Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias
Departamento de Qumica
Qumica de pigmentos naturales

Proyecto especial: Extraccin y separacin de pigmentos de

espinaca (Spinacia oleracea L.) por cromatografa de papel
Juan Nicols Len Ruiz a; Christian Fernando Gmez Herrera b
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Lab-Project: Pigment extraction and separation from spinach
(Spinacia oleracea L.) by paper chromatography

1. Objetivos universitario. Es ampliamente valorada por

1.1. Objetivo general
Separar y estudiar los pigmentos
presentes en la espinaca por medio de
cromatografa de papel.
1.2. Objetivos especficos
- Separar los 4 tipos de pigmentos
contenidos en la espinaca (xantofilas,
carotenos, clorofila a y clorofila b).
- Calcular los valores de Rf para cada
pigmento.
2. Marco Terico
2.1. Introduccin
La cromatografa es la tcnica fsica de
separacin ms ampliamente utilizada para
determinar pigmentos en plantas. El trmino
fue acuado en 1906 por Tswett cuando
separaba pigmentos vegetales en una
columna de carbonato de calcio. Luego del
desarrollo de la cromatografa de particin de
Martin y Synge (Premio Nobel 1952), vino la
utilizacin de trozos de papel en lugar de
columnas como se vena haciendo, dando
origen a la cromatografa sobre papel descrita
por Condensen, Gordon y Martin en 1944
[1]. La separacin mediante cromatografa
sobre papel de pigmentos fotosintticos en
general, y los de la espinaca particularmente,
es una actividad experimental clsica en los
laboratorios a nivel bsico como
su utilidad, sencillez y economa.
2.2. Cromatografa de papel
De acuerdo con la IUPAC, la cromatografa
se define como un mtodo fsico de
separacin mediante el cual los
componentes de una mezcla se separan por
distribucin entre dos fases: una estacionaria
y otra mvil [2]. El proceso de separacin
de cada sustancia es el resultado de un
equilibrio entre dos conjuntos de fuerzas
contrapuestas: las de propulsin,
promovidas por el flujo de la fase mvil y
las de retencin, originadas por la fase
estacionaria [3,4]. De este modo, cada
sustancia migra de forma diferencial,
conforme a sus propias caractersticas
fsicas y al tipo de fuerzas intermoleculares
que pueda establecer con ambas fases.
2.3. Separacin de pigmentos
Los pigmentos de las plantas superiores
estn representados por las clorofilas a y b,
y un amplio grupo de sustancias
denominadas carotenoides, que se dividen
en carotenos y xantofilas [5]. Las molculas
de clorofila poseen un tomo central de Mg
contenido en un anillo de porfirina junto a
un alcohol insaturado llamado fitol (Figura
1). Amabas estructuras solo difieren en el
sustituyente del carbono C-3. Mientras que
la clorofila a, posee un grupo metilo (-CH 3),
la b dispone de un grupo formilo (-CHO).
Esta sutil diferencia no solo genera cambios
en la coloracin, (un verde azulado para la
clorofila a y un verde amarillento claro para
la b) sino que tambin aumenta la polaridad
de la clorofila a sobre la clorofila b [6].
Figura 1. Estructura de las clorofilas a y b.
La diferencia entre ambas radica en el
sustituyente (R) del carbono C-3. La
polaridad de la molcula est dada por el
ncleo tetrapirrlico mientras que su
naturaleza hidrofbica, esta originada por la
presencia de la cadena larga de fitol.
Los carotenos son hidrocarburos que
contienen nicamente hidrogeno y carbono,
son solubles en disolventes no polares,
poseen coloraciones que van desde el
amarillo hasta el anaranjado y los ms
abundantes son el -caroteno y el -caroteno.
Las xantofilas, por su parte, son derivados
oxigenados de los carotenos, son solubles en
alcohol, con coloraciones generalmente
amarillas y las ms abundantes son la lutena
y las violaxantina (Figura 2) [7].
Debido a las diferentes solubilidades que
presentan estos pigmentos en los disolventes
orgnicos, es muy usual que en los guiones
de prcticas y algunos textos se tome como
parmetro esa diferencia para explicar su
separacin mediante cromatografa sobre
papel, lo cual es un error [8].
En efecto, esta idea asociada al concepto de
un proceso de separacin como una autentica
particin, donde la diferencia de solubilidad
de una sustancia con respecto a las dos fases
lquidas condiciona su retencin o su
movilidad, no es correcta para el caso de la
Figura 2. Principales carotenos y xantofilas
presentes en los pigmentos fotosintticos
hallados en plantas superiores.
separacin de estos pigmentos, puesto que
de ser as, ninguno se podra separar, dado
que todos son hidrofbicos y con
solubilidades semejantes entre miembros de
una misma clase [4]. La separacin de los
pigmentos fotosintticos mediante
cromatografa sobre papel transcurre
fundamentalmente, a travs de un
mecanismo de adsorcin fsica (fenmeno
superficial diferente al de absorcin), donde
se establecen una serie de equilibrio de
adsorcin-desorcin que dependen de la
polaridad de cada pigmento y del tipo de
fuerzas intermoleculares que puedan
establecer con los hidroxilos libres de la
celulosa del papel y con la estructura del
disolvente de las fase mvil. As, la clorofila
b, ms polar que la clorofila a, se adsorbe
ms intensamente y presenta, por tanto, un
valor de Rf menor. Los carotenoides en
cambio, son hidrocarburos, y aunque la
deslocalizacin de los electrones pi de sus
estructuras le otorguen una mayor
preponderancia de fuerzas del tipo Van der
Waals [9], no son lo suficientemente fuertes
como para interactuar con la estructura del
papel, por lo que quedan disueltos en la fase
mvil y arrastrados por ella, presentando en
consecuencia, un Rf mayor.
2.4. Extraccin de pigmentos
Si bien se han descritos mltiples
procedimientos y disolventes, la extraccin
directa con acetona es muy utilizada debido
a su polaridad, escasa selectividad y amplio
margen de solubilidad [10]. El proceso de
extraccin debe ser rpido, en un ambiente
fresco, con luz tenue y evitando disgregar la
muestra con el disolvente, para no propiciar
la formacin de compuestos de degradacin
[4]. Mientras que los carotenoides son
bastante estables y solo se han descrito
oxidaciones e isomerizaciones posteriores al
desarrollo de la cromatografa [7], las
clorofilas, son muy lbiles, se degradan por
el calor, los cidos y por accin de la enzima
clorofilasa del propio tejido vegetal. En
medio dbilmente cido, se transforma
fcilmente en feofitina a y b, sustancias de
color pardo oliva en las cuales se ha
sustituido el Mg por dos tomos de
hidrogeno [4, 6, 7]. La aparicin de estos
compuestos durante el desarrollo de la
cromatografa suele ser objeto de confusin,
puesto que interfieren en el cromatograma y
no son representativos del contenido
pigmentario. Son compuestos de
degradacin que se forman principalmente
durante la coccin y el procesado de los
alimentos [6], y en el caso de las prcticas
de laboratorio, especialmente al disgregar la
muestra, los cidos presentes en el vegetal
catalizan su formacin. Por ello, es muy
importante que el procedimiento de
extraccin sea rpido y que la muestra se
disgregue en presencia de sales de magnesio
como MgCO3 o MgSO4, las cuales protegen
electrostticamente a la molcula de
clorofila y absorben al mismo tiempo el
agua presente en las hojas, optimizando el
proceso global [11].
2.5. Saturacin de la cmara de
cromatografa, equilibrio del papel y
condiciones de desarrollo.
Las cmaras para cromatografa deben 3. Mtodos
saturarse con el eluyente durante unos 30
minutos, a fin de evitar que el mismo se
evapore del papel durante el proceso de
desarrollo. Si esto llega a ocurrir, el aporte
de la fase mvil al frente del eluyente puede
ser insuficiente para la separacin de las
sustancias [12]. Como las alteraciones
fotoqumicas se aceleran cuando los
pigmentos estn adsorbidos en las
superficies cromatografas [4], es
importante que la cmara de cromatografa
se proteja de la luz usando papel aluminio o
una funda oscura.
2.6. Eleccin del eluyente
A pesar de que es una de las variables ms
importantes de todas, nunca se ha podido
describir un nico eluyente que pueda
separar de forma ptima todos los
pigmentos, debido a sus diferentes
polaridades. No obstante, con mezclas que
contengan uno o varios disolventes no
polares con una pequea proporcin de uno
polar, se pueden separar e identificar los
ms representativos [13]. Aunque las
mezclas pueden ser muchas, los criterios de
toxicidad, inflamabilidad y economa deben
primar en la seleccin.
2.7. Tipo de papeles para
cromatografa
Es importante la eleccin del papel, puesto
que del grosor y de la porosidad del papel
depender la velocidad del desarrollo y la
resolucin. Aunque los papeles de filtro
estndar son muy utilizados, son
recomendable los de calidad controlada
como los Whatman No.1 o similar para
fines analticos y los 3MM para fines
preparativos. Estos ltimos, al ser ms
gruesos, permiten aplicar una mayor
cantidad de muestra y aunque el tiempo de
desarrollo es mayor, posibilitan una mejor
resolucin. Deben cortarse en lo posible, en
el sentido de formacin de la hoja
(usualmente viene marcado), ya que la
velocidad de desplazamiento del eluyente
es distinta en la direccin de la fibra
perpendicular a ella [14].
3.1. Protocolo de experimentacin
La experiencia que planteamos desarrollar
es la extraccin de pigmentos fotosintticos
de muestras de espinaca fresca (Spinacia
oleracea L.), en extraccin directa por
 elucin ascendente con una mezcla de
hexano-acetona (8.5:1.5 v/v).
3.2. Materiales y reactivos
- Hojas de espinaca fresca.
- MgSO4
- 40 mL de hexano-acetona (8,5:1.5 v/v,
es decir 34 mL de hexano mezclados
con 6 mL de acetona).
- Papel Whatman No.1 o similar.
- Frasco de vidrio o cmara de
cromatografa.
- Capilares de vidrio.
3.3. Procedimiento
El procedimiento a desarrollar ser el
siguiente:
Obtenidos los pigmentos separados, se proceder
a realizar anlisis de sus valores de Rf y
respectiva identificacin.
4. Referencias
[1]. G. Lopez Cueto. Leccin
inaugural ciclo lectivo 2004/5.
Universidad de Alicante. Espaa.
2004.
[2]. IUPAC. Pure Appl. Chem. 1993,
65, 819-872.
[3]. J. Sherman, G. Zweig,
Handbook of Chromatography. Vol.
II. CRC Press. USA. 1972.
[4]. I. Smith, J. G. Feinberg.
Cormatografa sobre papel y capa
fina. Alambra. Espaa. 1979.
[5]. H. Curtis, S. Barnes, Biologa,
Medica Panamericana. Buenos
Aires. 2005.
[6]. S. J. Shcwartz, T. V. Lorenzo.
Food Sci. Nutr. 1990, 29 (1), 1-17.
[7]. H. Strain, J. Sherman. J. Chem.
Educ. 1969, 46 (8), 476-483.
[8]. P. Maitland, D. Maitland. J. Biol.
Educ, 2002, 37 (1), 6-8.
[9]. D. Pavia, G. Lampman, G. Kris,
R. Engel, Microscale and
Macroscale Techniques in the
Organic Laboratory. Harcourt
Collage Publishers. USA. 2002.
[10]. M.C. Rodriguez Dodero, I.
Moreno Garrido. An. Quim. 2002, 3,
34-39.
[11]. H. Quach, R. Steeper, W.
Griffin. J. Chem. Educ. 2004, 81 (3),
385-387.
[12]. A. Braithwaite, F. Smith,
Chromatographic Methods 5th Ed.
Kluwer Academic Publisher. 2001.
[13]. Z. Sestak. Chromatographic
Reviews. 1959, 65-97.
[14]. D. R. Browning.
Cromatografa. Toray Masson.
Barcelona. 1971.