Titulacin Viral por el Mtodo

del Punto Final 50%.

Instituto de Virologa - C.I.C.V. - INTA

TITULACION de VIRUS

1.- Introduccin
"Titular" una preparacin de cido, base, anticuerpo, antgeno, significa determinar la cantidad del
elemento en cuestin que esa preparacin contiene. Lo mismo se aplica en el caso de las
preparaciones virales.
Para preparar los sustratos celulares infectados para inmunofluorescencia, ELISA,
inmunoperoxidasa o hibridizacin es necesario conocer la cantidad de virus conque se trabaja, es
decir el "ttulo" de la suspensin viral. Esto es as porque para que una infeccin viral sea eficiente
se debe trabajar con determinada "multiplicidad de infeccin" (m.i.), que se define como la
cantidad de virus inoculado por clula del cultivo celular. La obtencin de resultados reproducibles
depende del control de todos los elementos que intervienen en el ensayo, y la m.i. es uno de ellos,
que debe definirse para cada procedimiento.
Adems, en ciertos casos de aislamiento viral puede resultar importante conocer cul es la
cantidad de virus aislada.

2.- Conteo de partculas virales

Para determinar la cantidad de virus en un material puede recurrirse al conteo directo de partculas
virales aplicando tcnicas de microscopa electrnica. Este mtodo es tcnicamente complejo y
tiene la grave desventaja de no considerar laactividad biolgica de las partculas virales.
Qu significa sto? Un virus es una partcula macromolecular que se detecta debido a su actividad
biolgica, que se manifiesta cuando la partcula infecta un husped susceptible. La visualizacin de
esa actividad puede consistir en la observacin de efecto citoptico (ECP), o formacin de sincicios
o tumores en un cultivo celular, formacin de pstulas en la membrana corioalantoidea o muerte
de un embrin de pollo, muerte o enfermedad de un animal de experimentacin. Desde el punto de
vista biolgico lo que interesa es la expresin de la actividad biolgica (o infectiva) de la partcula
viral, ya que existen partculas virales que por defectos en su material gentico u otro tipo de
alteraciones en su estructura no son infectivas, es decir no tienen actividad biolgica. Estas
partculas estn presentes en todas las preparaciones virales, en cantidades variables (1).
Para fines diagnsticos propiamente dichos, o para la preparacin de reactivos para diagnstico, lo
que interesa cuantificar es la capacidad infectiva del virus, para lo cual no es adecuado el conteo
de partculas por microscopa electrnica. Debe observarse el efecto que el virus produce en el
husped inoculado. Si se observa un solo ejemplar de husped, el efecto o respuesta es de "todo
o nada", es una respuesta negativa o positiva. Por ej.: hay efecto citoptico o no lo hay; el animal
de experimentacin muere o sobrevive, aparecen pstulas en el embrin de pollo o no. Para poder
hacer una cuantificacin deben utilizarse varias rplicas del husped elegido (cultivos celulares,
animales, huevos embrionados). Cada rplica se denomina "unidad de prueba". Cuanto mayor es el
nmero de unidades de prueba, ms precisa resulta la determinacin.
3.- Mtodo de Titulacin por el Punto Final

3.1.- Curva Dosis-Respuesta

Si se grafica "Efecto viral" versus "cantidad de virus" se obtiene una curva sigmoidea, "DosisRespuesta" clsica (Fig. 1). Por esta razn la forma habitual y ms sencilla de expresar ttulos
virales es segn el nmero de dosis presentes en la muestra. La "respuesta" se mide como
"porcentaje de efecto", siendo el efecto cualquiera de los mencionados anteriormente, segn el
virus y el husped. La "Dosis" se expresa como dilucin de la muestra viral. En general se usan
diluciones al dcimo, y se trabaja con el log 10 de las diluciones.
Puede expresarse el ttulo como Dosis Infecciosa Mxima o Dosis Infecciosa Mnima. En los casos
en que la infectividad se evidencia por la muerte de animales de laboratorio la denominacin es
Dosis Letal Mxima o Mnima respectivamente.

Fig. 1. Curva Dosis- Respuesta

Observando en la Fig. 1 la forma de la curva "Dosis-Respuesta"-- en nuestros trminos "Porcentaje
de Efecto-Dilucin de muestra" -- vemos que en las zonas de efecto mximo y mnimo no puede
asignarse unvocamente un "Porcentaje de Efecto" a una determinada "Dosis o Dilucin". Para una
determinacin precisa debe trabajarse en una zona de diluciones tal que a una pequea variacin
en la dilucin le corresponda una variacin claramente detectable en la respuesta. Por esta razn
se elije la zona correspondiente al 50% de efecto, y el ttulo de la muestra se expresa como nmero
de "Dosis Infecciosas 50%" (DI50), que representa la dosis (dilucin de muestra) que produce efecto
(muerte o enfermedad del animal o embrin, efecto citoptico en cultivos celulares) en el 50% de
las unidades de prueba. Segn el tipo de efecto buscado la DI 50 puede expresarse como Dosis Letal
50%, Dosis Infectante de Cultivo de Tejidos 50%, Dosis Infectante de Embriones 50% (DL 50, DICT50,
DIE50, respectivamente).
3.2.- Mtodo de Reed y Muench
Normalmente el 50% del efecto buscado no corresponde exactamente a una de las diluciones de
trabajo, por lo que es necesario hacer una interpolacin matemtica para definirla. El mtodo ms
empleado para este fin es el de Reed y Muench . Se basa en la suposicin de que el nmero de
unidades de prueba afectadas vara proporcionalmente al log 10 de la dilucin, es decir que a
diluciones menores (mayor concentracin de virus) el porcentaje de efecto ser mayor que a
diluciones mayores (menor concentracin de virus). Adems, se supone que en la zona cercana al
50% de Efecto ste vara linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilucin
intermedia.
Ejemplo: Supongamos que se inoculan 6 ratones por dilucin y que el efecto buscado es la muerte
de los ratones. Se confecciona la siguiente tabla con los resultados (adaptada de (1)):

Dilucin

Log
dil

10

Mtos/
Total

Muerto Sobrev Total

Total
Relaci %Mortalid
s
.
Muerto Sobrev n*
ad
s
.

1: 10

-1

6/6

17

17/17

100

1:100

-2

6/6

11

11/11

100

1:1000

-3

4/6

5/7

71

1:10000

-4

1/6

1/8

13

1:10000
0

-5

0/6

13

0/13

: Muertos/Total

Para obtener las cifras de las columnas "Total Muertos" y "Total Sobrevivientes" se suman las cifras
de "Muertos" y "Sobrevivientes" en el sentido de las flechas. Esto se hace as por la suposicin
antes mencionada de que las concentraciones mayores de virus, por ej. la dilucin 1:10, hubieran
ejercido su efecto sobre todos los ratones inoculados con las diluciones menores; del mismo modo,
las concentraciones menores de virus (dilucin 1:100000), nco hubieran hecho efecto sobre los
ratones inoculados con las concentraciones mayores.
En el ejemplo no hay ninguna dilucin (o log 10 dilucin) tal que el efecto sea exactamente el 50%,
pero vemos que esa dilucin estar entre -3 (71% de efecto) y -4 (13% de efecto). Es importante
recordar que "50% de efecto", o "Efecto del 50%" ( o cualquier otro porcentaje) significa que el
efecto se ejerce sobre el 50% (o el porcentaje que sea) de las unidades de prueba, y que la DI 50 es
aquella que infecta el 50% de las mismas.
Como se dijo, para establecer ese valor se recurre a una interpolacin matemtica.
En la Fig. 2 se representa el % de Efecto total(acumulativo) para cada log10 de dilucin.

Fig. 2: Porcentaje de Efecto vs. -Log10 dil

Nos interesa averiguar el valor "x", que corresponde al log 10 de la dilucin correspondiente a la DI50.
Esto se hace mediante una frmula que puede deducirse trabajando con los tringulos semejantes
de la Fig. 3.

Fig. 3

Los tringulos ABC y AED son semejantes, por lo que sus lados homlogos son proporcionales.

Es decir:

AB BC
AE ED

AB= 71-13

BC=-3-(-4)

AE= 71-50

ED= -3-x

Reemplazando:

71-13 -3-(-4)
71-50 -3-x

El valor de "x" se obtiene por trasposicin de trminos:

x = -3- 71-50 [-3-(-4)]

71-13

El factor [-3-(-4)]= 1 es constante para todos los casos en que se usan diluciones al dcimo.
Corresponde al log10 del factor de dilucin.

Generalizando, es

x= log10 (dilucin que da > 50%) + %>50 - 50%

%>50 - %<50

Resolviendo resulta

log10 DI50= x=-3,36

Esto significa que en una dilucin 1: 10 3,36 del material original hay 1 DI50.
Por lo tanto, en el material original, sin diluir, hay 10 3,36 DI50, que se expresan por unidad de peso o
de volumen de la muestra. El ttulo viral de la misma ser

103,36 DI50/ml

4.

103,36 DI50/g.

Mtodo de Plaqueo

Este mtodo se desarroll con posterioridad al anterior, y es mucho ms preciso. Consiste en

infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo en fase semislida (agar, agarosa,
carboximetilcelulosa, metilcelulosa). De esta manera, cuando un virus infecta una clula, su
progenie slo puede migrar a las clulas inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que el
medio semislido limita su movilidad. Coloreando las clulas se observarn zonas no teidas
(placas de lisis), correspondientes a las clulas destrudas por la partcula infecciosa inoculada y las
nuevas partculas que ella produjo (Fig.4). si la coloracin se realiza con un colorante vital (rojo
neutro), que no mata las clulas teidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que
contendr la progenie viral correspondiente a un nico virus infectante, constituyendo, por lo tanto,
un clon.

En este caso, la curva "Dosis-Respuesta" es lineal (Fig.5), indicando que a cada placa de lisis
corresponde una nica partcula infectante. Por esta razn el mtodo es mucho ms preciso que el
descripto anteriormente, ya que el margen de error es menor. Se calcula que para igualar la
precisin que se logra contando 100 placas de lisis, en el mtodo del punto final debera trabajarse
inoculando 100 unidades de prueba por dilucin.

Fig. 5: Curva Dosis-respuesta del mtodo de plaqueo.

El ttulo de la preparacin viral se calcula contando el nmero de placas que produce una
determinada dilucin de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la
cantidad de virus en la muestra original. Cada partcula infecciosa da origen a una placa de lisis, y

se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El ttulo se expresa como "UFP/ml" o
"UFP/g", segn corresponda.
Por ejemplo: Supongamos que la inoculacin de 0,2 ml de una dilucin 1:1000 de una suspensin
viral produce 84 placas de lisis en un cultivo celular. Esto es equivalente a decir que en ese
volumen de esa dilucin hay 84 UFP. Debemos expresar el ttulo en "UFP/ml".
0,2 ml = 84 UFP
1 ml = (84 UFP x 1 ml): 0,2 ml= 420 UFP
Son 420 UFP/ml en la muestra diluda 1:1000, por lo tanto la muestra original tiene
420 x 1000 UFP/ml.
En notacin cientfica:
4,2 x 105 UFP/ml.

5.- Expresin de la multiplicidad de infeccin

Volvemos ahora a la definicin de "multiplicidad de infeccin", (m.i.), que mencionamos al

principio. Se define como la cantidad de virus inoculada por cada clula. Si, por ej., para
preparar clulas infectadas para inmunofluorescencia se indica que debe ser m.i.=0,1, debe
aclararse si se trata de 0,1 DI50/clula, 0,1 UFP/clula. De esta manera titularemos nuestra el
virus a usar por el mtodo que corresponda. Para la preparacin de reactivos para diagnstico
comunes es suficiente con determinar el ttulo en DI50. En general se trabaja con DICT50.