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Prof: Liliana Castro

ANTICUERPOS MARCADOS:
“LOS ANTICUERPOS POR SU EXQUISITA ESPECIFICIDAD PARA DETERMINADOS ANTÍGENOS HACE QUE SEAN REACTIVOS MUY ÚTILES PARA DETECTAR, PURIFICAR Y CUANTIFICAR AGS”.

ANTICUERPOS MARCADOS:

ANTICUERPOS MARCADOS: EXISTEN TÉCNICAS BASADAS EN ACS PARA ESTUDIAR PRACTICAMENTE CUALQUIER TIPO DE MOLÉCULA EN SOLUCIÓN O EN CÉLULAS. ANTICUERPOS MONOCLONALES O POLICLONALES .

. constituyendo una población homogénea Anticuerpos policlonales: Son aquellos que proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados.ANTICUERPOS MARCADOS: Anticuerpos monoclonales: Son aquellos Acs que derivan de un sólo clon de linfocitos B y son específicos para un epítope determinado.

Inmunización de animales contra el antígeno para el que se desea producir Anticuerpos (Resp poli) 2. Fusión de los linfocitos B esplénicos(memoria) con células de mieloma formando hibridomas 3. Selección de aquellos hibridomas que sean productores de las inmunoglobulinas específicas deseadas 4.Obtención de Anticuerpos Monoclonales: 1. Clonación .

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De ésta unión surge un tipo de célula inmortal con la capacidad virtualmente ilimitada de producción de Acs monoclonales. 2. 3. que aporta la memoria inmune y la capacidad de producir Acs contra el Ag específico... llamada hibridoma. que aporta su capacidad de división ilimitada (inmortalidad).Una célula tumoral de mieloma no secretora de Acs..Un linfocito B de un animal previamente inmunizado con el Ag de interés. . útil en el proceso de selección posterior de los hibridomas.Células empleadas para la Obtención de Anticuerpos Monoclonales: 1. deficiente en la enzima hipoxantina.guanina fosforribosil transferasa (HGPRT).

Obtención de Anticuerpos Monoclonales: .

. 2.Las técnicas de inmunofluorescencia (IF). las cuales son muy sensibles y permiten la identificación de Ags o Acs.REACCIONES CON ANTICUERPOS MARCADOS: Son técnicas de INTERACCIÓN PRIMARIA. ..Los enzimoinmunoensayos (EIA).Los radioinmunoensayos (RIA) y 3. Existen 3 tipos de técnicas que se basan en la interacción primaria: 1..

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Radioactivas RIA(radioinmunoanálisis) o 3.Fluorescentes IF(inmunofluorescencia)..Colorimétricas EIA(enzimoinmunoensayo). 2..ANTICUERPOS MARCADOS: Las señales detectadas en las técnicas son: 1. que consta de un Ag o un Ac unido a una enzima. Se deben a un reactivo denominado: CONJUGADO. a un radioisótopo (en cuyo caso particular se denomina trazador o radioligando) o a un fluorocromo ..

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es la unión del Ag o Ac a la fase sólida. . (Ag o Ac) La inmovilización.Enzimoinmunoensayo (EIA): Son denominados también ELISA de fase sólida (enzyme-linked immunosorbent assay): Se cuenta con una fase sólida en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes. también llamada sensibilización.

.ELISA de fase sólida: (enzyme-linked immunosorbent assay): Se usan para detectar y cuantificar anticuerpos y antígenos.

Glucosa Oxidasa 4..β-Galactosidasa .Fosfatasa alcalina (FA) 3....Lisozima 5.Glucosa 6-P deshidrogenasa 6.Enzimoinmunoensayos (EIA): Las enzimas más usadas son: 1.Peroxidasa de rábano (HRPO o horseradish peroxidase) 2...

.Ortofenilendiamina 3.P-nitrofenilfosfato 2.Ortodianisidina 4..Enzimoinmunoensayos (EIA): Substratos correspondientes: 1...Sustratos incoloros .

.Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA): 1.Métodos no-competitivos a) EIA con Ag unido a la fase sólida .Métodos indirectos b) EIA con Acs unidos a la fase sólida .Métodos directos .

.ELISPOT .Métodos competitivos a) EIA con Acs unidos a la fase sólida b) EIA con Ag unido a la fase sólida 3..Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA): 2.

EQUIPOS NECESARIOS PIPETAS LECTOR DE TIRAS ELISA LAVADOR DE PLACAS LECTOR DE PLACAS ELISA .

. semicuantitativos y cualitativos. Existen distintos tipos de “esquemas”: Tipo directo.Los ELISA no competitivos: Pueden ser cuantitativos. “sandwich” o indirecto.

(ensayo ELISA simple de dos capas) Ag + Ac-E Ag-Ac-E Indica la presencia de Ag en la solución analizada .

ELISA directo .

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.RECOMENDACIONES: 1.Incluir Controles Positivos (soluciones donde se encuentra el Ag buscado. orina... o bien se le ha añadido).) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del Ag buscado..Incluir Controles Negativos que serán mxs del mismo tipo de las analizadas (sangre. 3..Pocillo Blanco o de aire . 2..

.Necesidad de disponer de un conjugado enzimático para cada Ag que pretendamos detectar - .Poco empleados 2..ELISA directo : DESVENTAJAS: 1.

El sistema de detección emplea dos Acs: . .uno secundario marcado contra el primario.uno primario contra el Ag. y .

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ELISA indirecto: .

fosfatasa alcalina Leer la D.ELISA INDIRECTO (peroxidasa. mediante espectrofotometría .O.

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.ELISA sandwich: Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el 2do Ac.

(SANDWICH) Ac 2rio Ac 1rio La detección tiene > sensibilidad por la amplificación de señal debida a la unión de 2 o más Acs 2rios x cada 1rio. .

ELISPOT: Es una modificación del ELISA Permite la detección cuantitativa del Nº de cél en una población que produce Acs específicos contra un Ag determinado (o viceversa) .

LECTURA del ELISA: .

LECTURA del ELISA: La señal será siempre proporcional a la [ ] de la molécula incógnita .

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al ser colocados frente a una cantidad limitada del Ac homólogo fijado a la fase sólida.ELISA: método competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre un Ag marcado enzimáticamente y el mismo Ag sin marcar (muestra objetivo). La cantidad de Ag es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado. .

5.Alta sensibilidad y especificidad 2...Costo accesible 4. rapidez..Fácil manipulación..VENTAJAS DEL ELISA 1..Estabilidad de los reactivos 3.No representa riesgos de contaminación .

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CA-19.T4. etc 3. Enfermedades Virales: Hep. EBV Enfermedades Micoticas: Candidiasis.Marcadores tumorales: CEA.Deteccion de hormonas: ACTH.Deteccion Igs 4. A. brucelosis. aspergilosis. amibiasis Schistosomiasis. etc 2. toxoplasmosis.. CA-125. alfafetoporteina. CMV.APLICACIÓNES DEL ELISA 1. malaria.insulina. rubéola. T3.DETECCION DE Ac CONTRA AGENTES INFECCIOSOS: Enfermedades Bacterianas: Tifus. salmonelosis Enfermedades Parasitarias: Chagas.B. TSH. etc ....C.

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Radioinmunoensayo(RIA): Una sustancia marcada (radioactiva) se utiliza directa o indirectamente para medir de forma cuantitativa la sustancia no marcada. ISÓTOPOS MÁS UTILIZADOS: I125. C14 . utilizando para ello Acs específicos. I131.

Directo o competitivos (RIA) y 2. IRMA: Inmunoradiometría )... .Radioinmunoensayo: Se clasifican en: 1.Indirecto o no competitivos (RBA.

la [ ] de Ac se obtiene midiendo la emisión radioactiva producida por la formación de complejos. .Radioinmunoensayos: Directo o competitivos (RIA): Ags marcados o trazador (Ag*) con isótopos radioactivos reaccionan con Acs específicos.

Radioinmunoensayos: Ensayos competitivos (RIA): Ag* « Ag*Ac Ac + Ag « AgAc .

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de forma que se produzca inhibición de la rx Ag-Ac y se pueda medir la cantidad de material no marcado que se agregó.Indirecto o no competitivo:(RBA.Radioinmunoensayos: 2. .. pudiendo establecerse una proporción entre el Ag marcado y el libre. IRMA) Capacidad de un isótopo de competir con otro Ag marcado ante una cantidad conocida de Ac.

Hipérbolas cpm Sigmoideas cpm Rectas Logit B/ Bo Dosis Log Dosis Log Dosis .RIA: Una vez separadas las fracciones se mide la radioactividad y se obtienen gráficos de desplazamiento o curvas dosis-respuesta que permite encontrar la [ ] de cualquier de Ag no marcado que sea desconocido.

Muchas aplicaciones han sido sustituidas por otras técnicas que ofrecen mas ventajas 6. .En la actualidad de empleo mas restringido 5..Gran auge en sus comienzos (década 60´) 4...Los equipos que se usan para su medición son sumamente sensibles.Método de gran sensibilidad 2.Son las más sensibles de las técnicas.No exentos de inconvenientes (empleo de isótopos radiactivos) 3. 7..Radioinmunoanálisis (RIA) Características: 1....

Detección y cuantificación de Ags y Acs.. ..En la Endocrinología para cuantificar hormonas y drogas con exactitud.Radioinmunoanálisis (RIA) Aplicaciones: 1. ([ ] entre pico y femtomolares). en labs de Bioquímica 2.

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y .Isoluminol .Luminol .Éster de acridina -Tioesteres y sulfaminas. .Ésteres de fenantreno. Indicadores o moléculas quimioluminiscentes utilizados: .Quimioluminiscencia: Es un método de lectura que se basa en el principio de emisión luminosa a través de una reacción (Enzima-Sustrato).

Disminuye el riesgo de efectos operadores en las determinaciones inmunológicas. y .La luciferasa de la renilla. .Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa.Marcadores de enzimas . el tiempo de elaboración de la pba es mucho más corto y mucho menos tedioso. . .La xantina oxidasa La quimioluminiscencia es un método Automatizado. .Fosfatasa alcalina.Peroxidasa del rábano.

peróxido-ácido. En el caso de ésta rx el agente quimioluminiscente es el éster de acridina que es oxidado por el peróxido-ácido y el hidróxido de sodio. Se involucran las siguientes sustancias según el sistema automatizado que sea utilizado: -Éster de acridina. fosfatasa alcalina. hidróxido de sodio. .MECANISMO DE REACCIÓN La emisión de luz se produce por una rx específica química.

nanogramos. -Ensayos en moléculas de DNA..Sensibilidad (límites de detección de moles.-Velocidad (señal generada en unos pocos segs y en algunos casos estable por varias horas) 3. . picogramos) 2. Aplicaciones: -En inmunoensayos...Ventajas de la quimioluminiscencia: 1. -Marcaje de proteínas.Procedimientos simples.Sin residuos peligrosos. y 4.

Inmunofluorescencia
Consiste en inmovilizar células, bacterias u otras partículas naturales sobre un portaobjeto o similar, donde la incógnita puede ser tanto: 1.- Ag [se puede realizar una inmunofluorescencia directa (IFD)] o 2.- Ac [una I indirecta (IFI)].

I. DIRECTA

I. INDIRECTA

FLUOROCROMOS MAS UTILIZADOS. Amarillo/verdoso 3. (Isotiocianato de tetrametilrodamina) 550nm .FLUORESCEÍNA: (Isotiocianato de fluoresceína) 490-495 nm..RODAMINA. Rojizo 2..NARANJA DE ACRIDINA .Inmunofluorescencia FLUOROCROMOS: Sustancias químicas capaces de emitir luz cuando son excitadas por una determinada longitud de onda. 1..

Principal inconveniente: Necesidad de disponer de difs Acs conjugados (uno por cada tipo de Ag que se quiera detectar) Secuencia de reacción: Ag + Ac-F Ag-Ac-F .Inmunofluorescencia directa (IFD): Fluorocromo unido al Ac específico. Empleada para detección de Ags en diferentes muestras.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA .

Pruebas relativamente rápidas Secuencia de reacción: Paso 1: Ag + Ac1 Paso 2: Ag-Ac1 + Ac2-F Ag-Ac1-Ac2-F Ag-Ac1 .Reacción en 2 pasos . anti-IgM o anti-IgA .Posibilidad de determinar la clase de Acs. mediante el empleo de conj anti-IgG.Inmunofluorescencia indirecta (IFI) .

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) .

NEGATIVO POSITIVO .

cultivos de células y secreciones (IFD o IFI).Inmunofluorescencia Ventajas: 1..Permite identificar Ac específicos en suero(IFI) .-Permite identificar Ag específicos de patógenos en tejidos. 2.

Infraestructura necesaria. 2. 4.. 3.Se debe utilizar microscopio UV. ....Poca reproducibilidad (subjetividad del operador)..Inmunofluorescencia Desventajas 1.Fundamentalmente Cualitativa 5.Personal capacitado.