CUANTIFICACIN DE CONCENTRACIN DE PROTENAS POR BCA

Utilizamos : Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)

1-Preparacin de reactivo BCA
En 1 tubo de 10 ml , mezclamos Reagent A y Reagent B del kit, en la siguiente
proporcin :
50 l Reagent A / 1 l Reagent B
Utilizamos placa de 96 pocillos
2- Preparacin de recta patron de BSA (Bovine Serum Albumin)
El patrn de BSA que viene con el kit tiene una concentracin de 2mg/ml. Ajustar el
volumen de BSA dependiendo de la concentracin del stock.
g BSA
0
1
2
5
10
15
20

BSA l
0
0.5
1
2.5
5
7.5
10

BCA l
100
100
100
100
100
100
100

Lo hacemos por triplicado para tener 3 lecturas

Esto se usa para generar una muestra patrn con g BSA en abscisas, y A562 en
ordenadas. La recta es buena si 0.98<R2<1
3- Preparacin de muestras a cuantificar (normalmente por triplicado, pero depende de
la cantidad de muestra que tengamos y la concentracin que estimemos a ojo: si
creemos que nuestra muestra est muy concentrada, se pueden hacer diluciones de uso
para medir, ej. 1:2, o 1:5, usando buffer de lisis para no cambiar la composicin, que
puede afectar a las medidas).
x l muestra + 100 l BCA
4- Incubar 30 minutos a 37 C , en estufa.
5- Lectura de valores de absorbancia en espectrofotmetro a =562 nm (algunos
espectrofotmetros adquieren a 560 nm, esa medida tambin vale).
6- Idealmente, interpolamos los valores obtenidos en la recta patrn (si no se pasan por
mucho, se puede extrapolar usando la frmula; si los valores se pasan por mucho, hay
que repetir la recta usando diluciones de los lisados).

7- La concentracin final en g /ml viene dada por la media de valores para un volumen
dado de muestra dividido entre los l de volumen.
Ej:

en 3 l de muestra, obtenemos unos valores por interpolacin de:

2.5 g
3 g
3.5 g

el valor medio de estas medidas es

2.5 + 3 + 3.5 = 3 g
3 medidas

3 g
= 1 g/l de protena en nuestro lisado
3 l muestra