Universidad Dr.

Andrés Bello
Regional San Miguel
Facultad de Ciencias de la Salud
Licenciatura en Laboratorio Clínico

Asignatura: Diagnostico Bacteriológico.

Unidad N° 1. C-I-2022

Tema: GENERALIDADES DE BACTERIOLOGIA Y MEDIOS DE CULTIVOS.

Licda. María de la Paz Rodríguez Ventura.

La Bacteriología es la rama de la Biología que estudia la morfología, ecología,

genética y bioquímica de las bacterias así como otros muchos aspectos relacionados
con ellas. Es de gran importancia para el hombre por sus implicaciones médicas,
alimentarias y tecnológicas.
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA.

¿Que son las bacterias?

Son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los protistas inferiores. .
Existen evidencias de que fueron las primeras formas vivas que habitaron el planeta. Del
estudio de las bacterias se encarga la bacteriología una rama de la microbiología.

Las bacterias tienen una estructura menos compleja que la de las células de los
organismos superiores: son células procariotas (su núcleo está formado por un único
cromosoma y carecen de membrana nuclear). Igualmente son muy diferentes a los virus,
que no pueden desarrollarse más dentro de las células y que sólo contienen un ácido
nucleico.

Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy simple, que en
condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción.
Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula en dos células
hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la reproducción de otros seres
vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas que son estructuras de
resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles.
Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos que agitan
en forma de látigo. Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las
condiciones de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que
requieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
según cada medio de cultivo.

1- Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus

requerimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser:

a. Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en presencia de

oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.

b. Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxígeno.

Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambiente en el cual se
incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos en jarros de vidrio con
una candela encendida, lo que enriquece con un 5 al 10 % de anhídrido carbónico
(CO2).

c. Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual les es

sumamente tóxico e impide su crecimiento.
 d. Facultativas: Son capaces de crecen en ausencia de oxígeno y tienen la facultad
de también crecer en aerobios.

2- Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:

a. Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo

humano o a la temperatura del ambiente. En este grupo se incluyen todas las bacterias
patógenas, por esta razón la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las
incubadoras bacteriológicas es de 36 grados centígrados.
b. Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor).
c. Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).
d. Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración.

3-Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:

a. Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo: Staphylococcus

aureus b. Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o
bastoncillo. Ejemplo: bacilos en división.( Enterobacterias)
c. Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o espiral.
Ejemplo: Treponema sp. (espiroquetas).

4-Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así:

a. Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, o parejas (ejemplos:

Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).
b. En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)
c. En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.) Este tipo de clasificación no
se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

CLASES DE ASAS Microbiológicas Y SU USO

ASAS PARA Bacterióloga:

1. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de nichrome. Sirve para

siembra por estr’as e inoculaciones en general.

2. Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de identificaci—n, o
subcultivo.
 3. Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para urocultivo.

4. Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras. ASAS PARA
MICOLOGêA Y MICOBACTERIAS:

5. Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y procedimientos

especiales.

6. Aguja de disecci—n con punta aguda, para purificar colonias peque–as y distribuir las
preparaciones de hongos en fresco.

Métodos Generales:

1) Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo
simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con
el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

-          Medio de cultivo: Liquido

-          Instrumento: Asa
-          Finalidad: poner la bacteria en suspensión.

2) Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie del agar

inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa
bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo
estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda
de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

-          Medio de cultivo: agar base inclinado

-          Instrumento: asa o aguja bacteriológica.

3) Siembra por estría por agotamiento: Con éste procedimiento se puede conseguir
una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio
de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente
 esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie
del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:

a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere
obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual
se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.

b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material
en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el
segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante
aparecerán las colonias aisladas.

c- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se

esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.

-          Medio de cultivo: solido en placa de Petri

-          Instrumento. Asa
-          Finalidad. Obtener colonias aisladas

4) Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y
se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo,
formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se
utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.

-          Medio de cultivo: Semisólido

-          Instrumento: aguja bacteriológica
-          Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias
INOCULACIÓN DE MEDIOS. SOLIDOS POR ESTRÍAS

CRECIMIENTO Y METABOLISMO

La multiplicación celular es una consecuencia directa del crecimiento y da lugar, en el

caso de las bacterias, a colonias, mediante un sistema de reproducción asexual
denominado división binaria. Los procesos sintéticos involucrados en el crecimiento
bacteriano incluyen más de 2 000 reacciones bioquímicas.
La velocidad de crecimiento es el cambio en número de bacterias por unidad de tiempo, y
se expresa como el tiempo de generación, que es el tiempo necesario para que se
duplique una bacteria o una población de ellas.
En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado se obtiene una curva de
crecimiento típica que se ha dividido en cuatro fases: fase de latencia, fase exponencial,
fase estacionaria y fase de muerte. La fase de latencia se caracteriza por la adaptación de
los microorganismos, no se presenta cuando el inoculo es nuevo y si el inoculo proviene
de un cultivo viejo, requiere de este periodo de adaptación. La mayor parte de las
bacterias crece de forma exponencial, aunque hay una serie de condiciones que influyen
(nutrimentos en el medio, temperatura, factores genéticos). En la fase estacionaria no hay
una modificación neta en el número de células, existe un frágil equilibrio que desaparece
eventualmente cuando aún las bacterias metabólicamente activas mueren, debido a
productos tóxicos y falta de nutrimentos (factores presentes en la fase estacionaria)
aunados a enzimas liberadas por la lisis bacteriana.

MEDIOS DE CULTIVO

El estudio de los cultivos permite detectar la presencia de microorganismos en una

muestra y su posterior identificación, efectuar pruebas de susceptibilidad de estos
microorganismos a antibióticos o a antisépticos concretos, etc.

El cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios

de cultivo) y bajo condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, presión de oxígeno y
pH óptimos para el crecimiento del microorganismo concreto y sin presencia de
microorganismos contaminantes).

Se entiende por medio de cultivo la mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas,

que permite el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite
mantener su viabilidad.

Los medios de cultivo son otro de los productos que encontraremos en los laboratorios de
análisis clínicos. La mayoría de ellos pueden prepararse en el propio laboratorio, pero
cada vez es más habitual que se adquieran preparados listos para su uso.

Presentación de los medios de cultivo.

Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes:

* Medios Líquidos o caldos de cultivo. Son los que una vez preparados se mantienen en
estado líquido. Suelen utilizarse para realizar la suspensión de disolución de la muestra a
analizar con el fin de conseguir la disolución madre. Pueden presentarse en bolsas de 5
litros, en frascos de 250 ml, o en tubos de un solo uso.

* Medios sólidos. Contiene un agente espesante, por lo general agar a una concentración
del 1,5 %. El agar es un derivado de algas. Es sólido a temperaturas inferiores a los 40 o
45ºC.

* Medios semisólidos. Tienen una consistencia intermedia entre la de los anteriores.

Suelen contener una concentración de agar del 0,7 %.
Tal como hemos apuntado, la mayoría de los medios de cultivo se compran hoy en día ya
preparados. Unos llegan para su uso en distintas presentaciones, y otros deshidratados.
La ventaja de los primeros es su comodidad y la desventaja, que su plazo de
conservación es corto. Los deshidratados, en cambio, pueden conservarse bastante más
tiempo, pero hay que prepararlos antes de usarlos.

Preparación y conservación de medios de cultivo.

Los medios de cultivo que no se adquieren listos para su uso deben prepararse en el
laboratorio (siguiendo las indicaciones de los fabricantes en el caso de los que parten de
medios comerciales deshidratados). Posteriormente se esterilizan, se revisan y se
conservan.

Consejos de preparación:

- Cuando peses medios de cultivo deshidratados (polvo), ten cuidado de no inhalar el

polvo desprendido. Algunos contienen sustancias tóxicas para las personas.

- Los medios se preparan en frascos de capacidad suficiente para facilitar la agitación y la

completa disolución de los distintos componentes. Pero también se pueden utilizar
autopreparadores, si el volumen de medio que se necesita es superior a 2L.

- Añade paulatinamente el agua necesaria, evitando formar una masa compacta. Todos
los medios deshidratados se preparan añadiendo agua desionizada o destilada de calidad
comprobada.

- La solución o la suspensión que se haga debe ser totalmente homogénea. Si necesita

calentarse, hazlo lo mínimo posible. Es recomendable calentar el agua a 50-65 ºC, antes
de añadirla porque eso favorece notablemente la disolución. Los componentes deben
agitarse mientras se calientan, sobre todo los agares.

* Esterilización

Algunos medios de cultivo se esterilizan con autoclave, otros al baño María y otros
mediante filtración por membrana. Todos ellos son procedimientos de esterilización. En
todo caso las indicaciones del fabricante te indicarán que procedimiento debes seguir en
cada uno de los medios comerciales deshidratados.

Control de Calidad
Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son:

1. Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista, atendiendo a su color, a

su opalescencia y transparencia, a la humedad en las placas ya preparadas y a la posible
aparición de precipitados.

2. Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en

medios con un pH neutro.

3. Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 36 ºC durante 72 horas una

pequeña porción, representativa del lote de medio preparado, para comprobar que allí no
crecen gérmenes.

4. Prueba de la eficacia o de crecimiento. : En una pequeña porción representativa del

medio preparado, se inocula un microorganismo, normalmente el propio fabricante
aconseja el más adecuado- y se cultiva. Así se comprueba si en el medio de cultivo
preparado ese microorganismo se desarrolla correctamente.

La siembra

La técnica para el aislamiento comienza preparando un inoculo de siembra, que es la

deposición de una pequeña porción de la muestra en el medio o en los medios de cultivo
adecuado, en función de las especies microbianas que se espera encontrar.
Por eso existen distintos métodos o tipos de siembra, en función de la muestra de partida,
del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra
para inoculación y la siembra para aislamiento.

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS

• Material: el material que se va a utilizar debe estar en perfectas condiciones de

limpieza y además debe estar aclarado con agua destilada o desionizada. Los aparatos
que se van a utilizar deben estar perfectamente calibrados.

• Agua: debe ser destilada o desionizada y no debe contener cloro, cobre, plomo, ni
detergentes. El agua debe tener una conductibilidad adecuada y un contenido iónico tal y
como indican las especificaciones para aguas purificadas.

• Esterilización: el tiempo de esterilización debe ser el óptimo.

Modelo estándar de preparación de medios de cultivos.

1-Verificar la viñeta del frasco del medio de cultivo.

2-Hacer calculo según la cantidad de medio a preparar.

3-Pesar el medio de cultivo deshidratado (polvo) en una balanza (teniendo el cálculo

realizado).

4-Se vierte en un balón volumétrico el medio de cultivo y se le agrega paulatinamente la

cantidad de agua destilada.

5-Para disolverlo se debe hacer calentando y agitando al mismo tiempo cuando se trata
de un medio de cultivo sólido o semisólido hasta que se disuelve por completo.

6-Si el medio de cultivo fuera un caldo con una o 2 agitación sería suficiente.

7- Mesclar constantemente los medios para evitar que se queme el agar. Llevar a
ebullición, teniendo cuidado que NO se derrame (rebalsar) el medio de cultivo.
8-Se esterilizará el medio de cultivo ya disuelto en autoclave o hoya de presión (si lo
indica la técnica).
9-Los medios se trasladan a una zona estéril parar irlos enfriando lentamente en baño de
maría a una temperatura entre los 50-55ºC. y añadirles si procede los suplementos al
medio de cultivo ( sangre de carnero , factor X y V, y VCNT)

10-Se vierte en placas de Petri para dosifica el medio de cultivo o en el tipo de envase
que se vaya a requerir en condiciones totalmente asépticas.

11-Una vez hecho esto hay que realizar el control de calidad de los medios preparados.

MEDIOS DE CULTIVO MÁS USADOS. Fundamento, reacción y color de los colonias

( viraje de color. )

• AGAR SANGRE: El agar-sangre es un medio enriquecido, en el que crece muy bien los
Streptococcus spp, Enterococcus spp, Staphylococcus spp, Enterobactereaceas,
Pseudomonas, etc.

Tiene la característica de evidenciar los diferentes tipos de hemolisis de tipo alfa, beta y
gamna de las diferentes bacterias que lo producen.

Es el medio utilizado con mayor frecuencia y se utiliza como base para la preparación
TSA (agar con soja trípticasa) , Base sangre y agar mueller –hinton, son medios de uso
general para la preparación . La suplementación del medio con un 5% de sangre de
carnero proporciona un mejor crecimiento de los microorganismos más fastidiosos así
como la obtención de reacciones hemolíticas de Streptococos alfa y beta hemolíticos.

El medio está libre de azúcares reductores ya que estos influirían de forma adversa en las
reacciones hemolíticas y no posee inhibidores en el medio.
El almacenamiento: el medio preparado en placa perfectamente embolsado tiene una
duración de 1 mes a una temperatura de 4-8ºC.

• AGAR-CHOCOLATE: Es un medio enriquecido de uso general que se utiliza para

procedimientos cualitativos como el aislamiento y cultivo de microorganismos como
Haemophilus spp y Neisseria spp. Es necesario añadirles suplementos al medio de
cultivo (sangre de carnero 5%, factor X y V, y VCNT) para el aislamiento de las bacterias
de importancia clínica.
Es necesario de los medios después de su esterilización, se trasladan a una zona estéril
parar irlos enfriando lentamente en baño de maría a una temperatura entre los 70-80ºC
(para darle la característica de chocolate). y añadirles los suplementos al medio de cultivo
( sangre de carnero , factor X y V, y VCNT)

El almacenamiento: el medio preparado en placa perfectamente embolsado tiene una

duración de 1 meses a una temperatura de 4-8ºC.
 • THAYER-MARTIN: es un medio selectivo, usado para el aislamiento de Neisseria
Spp (cualquier especie) de muestras que contengan flora acompañante, básicamente es
el medio de agar-chocolate con los factores V y X al que se añade 4 antibióticos para que
actúen en su misión de inhibición (VCAT: vancomicina, colistina, anfotericina,
tremetropin). En el crece muy bien la Neisseria meningitidis y gonorreal.

El almacenamiento: el medio preparado en placa perfectamente embolsado tiene una

duración de 1 meses a una temperatura de 4-8ºC.

• AGAR-MACCONKEY: Es un medio diferencial recomendado para aislamiento y

diferenciación de microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Lleva
lactosa como único hidrato de carbono. Su acción diferencial está basada en que los
microorganismos capaces de fermentar lactosa producen una caída de pH junto con una
absorción de colorante (rojo neutro) apareciendo en la colonia el color rojo y las colonias
de microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.
El almacenamiento: el medio preparado en placa perfectamente embolsado tiene una
duración de 1 mes a una temperatura de 4-8ºC.

• EMB-LEVINE-AGAR: (eosina, azul de metileno) es un medio selectivo y

diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo, y la diferenciación de bacilo
entéricos, gram negativos fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa
gracias a los 2 indicadores y contienen eosina y azul de metileno. Los colorantes sirve
para que le medio sea diferencial y además para inhibir el crecimiento de bacterias gram
positivas.
El almacenamiento: el medio preparado en placa perfectamente embolsado tiene una
duración de1 mes a una temperatura de 4-8ºC.

 AGAR PARA SALMONELLA Y SHIGELLA (SS)

Medio selectivo y diferencial para el aislamiento de Salmonella spp y Shigella spp a partir
de diversas muestras.
PRINCIPIO
Las bacterias Gram positivas, algunas especies de Proteus y bacilos coliformes son
inhibidos por las sales biliares, citrato de sodio y verde brillante. La diferenciación de los
microorganismos se logra por la lactosa. Las bacterias que fermentan la lactosa producen
ácido, el cual al reaccionar con el indicador rojo neutro, forman colonias rojas a rosa
intenso, las no fermentadoras observan incoloras a rosa pálido. El tiosulfato de sodio y el
citrato férrico de amonio, facilitan la detección de sulfuro de hidrógeno, manifestándose
por colonias con centro negro. Por ser un medio con alto poder de inhibición se
recomienda utilizarlo paralelamente a otros medios de cultivo menos inhibidores como
Agar Mac Conkey, Agar Eosina Azul de Metileno, Agar XLD.

.AGAR XLD (NO AUTOCLAVE): Contiene menos inhibidores que HE (agar

Entérico de Hektoen) y fue diseñado para detectar S-S (salmonella y shigella,. las sales
biliares en concentración relativamente bajas hacen que el medio sea menos selectivo.
Los 3 hierros de carbono están disponible para la producción de acido y el rojo fenol es un
indicador de PH.

AGAR TCBS ( NO AUTOCLAVE): TCBS (Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa,)

Agar enriquecido, permite el crecimiento de todos las especies patógenas del género
Vibrio spp..[].

• CALDO TIOGLICOLATO: se utiliza para cualquier tipo de microorganismos así como

para comprobar la esterilidad de antibióticos, alimentos y otros productos.
El almacenamiento: el medio preparado, en tubos y frascos, tiene una duración de unos 1-
2 meses y se conserva entre 4-8ºC

• MULLER-HINTON- AGAR: se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de

microorganismos a antibióticos. Deben de realizarse una gran variedad de controles de
calidad. Solo para la realización de antibiogramas.

• CALDO TRIPTICASA SOYA (CTS) y CALDO TIOGLICOLATO: Es un medio liquido de

uso general utilizado para el crecimiento de microorganismo. Se utiliza para cualquier tipo
de microorganismos. Y se almacena en tubos de vidrio y tapón de rosca.

• AGAR ENTÉRICO DE HEKTOEN: es un medio diferencial-selectivo para

aislamiento y diferenciación de patógenos entéricos gram negativos. Crecen muy bien la
Salmonella y la Shigella.

Bibliografía.

Manual de Bacteriología del minsal.