Neutralización del virus (NV) Empleo: para detectar y medir anticuerpos.

La neutralización del
virus es el método más ampliamente empleado para detectar y medir anticuerpos virales de
importancia en veterinaria. Esta prueba es considerada como la más exacta de todos los
procesos serológicos, siendo menos propensa a variaciones y menos subjetiva en su
interpretación

1 . El principio de ésta prueba se basa en el hecho de que la replicación y actividad del virus, ya
sea el efecto citopático (EC) en el cultivo celular, signos clínicos, lesiones o muerte en huevos
embrionados y en animales, que pueden ser inhibidos por un anticuerpo viral específico. Las
pruebas De NV son casi siempre desarrolladas empleando cultivos celulares. La cepa de virus
para utilizar en las pruebas se cultiva, se alícuota y se almacena a temperaturas ultra-bajas.
Estos virus son dosificados varias veces para determinar la cantidad de virus presente. Las
diluciones del suero de prueba se hacen en placas microtituladoras, seguido de la adición de
un volumen igual de una suspensión viral diluida para contener aproximadamente 100 a 300
dosis infectantes (una dosis infectante es el número mínimo de partículas virales necesarias
para establecer una infección). Después de incubar el suero + virus durante 1 - 2 horas a
temperatura ambiente (algunos sistemas utilizan 37°C o aún 4°C), se adicionan indicadores de
cultivos celulares. Las placas se sellan, se incuban a 37°C, y se observan diariamente para ver el
desarrollo del efecto citopático viral. La presencia de anticuerpo específico en el suero a
analizar inhibe la producción de este efecto citopático. La prueba de NV se emplea también
para identificar un virus desconocido, aislado de la misma manera descrita anteriormente. La
única diferencia es que el anticuerpo es conocido y el virus es desconocido. Si el anticuerpo
específico inhibe el desarrollo de EC del virus desconocido, se realiza la identificación.

4.1 Protection against viruses in a tube (Seroneutralization)

4.1 Protección frente a los virus en un tubo (Seroneutralizacion)

Bienvenidos a un nuevo bloque de videos de este curso, en el que hablaremos del

diagnóstico de la infección vírica a través de la respuesta inmunitaria que los virus
provocan en el hospedador. Empecemos viendo cómo se evalúa el papel protector de
los anticuerpos, lo que se realiza mediante ensayos de seroneutralizacion o
neutralización vírica. Como bien sabes, para que un virus infecte a una célula se debe
producir un reconocimiento entre el receptor celular y ciertas moléculas o epitopos de
la superficie del virus. Pues bien, determinados anticuerpos pueden rodear a esas
moléculas víricas e impedir que sean por el receptor. Estos anticuerpos se denominan
neutralizantes y son muy. Importantes porque realmente van a bloquear el progreso de
la infección, así que son protectores. Como todos los anticuerpos, son muy
específicos, y si las moléculas víricas varían, no se unirían a ellas y dejarían de ser
protectores. La seroneutralizacion se considera la técnica que mejor refleja la
correlación virus-anticuerpos in vivo e in vitro. Se trata de una técnica cuantitativa, por
lo que realizaremos diluciones del suero problema y añadiremos una cantidad
constante de virus. Tras incubar para que haya reacción antígeno-anticuerpos, se
añaden las mezclas a un sistema susceptible para ver la infectividad residual del virus.
Los sistemas susceptibles pueden ser animales de experimentación, huevos
embrionados o cultivos celulares, donde el virus no neutralizado pueda producir un
efecto reconocible, como pueden ser muerte, lesiones específicas, efecto citopático,
hemaglutinación, formación de sincitios, etc.Hay distintas formas para preparar las
diluciones del suero, pero se diferencian sólo en las proporciones. Aquí vamos a hacer
diluciones dobles seriadas, para lo que prepararemos una batería de 10 tubos, a los
que añadimos 250 µl de medio de cultivo. A continuación agregamos 250 µl del suero
al primer tubo, mezclamos bien y pasamos 250 µl de la mezcla al siguiente tubo,y así
sucesivamente. Cada vez que pasamos de un tubo a otro diluimos la cantidad de
anticuerpos presentes en el suero a la mitad. Es decir, en el primer tubo la dilución
será 1:2, en el siguiente 1:4, en el siguiente 1:8, y así hasta el tubo 10 donde será
1:1024. Debemos seguir el mismo procedimiento con unos controles positivo y
negativo de suero. A continuación añadimos a los 10 tubos 250 µl de la concentración
adecuada de virus (con lo que volvemos a diluir a la mitad), agitamos e incubamos 60
minutos a 37°C para que los posibles anticuerpos neutralizantes del suero reaccionen
con los epitopos del virus de unión al receptor celular. Como he dicho antes, la
neutralización se puede observar en animales de experimentación, huevos, o cultivo
tisular. Aquí vamos a hacerlo en cultivo tisular. Traslada

mos 100 µl de cada mezcla suero-virus por cuadriplicado a pocillos de una placa de 96
pocillos en los que hemos cultivado células susceptibles al virus e incubamos las
placas 2 o 3 días o el tiempo necesario para observar el efecto citopático con el
microscopio. Si en el suero hay anticuerpos neutralizantes, no se producirá ningún
efecto. Por supuesto, hay que comparar los resultados del suero problema con los
controles positivos y negativos. Este método cuantitativo nos permite conocer el
llamado título de anticuerpos, en este caso neutralizantes, que se define como el
denominador de la dilución más alta en la que se observa neutralización completa del
efecto citopático en el 50% de los pocillos. Para esto se aplica una fórmula estadística.
Así, tras introducir los datos en la fórmula el resultado indica a cuánto debemos diluir
el suero para obtener protección en el 50% de los pocillos, de los animales, o de los
huevos, dependiendo del sistema que hayamos usado.Esta fórmula es muy útil, y se
emplea mucho para hallar la concentración de virus que produce muerte o infección en
el 50% de los animales (dosis letal 50, o dosis infectiva 50,respectivamente), en el
50% de los pocillos (que es el TCID 50), etc. Como ves, la seroneutralización o
neutralización vírica es una técnica algo laboriosa y más lenta que las técnicas que
veremos en el siguiente video, pero es muy específica y sensible y se considera
prueba de referencia para cualquier valoración serológica.

Muchas gracias por tu atención.

Fundamentos de la reacción
La reacción consiste en mezclar un virus y el suero que se intenta evaluar y determinar
si la capacidad infectante del virus se modifica (por la presencia de anticuerpos
neutralizantes) o no.
La combinación de virus y suero generalmente es débil y en ocasiones el virus no se
inactiva durante el proceso. Por esta razón, la reacción en un primer estadio puede ser
reversible si se somete la mezcla a ciertas condiciones como vibración iónica,
centrifugación, variaciones de pH o simplemente dilución y las partículas virales
vuelven a ser infecciosas.
Existe una relación entre la reversibilidad de la reacción virus-anticuerpo y el tiempo y
la temperatura de incubación. Cuanto mayor sea el tiempo de incubación, la reacción
virus-anticuerpo será cada vez más estable. La temperatura y el tiempo utilizados
dependen del tipo de virus y el huésped con que se trabaja. Generalmente se utiliza 1
hora a 37 ºC, pero los protocolos varían según el sistema y se fijan para poder
comparar resultados.
Una de las explicaciones del fenómeno de neutralización es que el anticuerpo
específico envuelve a la partícula viral e impide que ésta se ponga en contacto con las
células susceptibles.
Algunos autores afirman que hay dos etapas en la neutralización:

1) Formación de partículas no infectivas pero absorbibles a las células por los sitios
libres del virus.

2) Formación de partículas no infectivas ni absorbibles, por bloqueo de todos los sitios

activos.

La presencia del virus no neutralizado se detecta a través de diferentes sistemas como

cultivos celulares (ya sean primarios, secundarios o líneas celulares), animales de
laboratorio (ratones, hámster, etc.) o embriones de pollo (utilizando distintas vías de
inoculación: corioalantoidea, alantoidea, cavidad amniótica