Resultados Prctica

Transformacin

Eficiencia de Transformacin

Para clculo de eficiencia

Nmero de colonias transformadas
Cantidad de plsmido agregado a
bacterias que estn en placa
a. Cantidad total de ADN de plsmido al inicio
b. Cantidad de ADN de plsmido (en las
bacterias) que se agreg a la placa

Clculo transformantes por ug plsmido

Nmero de colonias transformadas

Conteo en la placa
Si hay muchas se puede contar de la
placa, o la mitad y multiplicar
Ej: 190

Ejemplo a partir de una colonia (una colonia

en la solucin de transformacin)
a. Cantidad total de ADN de plsmido al inicio
Concentracin de plsmido: 0,08 ug/uL
Volumen de plsmido: 10uL
Volumen de solucin de transformacin: 250uL
Volumen LB (agregado antes de placas): 250uL

Cantidad de plsmido agregado a

bacterias que estn en placa
a. Cantidad total de ADN de plsmido al inicio
ADN (ug)= conc. plsmido(ug/uL) x vol. plsmido (ul)
Cantidad ADN= 0.08ug/uL x 10uL
Cantidad total de ADN (plsmido) que usaron: 0.8ug

Cantidad de plsmido agregado a

bacterias que estn en placa
b. Cantidad de ADN de plsmido (en las bacterias) que
se agreg a la placa (es una fraccin del total)
Fraccin de ADN usado= Volumen en placa/Volumen total en tubo
Fraccin ADN= 100uL / 510 uL = 0.2
de dnde salieron los 500uL?
Total de plsmido en la placa= fraccin x cantidad inicial plsmido
Total de plsmido en la placa= 0.2 x 0.8ug = 0.16ug

Clculo transformantes por ug

plsmido
Eficiencia de transformacin=
nmero de transformantes / ug de plsmido en placa

Eficiencia de transformacin=
190 transformantes/0.16ug= 1187 transformantes/ug

Aplicaciones transformacin

CYP1B1
Un gen del citocromo p450
CYP P450: Familia grande enzimas, la mayora
cataliza oxidacin de sustancias orgnicas
Los sustratos de las enzimas CYP incluyen
lpidos, hormonas esteroideas, sustancias
xenobiticas (como los frmacos y drogas)
Mutaciones en CYP1B1 causan glaucoma
primario congnito (herencia AR)

Anlisis funcional de mutaciones en

CYP1B1
Efecto de ciertas mutaciones en actividad
enzimtica
Se haba publicado variacin en actividad
enzimtica para variantes silvestres con
diferentes haplotipos de los 5 SNPs en CYP1B1
Analizamos las mutaciones incluidas en el
haplotipo correspondiente

Variantes analizadas
Variante

Mutacin

Haplotipo base (5 SNPs codificantes)

Nomenclatura
CYP1B1

Protena

ADN (5-3)

CYP1B1.1

RALDN

CGCCA

CYP1B1.2

GSLDN

GTCCA

CYP1B1.3

RAVDN

CGGTA

CYP1B1.4

RALDS

CGCCG

p.Y81N

CYP1B1.2

GSLDN

GTCCA

p.E229K

CYP1B1.2

GSLDN

GTCCA

p.G61E

CYP1B1.3

RAVDN

CGGTA

p.N203S

CYP1B1.3

RAVDN

CGGTA

p.L343del

CYP1B1.4

RALDS

CGCCG

Secuencia
Transformar levaduras
Plsmido con gen CYP1B1
Extraer microsomas
Introducir al gen silvestre las
variantes deseadas por
mutagnesis dirigida

Transformar E. coli para tener

muchas copias de los
plsmidos con las variantes
deseadas

*
Medir concentracin
de CYP1B1 en
extractos

Determinar actividad
enzimtica

Mutagnesis Dirigida

Mecanismo bsico de mutagnesis dirigida

Original
CAG

CAG
GTC

GTC
(5)

(1)

Traduccin
Val

CAG

Protena original
Mutante

+ primer

(2)

CGG

CAG

primer
(3)

GCC

GCC

CAG
GCC

Traduccin

(6)

+ polimerasa

Thr
(4)

Protena mutante

Replicacin Cambio de un aminocido

Val Thr

Diseo de primers para mutagnesis

dirigida
5

Stratagene:

3
5

Primer tiene la mutacin

Mutacin debe de estar en el medio
Longitud de 25-45 nucletidos y contenido GC de
por lo menos 40%.
La Tm alrededor de 78C.
El extremo 3 del primer tiene que ser C o G

Siguientes pasos
Miniprep para aislar plsmidos
Secuenciar para confirmar cambio

Vector pYeDP60
Vector shuttle: se puede propagar en
dos diferentes especies. Se debe
poder replicar y tener una forma de
seleccin en ambos organismos:
Parte E. coli: origen de replicacin,
marcador de seleccin es beta
lactamasa (resistencia a ampicilina)
Parte levadura: ARS (autonomously
replicating sequence), CEN
(centrmero de levadura), marcador
de seleccin (URA3, ADE2)
Promotor de galactosa: reprimido por
glucosa, inducido por galactosa

ADE2: enzima en
la va de adenina.
Mutantes ADE2
son rojas
URA3: enzima
necesaria para
produccin de
uracilo.

Transformacin Levaduras
Transformacin de levadura es muy
similar a la transformacin de E.coli

Levadura INVSc1-HR
Mutacin en URA3
enzima
para sntesis de uracilo. No
puede crecer en medio sin
uracilo
HR: expresa la enzima
reductasa humana. La actividad
de p450 depende de electrones
que le da la citocromo p450
reductasa. La actividad
endgena de la reductasa
puede no ser suficiente, por eso
se sobreexpresa para asegurar
la expresin de CYP1B1.

Extraccin de microsomas
Microsomas son artefactos tipo
vescula que se forman a partir del
RE cuando las clulas se rompen en
el laboratorio
No se encuentran en las clulas in
vivo
Se pueden separar del resto de la
clula por centrifugacin diferencial
Clulas sin romper, ncleos y
mitocondrias sedimentan a 10 000g
Enzimas solubles y RE fragmentado
(que contiene p450) quedan en
solucin
A 100 000g el RE sedimenta como
un pellet pero las enzimas solubles
quedan en sobrenadante
As se aslan y concentran
microsomas con p450

Cantidad de protena,
concentracin P450
Concentracin de protena: espectrofotmetro
Concentracin P450: mtodo Omura y Sato

Actividad Enzimtica

Kit
P450-Glo

Actividad enzimtica

Abundancia relativa

Actividad enzimtica relativa

Hacer el clculo de eficiencia de

transformacin con datos propios
Ver manual de insTAclone
Ejercicio adicional de clculo de eficiencia