Foodomics:

Fundamentos y Aplicaciones
Alejandro Cifuentes
Laboratory of Foodomics, IFI, CSIC
Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid
acifuentes@ifi.csic.es

if
i

Instituto de
Fermentaciones
Industriales

Barcelona, 2010

Objetivos
1.- Presentar los fundamentos
de Foodomics.
2.- Demostrar su potencial a travs de
diferentes aplicaciones.

ALGUNOS RETOS ACTUALES EN CIENCIA Y

TECNOLOGA DE ALIMENTOS
-Producccin de nuevos alimentos
funcionales (con base cientfica)
-Aproximacin global a la seguridad,
calidad y trazabilidad de alimentos
mediante el empleo de tcnicas micas
-Desarrollo, produccin y monitorizacin
de nuevos alimentos transgnicos
-Comprensin de los efectos de la interaccin
alimentos-genes sobre la salud (Nutrigenmica)
-Entender las diferentes respuestas de los individuos a los
alimentos: dietas personalizadas (Nutrigenetics)

Nuevos retos, nuevas respuestas: Foodomics

-Producccin de nuevos alimentos
funcionales (con base cientfica)
-Aproximacin global a la seguridad,
calidad y trazabilidad de alimentos
mediante el empleo de tcnicas micas
-Desarrollo, produccin y monitorizacin
de nuevos alimentos transgnicos
-Comprensin de los efectos de la interaccin
alimentos-genes sobre la salud (Nutrigenmica)
-Entender las diferentes respuestas de los individuos a los
alimentos: dietas personalizadas (Nutrigenetics)

Foodomics
Nuestro grupo ha definido por primera vez en una revista SCI
Foodomics como: una nueva disciplina que empleando tcnicas
micas investiga los alimentos, incuyendo sus mltiples conexiones
con la nutricin y la salud
(A. Cifuentes, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7109).

El inters en Foodomics coincide con una clara tendencia en medicina y

bio-ciencias hacia la prevencin de enfermedades futuras.

MEJORAR EL BIENESTAR
Y LA CONFIANZA
DE LOS CONSUMIDORES Y
ASEGURAR EL CUMPLIMIENTO
DE LA LEGISLACIN

Foodomics: A new omics for a new food era

FOODOMICS
Food quality
Epidemiological
Food safety
studies
Nutrigenomics
Nutrigenetics
Development of:
Nutraceuticals
Functional foods
GM foods
New foods
GM foods monitoring

Bioinformatics
Toxicity assays
In-vitro assays
In-vivo assays
Clinical trials

Foodomics: A new omics for a new food era

FOODOMICS
Goal

Food quality

To improve consumers
well-being and confidence
fulfilling legislation

Epidemiological
Food safety
studies
Nutrigenomics
Nutrigenetics
Development of:
Nutraceuticals
Functional foods
GM foods
New foods
GM foods monitoring

Bioinformatics
Toxicity assays
In-vitro assays
In-vivo assays
Clinical trials

Nuevos retos, nuevas respuestas: Foodomics

-Producccin de nuevos alimentos
funcionales (con base cientfica)
-Aproximacin global a la seguridad,
calidad y trazabilidad de alimentos
mediante el empleo de tcnicas micas
-Desarrollo, produccin y monitorizacin
de nuevos alimentos transgnicos
-Comprensin de los efectos de la interaccin
alimentos-genes sobre la salud (Nutrigenmica)
-Entender las diferentes respuestas de los individuos a los
alimentos: dietas personalizadas (Nutrigenetics)

Maiz transgnico (maiz Bt)

Un nuevo gen CryIA(b) (de Bacillus thuringiensis) es insertado por tcnicas
recombinantes en el genoma de maiz. El gen codifica una nueva
protoxina que acta como insecticida contra lepidptero (taladro).

Soja transgnica (soja RR)

Un nuevo gen CP4 EPSPS de Agrobacterium (que codifica una
CP4 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa, CP4-EPSPS)
es insertado por tcnicas recombinantes en el genoma de la soja.
La nueva enzima CP4-EPSPS proporciona resistencia a la planta
transgnica frente al herbicida glifosato.
Podran estos nuevos genes dar lugar a otros efectos no esperados?
La European Food Safety Agency (EFSA) recomienda el desarrollo
de nuevos profiling methods para detectar estos efectos no esperados.

OMGs de segunda generacin

SU XITO DEPENDER (ENTRE OTROS FACTORES) DE PODER
CONTAR CON EVIDENCIAS CIENTFICAS SLIDAS SOBRE:
-SUS BENEFICIOS PARA (LA SALUD DE) LOS CONSUMIDORES
-LA EQUIVALENCIA CON SUS VARIEDADES NATURALES
-SIN RIESGOS MEDIOAMBIENTALES

Macronutrientes:
Protenas
Composicin en amino cidos
Funcionalidad, e.g. amasado del pan
Carbohidratos
Composicin de almidn, inulina, monosacridos
Aceites vegetales
Mayor contenido en PUFA (e.g., cido oleico)
Micronutrientes:
Vitaminas, antioxidantes (Golden rice)
Minerales (iron-fortified rice)
Otros:
Alimentos hipoalergnicos
Plantas tolerantes a terrenos secos
Maduracin prolongada

Ideal Foodomics platform for GMO analysis

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

GMO detection
Traceability
GMO labeling

SYSTEMS BIOLOGY
Gene
expression

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs

GMO

GMO biomarkers
Unintended effects

GMO safety
Legal issues
GMO removed
or improved

Capillary electromigration methods for Foodomics

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

GMO detection
Traceability
GMO labeling

SYSTEMS BIOLOGY
Gene
expression

GMO

CGE-LIF

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs

CE-MS
CE-MS

GMO biomarkers
Unintended effects

GMO safety
Legal issues
GMO removed
or improved

DNA analysis by CGE-LIF

Development of a novel analytical methodology, based on MLGA-CGELIF, to simultaneously detect multiple GMOs in a single reaction
Multiplex ligation dependent genome amplification (MLGA)
Long oligonucleotide
probe (Selector)

III. Circular DNA enrichment

(exonuclease treatment)

Vector (universal sequence)

Target 3
II. Ligation of targets
(Circularization)

I. Digestion of gDNA with

specific endonucleases

Target 1
Target 2

Targets

5
Fwd primer

5
Rev primer

Target 3
Target 2

V. Detection of PCR products

1

Target 1

IV. Linearization of targets and PCR

3
Target 2

5
CGE-LIF

Target 1

Target 3

Simultaneous detection of multiple GMOs with MLGA-CGE-LIF

mon863 selector
ga21 selector
adh V2 selector
mon810 selector

CGE-LIF

Fwd primer

1% GA21, 1% MON863 & 1% MON810 maize mixture

3.5

Rev primer

Adh V2 selector (2.5 nM)

vector

MON863 selector (5 nM)

3.0

Mon810 selector (2.5 nM)

GA21 selector (5 nM)

2.5
Linearization

&
Enrichment

&
PCR

2.0
RFU

Ligation

1.5

Mon810 (172 bp)

mon863 (155 bp)

Digested
genomic
DNA

Circular DNA
targets

1.0

Ga21 (131 bp)

Adh (199 bp)

0.5
0.0

MLGA is very flexible since the incorporation

of new additional selector probes to the ligation
step requires minor adjustments of the selector
concentration to detect all the DNA target with
LODs below 1%

10 12 14 16 18 20 22 24
Minutes

Calculated LODs (S/N=3)

0.2% GA21 maize
0.3% MON863 maize
0.1% MON810 maize

SHOTGUN PROTEOMICS by CE-TOF-MS:

GM vs. wild soybean
SOYBEAN

Protein content 40 %

Well-known difficulties in protein separation:

Different physico-chemical properties (size, isoelectric point,
hydrophobicity) within a wide range of concentrations.
Difficult to separate complex mixtures of proteins.
Challenging identification of (large) proteins.
SHOTGUN PROTEOMICS by CE-TOF-MS
Analysis of peptides obtained after hydrolysis of complex protein mixtures

GM soybean
Wild soybean

PEPTIDE
ANALYSIS BY
CE-TOF-MS

ENZYMATIC
HYDROLYSIS

PROTEIN
EXTRACTION

DATA
ANALYSIS

Optimization
required

Intens.
x105
4

Base peak electropherogram

3
2
1
0

10

15

20

25

30

(min)

Relative intensity

Some (63) extracted ion electropherograms

10

15

20

25

30

Time
(min)

SHOTGUN PROTEOMICS by CE-TOF-MS:

GM vs. wild soybean
Intens.
x105

BPE

7.5

Conventional

6.0

4.5

3.0

Transgenic
1.5

0.0

10

15

20

25

Time
(min)

30

SIMILAR PEPTIDE PROFILE

No differences were observed between the GM and wild soybean

when a 15% abundance cutoff was used for the automatic
deconvolution of the detected ions

Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FT-ICR-MS)

for metabolomics
Intens.
x108

175.06122

257.11426

301.03528

515.12475
339.09313

380.99850
276.98773
4

577.13423

477.06693

605.19248

12 tesla FT-ICR-MS at GSF/Munich Germany

P. Schmitt Kopplin
0

Intens.
x109
4

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600 m/z

-MS

438.23902

GMO

Details on m/z 438.239

3
2
439.24247

1
0
2500

440.24610

2000
1500
1000

Mass resolution: >600.000 in full scan

Mass accuracy: <0.1 ppm
>10.000 signals/mass spectra
>300 elementary composition assignements
(depending on the extraction conditions)

Theoretical compound
C 25H32N 3O 4 "Lunarine

438.23873

439.24213

500

440.24498

0
438.23899

Theoretical compound
C 4H50N6O 6S5

2000
1500
1000

440.23478

500
0

439.24044
438.0

438.5

439.0

439.5

440.0

440.5

m/z

METABOLOMICS by FT-ICR-MS and CE-TOF-MS:

GM vs. wild corn

FT-ICR-MS of wild maize

Mass resolution: >600.000 in full scan; Mass accuracy: <0.1 ppm; Signals/mass spectra: > 10.000
Elementary composition assignements: >300 (depending on the extraction conditions)

Extraction by PLE with:

Hexane

Methanol

Water

Although the high resolution and sensitivity provided by FT-MS allows the detection
and identification of an impressive number of compounds, CE-TOF-MS can provide
additional information useful to corroborate (or not) the metabolites identification.

PROCEDURE FOR THE TENTATIVE CHARACTERIZATION

OF METABOLITES BASED ON FT-MS and CE-TOF-MS DATA
MOLECULAR ION DETERMINATION
ISOTOPIC PATTERN
MOLECULAR FORMULAE ASSIGNATION
SEARCH IN DATABASES
EXPECTED ELECTROPHORETIC MOBILITY
DATA ANALYSIS
SAMPLES CLASSIFICATION/BIOMARKERS DETECTION

GM vs. wild corn

Number of compounds identified in some
metabolic pathways in six different varieties of
maize, three transgenic (PR33P66 Bt, Tietar Bt
and Aristis Bt) and their corresponding isogenic
non-transgenic lines (PR33P66, Tietar and
Aristis).
ONLY 6 SAMPLES WERE ANALYZED!

Nuevos retos, nuevas respuestas: Foodomics

-Producccin de nuevos alimentos
funcionales (con base cientfica)
-Aproximacin global a la seguridad,
calidad y trazabilidad de alimentos
mediante el empleo de tcnicas micas
-Desarrollo, produccin y monitorizacin
de nuevos alimentos transgnicos
-Comprensin de los efectos de la interaccin
alimentos-genes sobre la salud (Nutrigenmica)
-Entender las diferentes respuestas de los individuos a los
alimentos: dietas personalizadas (Nutrigenetics)

Foodomics abarca otras metodologas como:

Ensayos in-vitro
Estudios
de
toxicidad

Otro ejemplo:
Alimentos y salud.
Procedimiento clsico

Ensayos
in-vivo
Ensayos clnicos

Ideal Foodomics platform to investigate the

biological activity of functional foods
Health benefits
known and
scientifically
based

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

SYSTEMS BIOLOGY
Biological
Samples
(plasma,
urine,
CSF,
cell fractions..)

Gene
expression

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

Proved effects
and/or
Biomarkers discovery

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs
Legal issues:
Claims on new
functional foods
approved

1-Aprobacin legal de las

alegaciones de salud
2-Nuevo alimento funcional
3-Desarrollo del nuevo
producto por la empresa
para su comercializacin

Running Foodomics projects in our lab on

bioactivity of new functional ingredients on:
Diabetic children

Alzheimer

Colon cancer

Leukemia

Clinical trial

Population study

Human cell lines

Human cell lines

Biological samples:
Urine and Plasma

Biological sample:
Cebrospinal fluid
(CSF)

Biological samples:
DNA, RNA,
proteins and
metabolites

Biological samples:
DNA, RNA,
proteins and
metabolites

In collaboration with
GSF
(Munich, Germany)
La Paz Hospital
(Madrid, Spain)

In collaboration with
Karolinska Institute
(Stockholm, Sweden)

In collaboration with
Univ. Miguel Hernandez, Elche, Spain
University of Granda, Granada, Spain

Analytical tools used for Foodomics

(biological activity of functional foods)
Health benefits
known and
scientifically
based

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

SYSTEMS BIOLOGY
Gene
expression

Biological
Samples

Proved effects
and/or
Biomarkers discovery

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs

CGE-LIF
Microarrays
RT-PCR

CE-MS
FT-MS
GC-MS
LC-MS

CE-MS
2D-E
LC-MS

Legal issues:
Claims on new
functional foods
approved

CSF metabolomics by CE-TOF-MS

In order to find new possible AD biomarkers and investigate the activity of new functional
ingredients on Alzheimer development, four different groups of study were selected, namely:
M1 - Control aged subjects
M2 - Mild cognitive impairment without developing Alzheimer subjects
M3 - Mild cognitive impairment with developing Alzheimer subjects
M4 - Alzheimer disease diagnosed subjects
CSF from M1
CSF from M2
CSF from M3

METABOLITES
EXTRACTION

METABOLITES
SEPARATION

CE-TOF-MS
ANALYSIS

CSF from M4

Optimization
required

DATA
ANALYSIS

EIE, M4

CSF metabolites by CE-TOF-MS

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
25
27
29
28
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
0

CSF pretreatment:
Ultracentrifugation with 3KDa membrane.
Analysis of the fraction < 3 kDa

CE conditions:
Bare silica capillary (87cm, 50 m ID)
BGE, 0.5M formic acid buffer, pH 2
Running voltage +25 kV
Injection at 0.5 psi during 80 s.

MS conditions:
Positive ion mode
Sheath liquid isopropanol-water (1:1 v/v)
Flow rate of 4 L/min
Dry gas flow at 4 L/min
Nebulizer gas flow at 0.4 bar
Temperature 200C
Mass scan: 50-500 m/z

10

15

20

25

CE-MS allowed the

reproducible detection of
75 mass values in
CSF samples
of which:
57 endogenous metabolites
4 exogenous (drugs)
14 unknown (high error)

Time [min]

Data analysis Analysis of variance (Anova, allows the detection of the

most significant variables at p < 0.05) Scheffe test (Parametric multicomparison procedure to detect significant differences between
values at p < 0.05) Discriminant analysis (Define the most important
values for groups classification) Biomarkers discovery
Comparison M1, M2, M3 and M4
0,080

M1
M2

0,070

M3
M4
0,060

0,050

min

0,040

Ga

lan

th a

0,030

0,020

0,010

0,000
22

23

37

34

44

25

39

33

19

43

Comparison M1, M2, M3 and M4

0,250

M1
M2
0,200

M3
M4

0,150

0,100

0,050

0,000
30

18

54

35

13

10

38

16

49

14,000

5,000

4,500

M1

12,000

M2
4,000

M3
M4
10,000

3,500

3,000

8,000
2,500

6,000
2,000

1,500

4,000

1,000

2,000
0,500

0,000

0,000
58

46

55

41

48

27

47

14

51

DISCRIMINANT ANALYSIS :
Variables with the most significant differences on Anova Table:
27, 33, 13

25

Classification Functions; grouping: Grupo (AlzheimerDatos 25-02-2010.sta)

M_1:1

M_2:2

M_3:3

M_4:4

27,000000

1217,24

-584,8

942,11

2688,7

33,000000

11898,91

-20134,2

10224,00

62447,0

13,000000

2204,84

9122,3

990,01

-12458,0

Constant

-923,72

-352,5

-472,94

-1361,3

20
15

10

Percent

M_1:1

M_2:2

M_3:3

M_4:4

M_1:1

100,0000

M_2:2

100,0000

M_3:3

100,0000

M_4:4

100,0000

Total

100,0000

VAR CAN 2

Classification Matrix (AlzheimerDatos 25-02-2010.sta) Rows: Observed classifications

Columns: Predicted classifications

-5

-10

-15
-40

-30

-20

-10

10

20

30

40

50

M1
M2
M3
M4

VAR CAN1

Future work: the whole methodology (and possible biomarkers)

will be tested applying it to analyze and classify
100 new CSF samples from groups
M1 to M4 (of which 20 will be used as blind group)

Foodomics: retos actuales

Ciencia que estudia la interaccin de los nutrientes con los genes.

Ya se sabe que hay muchos genes cuya expresin es sensible a la
presencia de determinados ingredientes en los alimentos.
Combinando el estudio de slo aquellos genes clave en patologas
concretas (o el estudio de la expresin de genes de forma general)
con marcadores de punto final (protenas y/o metabolitos), es posible
disear un sistema de evaluacin de eficacia de alta fiabilidad (y bajo
coste relativo).

D. Corella, Univ. Valencia

OTRAS PATOLOGAS CONOCIDAS:

Enfermedades Monognicas:
Hipercolesterolemia Familiar
Fenilcetonuria
Galactosemia
Intolerancia a la Lactosa
Enfermedad Celiaca
Metabolismo de los lpidos (Dislipemias)
Enfermedades Multifactoriales:
Enfermedad Cardiovascular (ECV)
Cncer
Diabetes Tipo 2
Obesidad

Obesidad
Enfermedad crnica determinada por un exceso de grasa
de forma continuada en el tiempo (IMC>30).
Se han detectado en Obesidad:
26 Variantes allicas (de 23 Genes) relacionadas con:
9 8 Metabolismo de los lpidos.
9 7 Metabolismo energtico.
9 7 Control del apetito.
9 1 Metabolismo de la Glucosa.
9 1 Control de la Presin sangunea.
9 1 Equilibrio Hormonal.
9 1 Procesos Inflamatorios.

Nutrigentica
Estudia la distinta respuesta de los individuos a la dieta en funcin
de sus variaciones especficas en el genoma (hipo-, normo- e hiperrespondedores). Incluye la identificacin y caracterizacin de
variantes genticas que se relacionen con una respuesta diferente a
los componentes de la dieta para los fenotipos de inters.
Su objetivo es generar recomendaciones especficas sobre la mejor
composicin de la dieta para el optimo beneficio de cada individuo.
Se ha denominado tambin:
Nutricin personalizada
o dieta a la carta

Nutrigenmica
La nutrigenmica se centra en el estudio de los mecanismos
moleculares y celulares que explican los efectos de los nutrientes. En
concreto, examina la interaccin entre nutrientes y la expresin
gnica. Tambin se centra en la caracterizacin de nuevas protenas
derivadas de la expresion de dichos genes y de las funciones
fisiolgicas de estas protenas, incluyendo el estudio de metabolitos
derivados de la actividad de dichas protenas.

Nutrigenmica: visin global

Pero hay otras posibles opciones

de cmo pueden actuar los nutrientes
BIOACTIVE DIET
COMPONENTS

A
METABOLISM

SIGNAL
TRANSDUCTION

B
GENE
EXPRESSION

NORMAL
mRNA
CELL
GROWTH
Proteins

Metabolites

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGA MOLECULAR

DNA

transcripcin

Almacenamiento
de la informacin

Genmica

RNA

traduccin

Transferencia de
la informacin

Transcriptmica

Protenas

actividad

Estructura y
funcionalidad

Protemica

Metabolitos
Estructura y
funcionalidad

Metabolmica

Plataforma de Foodomics para el anlisis de nuevos

alimentos. Ejemplo: anlisis de GMOs
GMO detection
Traceability
GMO labeling

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

SYSTEMS BIOLOGY
Gene
expression

GMO

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

GMO biomarkers
Unintended effects

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs

GMO safety
Legal issues
GMO removed
or improved

Plataforma de Foodomics para evaluar la actividad

biolgica de nuevos alimentos funcionales
Health benefits
known and
scientifically
based

GENOMICS/
TRANSCRIPTOMICS
PROTEOMICS
METABOLOMICS

SYSTEMS BIOLOGY
Biological
Samples

Gene
expression

Data
Protein Metabolite
expression expression integration

Proved effects
and/or
Biomarkers discovery

STATISTICS
METABOLITES
PROTEINS
DNA/mRNAs

CGE-LIF
Microarrays
RT-PCR

2D-E
CE-MS
LC-MS

CE-MS
FT-MS
GC-MS
LC-MS

Legal issues:
Claims on new
functional foods
approved

TCNICAS MICAS USADAS EN FOODOMICS

Genmica

Transcriptmica

Esttico

Protemica

Metabolmica

Dinmico

TCNICAS MICAS USADAS EN FOODOMICS

Genmica

Esttico

Transcriptmica

Protemica

Dinmico

Biologa de sistemas

Metabolmica

Transcriptomic platform
Statistical filter

Proteomic platform
Statistical filter

Metabolomic platform

Systems biology

Gracias!