaco, y la
bsqueda de contrastes en la imagen hacen cada vez mas difcil esta tarea.
Las suspensiones purificadas son contrastadas utilizando la tcnica de tincin
negativa. Para esto, una gota de la suspensin se coloca sobre papel parafinado
(Parafilm ) y luego una rejilla de nquel, previamente recubierta con una pelcula de
Fomvar se deja flotar sobre la gota durante cinco minutos. El exceso de lquido se
retira
colocando
papel
de
filtro
en
los
bordes.
Posteriormente se realiza la tincin negativa con una solucin de fosfotungstato
de potasio al 2% y pH 6,8. Para ello se coloca una gota del contrastante sobre el
papel parafinado y luego la rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella durante
cinco minutos. Las rejillas se observan en un microscopio electrnico de
transmisin. Para la observacin del botonamiento de partculas virales, se emplea:
una caja de plaqueo, a partir de la cual una porcin de agar, localizada sobre una
placa en la monocapa de clulas, se retira y fija con glutaraldehido al 2% en buffer
fosfato pH 7,4 y posfija. Despus del proceso de deshidratacin en concentraciones
ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina LR-White . Se realizan
cortes ultrafinos de 40 nm. que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de
plomo para su posterior observacin en el microscopio electrnico de transmisin.

4.

Ventajas

desventajas.

Los elevados costos de los equipos y la debida adecuacin de una infraestructura

para el buen funcionamiento hacen que esta tcnica , se convierten en acceso de
investigadores privilegiados . Si embargo, es comn contratar estos servicios por
horas
o
por
fotografas
requeridas.
Los costos de reactivos tambin dan un factor decisivo para la eleccin de esta
tcnica. Aun cuando este proceso de investigacin sea costoso , proporciona
resultados
muy
precisos
de
amplia
resolucin
y
magnificacin.
La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos,
pero son vulnerables y variados al tipo de investigacin que se realice ,contando
mas
con
la
experiencia
del
investigador.
La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibracin.
Nuevamente encontrar las condiciones ptimas requiere de un proceso tedioso y
prolongado.
La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de
los
mismos.
Las imgenes obtenidas son moncromticas y planas siendo necesario, en algunos
casos, un tratamiento posterior mediante anlisis de imgenes con un software
especializado.

El microscopio electrnico de transmisin

proyecta electrones a travs de una muestra
muy delgada de tejido para producir una imagen
bidimencional en una pantalla fosforescente. La
nitidez de un rea particular de la imagen es
proporcional al nmero de electrones que son
transmitidos a travs de la muestra (Bozzula y
Bartlerr,
1997).http://www.luton.ac.uk/Healthcare/Ross/MITOCHO
N
.HTM
This famous first electron
micrograph of an intact cell was
published in The Journal of
Experimental Medicine in March
1945, in "A study of tissue culture
cells by electron microscopy," by
Keith R. Porter, Albert Claude, and
Ernest F. Fullam. The cell is a
cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on
polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was
fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation
in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times, this first
electron micrograph of a cell reveals mitochondria, the Golgi apparatus and a "lacelike reticulum" which Porter later named the "endoplasmic reticulum". The electron
microsope used for this historic image was an RCA EMB model, operated by Fullam
at
the
Interchemical
Corporation
in
New
York

City.http://www.rockefeller.edu/rucal/journey/journey.html

Literatura
Duve

Christin,

recomendada
1988.

La

clula

viva.

Editorial

Labor.

Madrid,

Espaa.

pg.

11.

Bozzula and Bartlerr. 1997. Electron microscopy. Principles and tecniques for biologists. Jones and Bartlett
Publishers.

London,

UK.

pp.

2-

36.

1. Cecil, E. 1970. Microscopia Electrnica. Editorial Ediciones Urmo. Mc Graw- Hill Barcelona,Espaa pg 2355,203-266,315-370.
2. Lopez, J. 1972. Fundamentos de la Ciencia y Tcnicas del Vaco. de. Aguilar. /Impreso Madrid Espaa. Pg 92109.
3. Tipler. P. 2000. Fsica ,Quinta Ed. Editorial Reverte /Imprenta Barcelona Espaa.pg 1061-1093, 1101-1163.
4. http://emc.brol.sc.edu/
5. http://www.uq.02.av/nanoworld/nanohome.html
6. http://www.amc.anl.gov/

7.Anderson, R., Mascorro, J. ,Anderson , D. 2002 Diseo por microscopia en instrumentacin analtica Volumen
(10)

numero

6.

8.Matthias, R., Matthias, G. , Schemmel, A. 1998. La estabilidad mecnica de la microscopia electrnica

Biophisical journal. Volumen (75) pg 3008-3014.