Lowry-1 (Farmacia)

VALORACION DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY

1.- FUNDAMENTO TERICO

El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las

protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas,
siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de
Lambert-Beer A= .l.c
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul
claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin.
El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico,
de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul
intenso.

Reaccin entre la protena y los reactivos

BIBLIOGRAFA
O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
 Lowry-2 (Farmacia)

2.- MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
.- Tubos de ensayo
-.- Tubos Falcon (50 mL)
.- Pipetas
.- Colormetro
.- Cubetas de colormetro
.- Agitadores de tubos
Reactivos
- Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M
- Reactivo B1: CuSO4 5H2O al 1%
- Reactivo B2: tartrato sdico-potsico al 2%
- Reactivo C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen)
- Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4
- Solucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL)
- Muestra problema

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Para determinar la concentracin de protenas de la muestra problema se construye una curva
patrn o de calibrado a partir de una solucin patrn (BSA) (2 mg/mL). La concentracin que tienen
las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn.
El tubo 0, que slo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del
colormetro a cero de absorbancia.
Pasos a seguir:
a) Numerar del 0 al 6, tubos de plstico de 10 mL
b) Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y solucin problema sealadas en la
tabla.
c) Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2
d) Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15
minutos en oscuridad (dentro de la taquilla).
e) A continuacin aadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien por
agitacin. Dejar reposar 30 minutos en la oscuridad para que as se desarrolle completamente la
reaccin coloreada.
f) Leer las absorbancias en el colormetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a
Absorbancia=0 con el blanco (tubo n 0); de esa forma slo se mide el color producido por las
protenas, puesto que se resta el color debido a los reactivos. Anotar la medida de absorbancia en la
tabla.

Tubo Agua Patrn problema Reactivo C Folin diluido Abs.580nm [protenas]

(2 mg/mL
0 1,0 mL mg/mL)
-- -- 5 mL 0,5 mL
1 0,9 mL 0,1 mL -- 5 mL 0,5 mL
2 0,8 mL 0,2 mL -- 5 mL 0,5 mL
3 0,7 mL 0,3 mL -- 5 mL 0,5 mL
4 0,6 mL 0,4 mL -- 5 mL 0,5 mL
5 0,7 mL -- 0,3 mL 5 mL 0,5 mL
6 0,5 mL -- 0,5 mL 5 mL 0,5 mL
 Lowry-3 (Farmacia)

4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

4.1.- Determinar la concentracin de protenas de la curva patrn (tubos 1 a 4), expresada en mg/mL,
y anotar el resultado en la tabla.

4.2.- Curva patrn: Representar, en papel milimetrado, la absorbancia frente a la concentracin de

protenas de los tubos 1 a 4.

4.3.- Determinar la concentracin de protenas de los tubos 5 y 6, expresada en mg/mL.

4.4.- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema, expresada en mg/mL.

5.- CUESTIONES

5.1.- Cmo debera ser la concentracin de protenas de los tubos 5 y 6?. Igual o diferente?
Comentarlo.

5.2.- La relacin entre absorbancias y concentracin de protenas se mantiene lineal aunque se

incremente mucho la concentracin? Haga un comentario al respecto.

5.3.- Observaciones a la prctica.