PEREZ COTA ELIZABETH ZULEMA

PROFESOR VICTOR MANUEL ALFARO LOPEZ

GRUPO 2LM
OPERAR EQUIPO Y MATERAL DE LABORATORIO
TAREA #2 CAMARA DE NEUBAUER

Recuento de eritrocitos: ejemplo

Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y
linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras
que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. Ten en cuenta que la grilla
central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de
dilución es por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos contados en 5 cuadrados a
nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (microlitro) = 1 mm3 )
Como se hace?

La imagen de abajo simula el campo que esta viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo es
visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de
arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los
cinco cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento de eritrocitos como se ha
descrito anteriormente..
Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda,
entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o
de la derecha..
El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:

Mujeres: 3.9-5.6 millones/µl

Hombres: 4.5-6.5 millones/µl

Determine el recuento del sujeto cuya muestra aparece en la imagen.

Cual es la solución?
 Técnicas de estudio de líneas celulares
TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas
en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión
como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente
simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la
empresa Beckman-Coulter.

El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia

eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un
electrolito atraviesa un pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una
pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las
partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio
desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un
pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula.
controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible
contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de
partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.

En la unidad de Citometría de flujo y Microscopia Confocal de los Servicios Científico-Técnicos de la

Universidad de Barcelona se dispone de contadores celulares.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta
con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de
contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo
presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio
el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la
suspensión de origen.
 La cámara de Neubauer es una cámara de contaje
adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste
de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en
el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda
de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la
imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación
entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área
sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro
cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la
superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido
entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro
cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la
concentración en la suspensión celular será :
concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de
las regiones marcadas como L y que en el microscopio
se ven como una cuadrícula de 16 pequeños
cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha
sido tomada empleando un microscopio invertido de
contraste de fases.
 Existen numerosos modelos de cámaras de contaje
celular adaptadas a su uso en microscopía. En la
imagen puedes observar una cámara de Neubauer
doble, como las que usas en el laboratorio de
prácticas.

Para determinar la viabilidad celular se emplean

diferentes métodos. El más común es el de tinción con
azul tripán. El azul tripán es un coloide que se
introduce en el interior de las células que presentan
roturas en la membrana. Así pues las células que
aparecen en la imagen, claramente de color azul, son
consideradas no viables. Asimilar células blancas, por
exclusión, a células viables es un error pues por este
método se sobrevalora la viabilidad de las células en la
suspensión, determinando como inviables sólo
aquellas con la membrana rota. Existen otros métodos
de determinación de la viabilidad celular como el más
preciso de la tinción con ioduro de propidio
En la red dispones de descripciones detalladas sobre como utilizar un hemocitómetro, como la propuesta
por P.J. Hansen, o la detallada descripción que aporta Beckton-Dickinson, y los problemas de cálculo de
parámetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un hemocitómetro, y otros
protocolos para el contaje de células (en protocol-online)
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Material docente diseñado y elaborado por Manuel Reina. Última actualización : . Comentarios : mreina@ub.edu

se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca

al aire o con algodón. Se coge entre el pulgar y
el índice y se hace una punción rápida y
penetrante a través de la piel de la punta del
dedo con una lanceta estéril.
2. Se deshecha la primera gota de sangre y se
aspira la siguiente con la pipeta de dilución
perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o
0.5 (también puede utilizarse la pipeta de
hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar
la entrada de burbujas de aire, pudiendo
ayudarnos de un papel de filtro para conseguir el
enrasado.

3. A continuación se toma con la pipeta líquido

de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la
señal 1; así, la sangre queda diluida al 1/10, si
tomamos sangre hasta la señal 1, o al 1/20 si
tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el
volumen de la bola de la pipeta es 100 veces
superior al del capilar de la misma. (Si hemos
utilizado la pipeta de hemoglobina podemos
diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido de
Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).

4. Tomamos la pipeta (o el tubo de ensayo) entre

los dedos índice y pulgar y agitamos. A través
de la goma de conexión con la pipeta, soplamos
para despreciar las primeras gotas por
corresponder al líquido que estaba en el capilar.

5. Se adapta un cubreobjetos sobre una cámara

cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una
gota en uno de los lados del cubre; esta gota
penetra por capilaridad y rellena el retículo de la
misma.
6. Una vez preparada la cámara se coloca sobre
la platina del microscopio dejándose unos
minutos en reposo para que sedimenten los
glóbulos. Disponemos el condensador bajo y luz
débil; enfocamos primero con el objetivo débil
seco y luego se cambia al fuerte seco para
proceder al recuento, que se lleva a cabo en los
cuadrados pequeños del retículo marcado en
color rojo. Finalizado el recuento se procede a la
limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua
destilada y alcohol-éter sucesivamente.

7.El volumen de sangre en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad
de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados
contados.
Con cámara de NEUBAUER: Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el número de glóbulos por cuadrado
será a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X. Luego:

siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200
respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos
rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).
 Se utilizan para
calcular,
mediante el
uso del
microscopio, el
número de
partículas
(leucocitos,
hematíes,
bacterias…) por
unidad de
voluimen de un
líquido.

La cámara está

constituida por

una placa base

de vidrio

especial pareciso a un porta, su parte central se encuentra separada de los extremos por unas

ranuras. en ella se encuentran las cuadrículas de recuento.

La fórmula de contaje es: partículas/mm3= partículas contadas.

Clases de cámaras:

- Neubauer improved: Es el más utilizado (9 cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)

- Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.

- Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.

- Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para recuento de células en líquidos orgánicos (LCR,

Líquido sinovial…)