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eq_8_cuantificacion_y_aislamiento_de_microorganismos_microbiologia

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1

LORETO PEREZ ANA LAURA VELASCO DE MATA JOSE DARIO

ARGUELLA CANCHOLA MARIO
ROJAS MORALES ALBERTO
1602 2

Unidades formadoras de colonias (UFC): bacteria o agrupación de

bacterias viables que forman una colonia visible.

Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia.

Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana,

proveniente de una sola célula.
Cultivo

contaminado: cultivo bacteriano microorganismos extraños no deseados.

colonizado

por

Cultivo mixto: cultivo en laboratorio que contiene dos o más cepas

de organismos.
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Aislamiento de microorganismos
 Separación de microorganismos presentes en una población

mixta puede lograrse de varias maneras: separando a los microorganismos -físicamente mediante diluciones o por agotamiento de un pequeño inoculo en un medio de cultivo sólido: utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir a los microorganismos no deseados y aprovechamiento de características

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4

CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS
 numerosos métodos que permiten establecer el

número de microorganismos en una muestra dada. Algunos métodos cuantifican el número de células, otros cuantifican la masa total de la población (la cual con frecuencia directamente proporcional al número de células).

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Clasificación de métodos para el conteo de microorganismos.
Muestra

Concentración o dilución

Recuento total (viable y no viable) -métodos directos: a)cuenta al microscopio, b)contadores electrónicos. c)filtracion -métodos indirectos: turbidimetría Recuento de viables (directos) -En placa (UFC)* -En tubo (NMP) **

*UFC= unidades formadoras de colonias

**NMP= número más probable

Curva patrón (absorbancia vs. células viables) Recuentos en placas Estandarización de McFarland Luz transmitida

 Suspensiones coloidales  Cantidad de luz

 Turbidimetría y nefelometría

Nefelometría
 Mide la luz difractada  Nefelómetro

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VENTAJAS
 La turbidimetría puede

DESVENTAJAS
 Para densidades microbianas

realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta.  La fuente de radiación más frecuentemente usadas es la lámpara de wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación visible.

bajas; de microorganismos unicelulares y tamaños de unos cuantos micrómetros  Para microorganismos mas grandes y productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada

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•Método de Breed •Recuento en cámara de Petroff-Hauser
•Contador de Coulter

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Método de Breed (1911)
 Un volumen conocido de muestra es extendido sobre

un cuadrado de 1 cm (1 a 4 cm) de lado de un portaobjeto. Posteriormente, la muestra es secada, fijada y teñida y se determina el número de microorganismos en varios campos del microscopio. Conociendo el área de los campos del microscopio es posible determinar el número total de microorganismos.

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1

2,3

4,5

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Determinar la superficie del campo microscópico

Metodo de Breed
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Ventajas
 Simple, facil ,eficaz
 Se puede utilizar un microscopio de

Desventajas
 cuando las poblaciones son

pequeñas, el margen de error es fluorescencia, en el cual se utilizara grande un colorante distinto (fluorenscente) como el azul de anilina modificado.  Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de  Las celulas viables se pueden muestras diferenciar de las no viables, para eso
se puede usar la naranja de acridina (0,01%).  no requiere de un equipo caro

Staphyllococcus aureus
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 La muestra es distribuida en un volumen conocido de

una cámara de recuento. El número de microorganismos presentes en un área definida de la cámara de recuento multiplicado por el factor apropiado, determina el número total de microorganismos presentes en la muestra.

METODO DE PETROFFHAUSER

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20

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21

Para evitar la cuantificación de las mismas células dos veces omitir los microorganismos ubicados en la líneas de la parte superior izquierda de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son considerados en los cuadros superior y derecho adyacentes
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Ventajas
 bastante exacto cuando se

Desventajas
 Es muy tedioso, no es

trabaja con •nuestras que contienen poblaciones abundantes  no requiere de un equipo caro, tan sólo se necesita una cámara de recuento  puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas

práctico para un gran número de muestras  No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bact/ml para que sean observadas al microscopio  No distinguen células vivas de muertas

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Contador de Coulter
 El contador de Coulter está basado

en la determinación de la resistencia eléctrica de un medio de cultivo líquido al pasar a través de un orificio. Al pasar una célula, la resistencia aumenta bruscamente y dicho aumento es registrado por un dispositivo electrónico. Es posible determinar el número de partículas y su tamaño.

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ventajas
 fácil y rápido, muy sensible.

desventajas
 no distingue entre

microorganismos viables, muertos o partículas

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The coulter counter

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Recuento en placa Fuentes de error en el recuento en placa.
El número de colonias que se obtiene en una determinación de viables depende: Por  tamaño del inoculo. extensión  El medio de cultivo. Siembra por vertido en placa  Condiciones de incubación.

Por diluciones seriadas Asa calibrada

Miles Misra
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 Recuento en placa
Método de extensión en placa

La muestra (0.1mL o menos). Se pipetea sobre la superficie de la placa con agar

La muestra se extiende uniformemente sobre la superficie del agar usando una asa de vidrio estéril

Resultado típico de la siembra por extensión UFC/mL

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Recuento en placa -por extensión

Ventajas

Desventajas

La técnica es rápida
barato

Tiempo de incubación
Uniformidad en la extensión de los microorganismos

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 Método del vertido en placa

La muestra se pipetea en la placa estéril

Se añade medio estéril y se mezcla bien con el inóculo

Resultado típico del vertido en placa
UFC/mL

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Recuento en placa -siembra por vertido en placa

Ventajas

Desventajas

Poco material Poca muestra

Tiempo de incubación

No hay dilución

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promedio de colonias X el factor de dilución= UFC/mL

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Recuento en placa -por diluciones seriadas

Desventajas
Temperatura del medio de cultivo Preparación de las diluciones Material Tiempo de incubación y técnica Restricción del conteo (entre 30 a 300 colonias) Procesamiento de la muestra

ventajas
Muy sensible

Permite detectar pocos microorganismos /ml

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Recuento en placa -asa calibrada
Técnica:  Muestra liquida concentrada homogenizada  Utilizar una asa que dispensa un volumen conocido  Realizar siembra en masivo (estriado cerrado) en el medio de cultivo.  Incubar  Contar colonias Número de colonias X el factor de dilución
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Recuento en placa - asa calibrada

Ventajas La técnica es rápida No hay restricción para el conteo

Desventajas Tiempo de incubación Uniformidad en la extensión de los microorganismos

Poca muestra
barato

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METODO DE GOTA O DE MILES MISRA
Se emplean pipetas Pasteur previamente calibradas. Desengrasar con cloroformo Se comprueba su exactitud. Se liberan de 48 a 52 gotas por mL. Colocar un número determinado de gotas de la muestra diluida sobre las placas de agar seco, después de que las gotas son absorbidas por el agar . se invierten las placas y se incuban.

RECUENTO POR FILTRO DE MEMBRANA
Es viable Útil para establecer el número de microorganismos en muestras que contengan una población muy reducida. Los volúmenes grandes de aire o liquido se filtran a través de una membrana porosa en donde se concentran los microorganismos.

RECUENTO POR FILTRO DE MEMBRANA
 Filtro de membrana (0.2 μm o 0.45 | μm)  Cultivo sólido.

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Colonias bacterianas desarrolladas sobre un filtro de membrana
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VENTAJAS
 Proporciona

DESVENTAJAS
recuentos
 Interfieren los altos niveles de

directos
 Rápido y fácil de realizar

turbiedad

Método NMP
Bacterias coliformes en agua Tablas estadísticas.

Bajas concentraciones (leche y agua)
Tamaño de poblaciones. Viables

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Referencias
1. Food Safety Lessons: Lesson One (page 8 of 10) [Internet]. [cited 2009 Sep 5] Available from: http://www.extension.iastate.edu/foodsafety/lesson/L1/L1p8.html

1. Gustavo Gini [Internet]. [cited 2009 Sep 5] Available from: http://www.uvg.edu.gt/dti/profesores/ggini/bacteriologia/bacteriologia.htm

1.Manual

de prácticas de Microbiología ... - Google Libros [Internet]. [cited 2009 Sep 5] Available from: http://books.google.es/books?id=OykG04ClBUC&pg=PA31&lpg=PA31&dq=METODO+DE+BREED+DE+BACTERIAS&sour ce=bl&ots=jYPrHBHPhk&sig=OBGTtOT_iF5ME5qk9DciTM0Y_U&hl=es&ei=AceiSoX1J8Otgeo0rXTDw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=8#v=onepage&q=&f=false

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48

1.Microbiologia de Alimentos: Practica nº 02-Recuento total de microorganismos (Metodo de Breed) [Internet]. [cited 2009 Sep 5] Available from: http://www.scribd.com/doc/6455097/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n02Recuento-total-de-microorganismos-Metodo-de-Breed

1.Madigan M. Brock biología de los microorganismos. 10º ed. México: Prentice Hall Hispanoamericana; 2004.

1. Crecimiento [Internet]. [cited 2009 Sep 7] Available from: http://www.geocities.com/roberto_raul/crecimiento.html

http://www.ual.es/Universidad/Depar/microbiologia/Docencia/MICR/Conten idos/PP/P06/TraP06.pdf
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1. untitled [Internet]. [cited 2009 Sep 7] Available from: http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/doc umen/uni_02/58/texthtml/cap804.htm

1. Microbiología - Google Libros [Internet]. [cited 2009 Sep 7] Available from: http://books.google.es/books?id=2u6Q2XCMDgC&pg=PA200&lpg=PA200&dq=camaras+de+recuento+para+bacterias&source =bl&ots=4SigmerDTw&sig=LQeILA6ElnlXJTByOA4xciUYtIg&hl=es&ei=u-iSv2MEJaJtgeMlcn3Dw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=5#v=onepage&q=&f=fal se

1. técnicas de contaje celular [Internet]. [cited 2009 Sep 7] Available from: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm

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50

1. MEDCICLOPEDIA: DICCIONARIO ILUSTRADO DE TÉRMINOS MÉDICOS [Internet]. [cited 2009 Sep 8] Available from: http://www.iqb.es/diccio/c/cultivo.htm

1. Microbiolgy :: Microbes everywhere [Internet]. [cited 2009 Sep 8] Available from: http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=Book&func=displayarticl e&art_id=105

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Método de Breed (1911)
1.
2. 3.

4.

5. 6.

En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2 , invertir el portaobjetos Homogeneizar el tubo o matraz con el cultivo problema. Tomar 0.01 mL del cultivo y transferirlo al portaobjetos previamente marcado, extendiendo la muestra en el área marcada con el asa de platino estéril. Dejar secar al aire y fijar. Cubrir el frote con solución de azul de metileno de Lóeffler durante 2 min. Lavar con agua y dejar secar al aire.

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7. Determinar la superficie del campo microscópico, aplicando la

siguiente fórmula: 8. r2 en cm X 3.1416 = Superficie de campo microscópico en cm 9. 7 Determinar el número de campos microscópicos que existen en la preparación con la siguiente fórmula:

Superficie de la preparación Superficie del campo microscópico

Número de campos microscópicos

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Calcular el número de microorganismos que hay en la preparación (0.01 ml) y en 1.0 ml del cultivo, mediante la siguiente fórmula:

Numero de microorganismos

Numero de campos en el microscopio

Numero de microorganismos en la preparación

100

Numero de microorganismos /ml de cultivo

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 En condiciones de asepsia, colocar en el área hundida de la

plataforma de Petroff-Hauser, una gota y extenderla rápidamente. Pequeños excesos del cultivo, se acumulan en los canales de la orilla de la plataforma; en el caso de que éstos se inunden totalmente (el cubreobjetos no reposará al nivel de la superficie), limpiar la cámara y repetir el procedimiento.  Coloque el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X.  Cuente las células en cuadros individuales  Cuente cuando menos 10 campos para obtener coeficientes de variación de 10%
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Aplique la siguiente fórmula y calcular el número de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra original.

1
Volumen del cuadro

Promedio del numero de microorganismos contados

Factor de dilución

Microorganismos por ml de la muestra original

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