UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO
IDENTIFICACION BACTERIANA
Maye Bernal Rivera

Introduccin
Para establecer el Diagnstico Etiolgico de la Enfermedad Infecciosa, se debe partir
de una muestra clnica procedente del paciente en estudio, para ser procesada en el
laboratorio clnico, dependiendo del diagnstico presuntivo consignado en la orden de
solicitud expedida por el mdico tratante.
Para realizar la identificacin bacteriana la muestra del paciente se siembra en
diferentes medios de cultivo, en condiciones ambientales especficas, dependiendo
del microorganismo que se pretenda aislar.
Esta primera parte del mdulo de Bacteriologa corresponde a la identificacin del
microorganismo (gnero y especie) la cual conlleva a establecer el diagnstico
etiolgico.
Medios de Cultivo
Definicin:
Medio de Cultivo es el conjunto de nutrientes y sustratos que permiten el crecimiento
la multiplicacin y el aislamiento de las diferentes especies bacterianas para llegar a
su identificacin y otros estudios complementarios, tales como su comportamiento
frente a los antimicrobianos. Un medio de cultivo mnimo debe tener: agua, una
fuente de carbono, una fuente de nitrgeno y una sal para mantener estable la
concentracin de iones.
Clasificacin
Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a:
-

Origen
- Naturales
- Sintticos

Consistencia
- Lquidos
- Slidos
- Semi-slidos

Composicin
- Nutritivos
- Enriquecidos
- Selectivos

Diferenciales

Medios de Transporte
Son aquellos que aseguran la viabilidad de la bacteria desde el momento de la toma
de la muestra hasta su llegada y procesamiento en el Laboratorio. Carecen de un
nutriente mnimo indispensable, evitando as el crecimiento de las bacterias. Como
ejemplo tenemos el medio de Stuart, Ames, Slica gel, Cary Blair, etc.
Medios de Conservacin
Son medios que permiten mantener la viabilidad de las bacterias, conservando sus
caractersticas fisiolgicas, morfolgicas, tintoriales, etc. Los hay para tiempos cortos
y tiempos ms prolongados, aunque para mantener y garantizar todas las
caractersticas bacterianas se deben conservar liofilizadas o congeladas a -70C o en
nitrgeno a -120C. . Ejemplos de este tipo de medios son: medio de Dorset, medio
de leche descremada triptona glucosa glicerol (LDTGG), solucin de Greaves, etc.
Para el cultivo de bacterias, adems de suministrarles sus requerimientos
nutricionales (medios de cultivo ptimos), se les debe proporcionar las condiciones
ambientales necesarias para permitirles su crecimiento y multiplicacin.
Condiciones ambientales
-

Temperatura
Concentracin atmosfrica
- Presencia de de O2 (Aerobiosis)
- Disminucin de O2 (Microaerofilia)
- Presencia de CO2 (Capnofilia)
- Atmsfera de Nitrgeno (Anaerobiosis)
Porcentaje de humedad
Presencia de Luz

Seleccin de Medios
Para la recuperacin de los microorganismos a partir de las muestras clnicas, es
indispensable hacer la seleccin adecuada de los medios primarios de cultivo para
obtener resultados ptimos. Es importante para el medico conocer los diferentes
medios utilizados en el Laboratorio Clnico para en un momento dado poder
interpretar adecuadamente los resultados y detectar posibles falsos negativos. En el
siguiente cuadro se pude ver, dependiendo del agente etiolgico en determinada
entidad, el medio de cultivo adecuado.

SELECCION DE MEDIOS DE CULTIVO

Entidad

Agente Etiolgico

Medio de Cultivo

Faringitis estreptoccica

Streptococcus pyogenes

Agar Sangre

Uretritis gonoccica

Neisseria gonorrhoeae

Thayer Martin *

Tuberculosis pulmonar

Mycobacterium tuberculosis

Ogawa Kudoh

Tos ferina

Bordetella pertussis

Bordet Gengou

modificado

Tcnicas de Inoculacin
Las tcnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varan,
dependiendo del objetivo.
Esterilizacin del Asa Bacteriolgica
Las asas bacteriolgicas bsicamente son alambres unidos a un mango
que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente material,
(ferro nquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,)
dependiendo de la necesidad.
Para su esterilizacin se utiliza calor seco (llama), y se procede
as:
-

Prender el mechero
Tomar el asa bacteriolgica por el mango y colocarla en
posicin vertical, sobre la llama del mechero, hasta que el
alambre quede al rojo vivo.
Dejar enfriar o enfriar dentro del medio de cultivo, antes de
tomar las colonias.

Inoculacin en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo

1. Siembra en Medio Lquido (Caldo)
- Obtener la muestra con asa bacteriolgica o escobilln
- Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotacin.
2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta)
- Obtener la muestra con asa
- Hacer estras en la superficie del medio
3. Siembra en Agar semislido (taco)
- Obtener la muestra con asa recta
- Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio

2
1

Medios en Caja de Petr

Siembra por agotamiento:
El objetivo de esta tcnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga
colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificacin y sensibilidad a los
antimicrobianos.
1. Obtener la muestra con escobilln o asa y suspenderla en un extremo de la
placa de agar, haciendo estras (lneas) de un extremo a otro (primer
cuadrante)
2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante
primero y extenderlas hasta el cuadrante dos
3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante
dos y extenderlas hasta el cuadrante tres
4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante
tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro.

Siembra en cuadrcula:
El objetivo de esta tcnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias
(UFC)
1. Obtener la muestra con asa calibrada o pipeta automtica que dispense
una cantidad exacta y distribuirla con el asa en lnea recta por todo el centro
2. Hacer estras de extremo a extremo en sentido contrario a la lnea de
inculo
3. Girar la placa y hacer estras de extremo a extremo, en sentido contrario a
las anteriores

PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo
Proporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de los
mtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento e
identificacin de los principales agentes patgenos para el hombre a partir de
muestras clnicas, lo que le permitir actuar correctamente en su prctica mdica en
el campo de las enfermedades infecciosas.

PARTE I. SIEMBRA
Objetivos especficos
-

Practicar el manejo asptico de medios de cultivo

Aprender a esterilizar el asa bacteriolgica
Conocer las diferentes tcnicas de siembra
Realizar la transferencia (repique) de bacterias desde un cultivo puro (cepa) a
diferentes tipos y medios de cultivo.
Tomar una muestra de frotis farngeo y sembrarla en Agar Sangre
Objetivos:
- Trabajar con una muestra real
- Marcar (identificar) adecuadamente los medios de cultivo
- Aprender a tomar una muestra farngea
- Practicar la siembra por agotamiento en una placa de Agar Sangre
- Conocer un cultivo bacteriano mixto
- Apreciar y conocer la flora bacteriana normal en orofaringe
- Detectar portadores de Streptococcus pyogenes
- Informar adecuadamente el resultado del faringocultivo, para una correcta
interpretacin de reportes recibidos posteriormente.

Materiales
-

Asa curva y asa recta

Mechero de gas
Cepas bacterianas puras
Medios de Cultivo
- Tubos:
- Caldo Nutritivo
- Agar Nutritivo (inclinado)
- Agar semislido (taco)
- Cajas de Petr:
- Agar Nutritivo
- Agar Sangre (2 cajas)
- Agar Mc Conkey
- Escobillones y baja-lenguas estriles

Procedimiento

1. Conocer, ordenar y describir cada uno de los 6 medios de cultivo que va a

sembrar
2. Marcar en la base (nunca en la tapa) adecuadamente cada uno de los medios.

Pedro Lpez
170305001
FF

La etiqueta debe contener:

1. Nombre del paciente
2. Registro de laboratorio, que debe incluir
la fecha y consecutivo del Laboratorio
3. Tipo de muestra

3. Sembrar en Caldo de cultivo as:

a. Coger con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa pura,
b. Coger el asa con la mano derecha y esterilizarla
c. Retirar la tapa del tubo con el dedo meique de la mano derecha y
mantenerla ah (no colocar sobre el mesn, para evitar contaminacin)
d. Flamear la boca del tubo
e. Introducir el asa estril y tomar una colonia
f. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa
g. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el
meique de la derecha retirar la tapa, flamear la boca del tubo
h. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotacin
i. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo
j. Esterilizar el asa
4. Sembrar en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos (a a la j) pero al sembrar
hacer estras sobre la superficie del agar
5. Sembrar en Agar semislido: Seguir los mismos pasos (a a la j) pero al sembrar,
utilizar el asa recta e inocular en lnea recta por el centro y hasta la mitad del agar.
6. Sembrar en Agar, en Cajas de Petr: Sembrar por agotamiento primero el agar
nutritivo, luego el agar sangre y por ltimo el agar McConkey, as:
a. Seguir los pasos a a la f
b. Tomar la base de la caja por los bordes, con el ndice y pulgar de la mano
izquierda y voltear la mano para que la superficie del agar quede hacia
arriba
c. Descargar el inculo en el primer cuadrante haciendo estras de lado a
lado, como lo indica la figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear
el asa y enfriarla en un extremo del agar
d. Girar la caja e iniciar las estras partiendo del primer cuadrante, flamear el
asa, y enfriarla en el extremo del agar
e. Girar nuevamente la caja y repetir una vez ms el mismo procedimiento.
7. Colocar las cajas de Agar Sangre con la tapa hacia abajo, dentro de la jarra con
vela (CO2 al 5%) y algodn mojado en agua estril (ambiente de humedad)
8. Colocar los otros medios (cajas con la tapa hacia abajo y tubos en los vasos) en
la canasta destinada para ello
9. Incubar a 37C por 24 horas en aerobiosis

Siembra a partir de muestra farngea

1. Identificar correctamente la caja
2. Sentar al paciente cmodo
3. Alistar el escobilln (pretratado) y bajalenguas
estriles
4. Colocarse los guantes
5. Indicar al paciente que abra la boca, colocar el
bajalenguas y con el escobilln frotar las amgdalas
6. Hacer la siembra por agotamiento y luego picar el
medio unas 4 veces, con el objeto de aumentar la produccin de hemolisina
beta sensible al oxgeno
7. Incubar en CO2, 24 horas a 37C.
Actividad
1. Clasifique los medios de cultivo utilizados
2. Investigue en caso de ser necesario transportar una muestra farngea, cul o
cules medios de transporte se recomiendan
3. Describa las tcnicas de siembra y su utilidad
4. Una vez obtenido el crecimiento, que pasos se debe seguir para la
identificacin bacteriana?
5. Escriba los microorganismos que forman parte de la flora normal farngea