Inmunologa. Curso 2009-10.

Tema 11

TEMA 11. TCNICAS INMUNOLGICAS II. Reacciones primarias.

Inmunofluorescencia. Citometra de flujo. Radioinmunoanlisis.
OBJETIVOS
-

Comprender los fundamentos de las tcnicas inmunolgicas basadas en

reacciones primarias y su aplicacin en el diagnstico veterinario.

REACCIONES PRIMARIAS:
La unin Ag-Ac se detecta midiendo la formacin de inmunocomplejos.
Utilizan un SISTEMA INDICADOR (o marcador) de la unin Ag-Ac:

Fluorescencia: inmunofluorescencia

Radiactividad: radioinmunoanlisis

Enzimas: enzimoinmunoanlisis, WB, inmunohistoqumica, etc.

Metales pesados: Inmunocromatografa, inmunomicroscopa

electrnica, etc.

El diagnstico que se consigue por las distintas tcnicas de la reaccin Ag-Ac in vitro
puede considerarse:
- DIRECTO: Deteccin de Ag en la muestra.
- INDIRECTO: Deteccin de Ac en el suero, calostro, leche, fluidos, etc.
Las tcnicas primarias se desarrollan en pasos o etapas con incubaciones intermedias
en las que se produce la reaccin Ag-Ac. Entre ellos es fundamental LAVAR
concienzudamente para arrastrar los reactivos que no hayan reaccionado.
A su vez, las tcnicas pueden ser:
-

DIRECTAS: slo emplean un reactivo

INDIRECTAS: los anticuerpos se detectan por Ig anti-especie (Ac secundario)

TIPO SANDWICH: el Ag queda atrapado entre dos capas de Ac. Puede ser DAS
(cuando el segundo Ac est marcado) o HADAS (cuando el segundo Ac no est
marcado y se emplea Ig anti-especie marcado para detectarlo.

DE COMPETICIN: De Ac o de Ag (Ac problema y marcado compiten por el Ag)

o de Ag (Ag problema y marcado compiten por los Ac).

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INMUNOFLUORESCENCIA
Utiliza Ac marcados (Conjugados) con colorantes fluorescentes o fluorocromos
(fluorescena [FITC] o rodamina) como sistema indicador. Cuando se aplica luz
ultravioleta en el microscopio de fluorescencia, el fluorocromo emite luz visible verde o
naranja/rojo
a) Inmunofluorescencia Directa: Se detecta antgenos en clulas, bacterias,
tejidos, heces o cultivos celulares, etc.
b) Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): Se utiliza un conjugado antiinmunoglobulina marcado con fluorocromo para detectar los Ac especficos
unidos al Ag. Es ms sensible que la tcnica directa. Se utiliza en diagnstico de
muchas enfermedades infecciosas y parasitarias.
Permite titular el suero, haciendo diluciones del mismo y determinando qu
dilucin es la ltima en la que se aprecia fluorescencia.

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c)

Citometra de flujo: Utiliza Ac monoclonales fluorescentes para la deteccin de

Ag de superficie celular mediante un lser de luz que separa especficamente
las clulas marcadas.

RADIOINMUNOANLISIS (RIA)
Marcadores: radioistopos (cuantificar en contador de centelleo)
Ventajas: muy sensible, rpido y fcil
Desventajas: instalaciones costosas, corta vida media de istopos.
a) Radioinmunoanlisis directo o RIA competitivo: Se emplea Ag marcado que
es desplazado por el Ag no marcado de la muestra.
b) Radioinmunoanlisis indirecto o RIA no competitivo: Se utiliza un Ac antiinmunoglobulina marcado con radiactividad. Ej. Se utiliza para medir IgE especficas
de Ag en animales alrgicos.

PREGUNTAS:
1- Por qu en la citometra de flujo se emplean anticuerpos monoclonales y no
policlonales?
2- La inmunofluorescencia indirecta es ms sensible que la directa? Por qu?
3- Por qu se emplea el RIA para detectar IgE srica y no se usan otros mtodos
empleados con la IgG?
4- Es lo mismo un ttulo de 1:50 por inmunofluorescencia y por RIA? Por qu?
5- Qu son los anticuerpos secundarios y cmo se obtienen?

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