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Estudio cintico de la ureasa

Jessica Gonzlez Torres


Christian Fernando Gmez Herrera
Objetivos

Obtencin de un extracto crudo de ureasa, a partir de


harina de soya.
Purificacin parcial de la ureasa en el extracto crudo.
Determinacin de la actividad enzimtica, a partir de
la medicin de hidrxido de amonio liberado desde la
reaccin de hidrlisis, empleando urea como sustrato.
Determinacin del tiempo ptimo de incubacin y
medicin de la velocidad inicial.
Objetivos

Determinacin del efecto de la temperatura, el pH, y la


concentracin de sustrato en la velocidad de reaccin.
Determinacin del efecto de un inhibidor en la
velocidad de reaccin.
Determinacin del efecto de un inmovilizador en la
velocidad de reaccin.
Determinacin de los principales parmetros cinticos.
Introduccin

E.C. 3.5.1.5
Hidrolasa
Conversin de urea en NH3 + CO2
Se encuentra en bacterias,
plantas, algas, hongos,
invertebrados y suelos.
Cofactor Ni2+
Primera protena en ser
caracterizada por difraccin de
rayos X.
Introduccin

Propiedades de la ureasa:
Temeperatura ptima: 30C
Tiempo ptimo incubacin: 60 s
Km =36,49 mM
Vmax = 87,72 U/g
pH ptimo: 7,4
Inhibidores: Metales pesados (Hg2+)
Reaccin principal

(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3


Mtodos de cuantificacin

Mtodo de Berthelot
Mtodo de Nessler
Valoracin cido-base
Reaccin de Berthelot

Curva de calibracin: NH4Cl (630 nm).


Reaccin de Nessler

NH4+ + 2[HgI4]2 + 4OH HgOHg(NH2)I + 7I + 3H2O

Curva de calibracin: NH4Cl, (NH4)2SO4 (405 nm)


Purificacin

Precipitacin con
acetona enfriada.
Cromatografa de
intercambio inico.
(DEAE-Celulosa)
Cromatografa por
filtracin en gel
Inmovilizacin

Alginato de sodio en
perlas
Inhibicin enzimtica

Se ha encontrado que la ureasa es altamente sensible


a cantidades traza de metales pesados. Los reportes
disponibles describen inhibicin por metales alcalinos.
La serie reportada de cationes inhibidores de ureasa
es: Ag+, Hg2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ni2+ > Co2+ > Fe2+ > Mn2+.
Ag+ y Hg2+ inactivan la ureasa completamente en el
rango de concentraciones hasta 10-6 M.
Metodologa
Harina de soya

Extracto crudo de
ureasa

Purificacin con Cromatografa DEAE- Cromatografa en gel


acetona celulosa

Tiempo Efecto del Efecto de Efecto de Efecto de Efecto del


ptimo pH la la la inhibidor
temperat concentra concentra
ura cin de cin de
enzima sustrato

Inmovilizacin en
alginato

Mtodo de Mtodo de Nessler Valoracin cido-


Berthelot base
Resultados esperados
Referencias

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