Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
CARRERA: ENFERMERA
!
1. Identificacin de la Asignatura
CURSO
: MICROBIOLOGA GENERAL
CDIGO
: BIOL 150
CARRERA
: ENFERMERA
TIPO DE ACTIVIDAD:
TERICO-PRCTICO
2. Profesores
Prof. Coordinador de la asignatura: Dr. Rodrigo Villanueva (rodrigo.villanueva@unab.cl)
Profs. Encargados de Ctedra:
Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (paula.rodas@unab.cl, Seccin 1)
Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (Seccin 2)
Dra. Pamela Machuca (pamela.mac@gmail.com, Seccin 3)
Prof. Coordinadora de Laboratorio: Mg. Camila Miranda (camila.miranda.c@gmail.com)
Profs. Laboratorio:
Mg. Karina Espinoza (karinafespinozag@gmail.com)
Mg. Valeska Herrera (vale.herrera@uandresbello.edu)
Mg. Luis Saona (lsaona@ug.uchile.cl)
Lic. Rhonda Veas (rh.veas@uandresbello.edu)
Lic. Pa Viera (pia.vierav@gmail.com)
Dra. Pamela Machuca (pamela.machuca.v@gmail.com)
Dr. (C) Ignacio Fuentevilla (iafuentevilla@gmail.com)
Secciones de laboratorios:
Seccin 4: Prof. Camila Miranda/Rhonda veas
Seccin 5: Prof. Rhonda Veas/Camila Miranda
Seccin 6: Prof. Ignacio Fuentevilla /Pa Viera
Seccin 7: Prof. Pa Viera /Ignacio Fuentevilla
Seccin 8: Prof. Pamela Machuca/ Karina Espinoza
Seccin 9: Prof. Karina Espinoza/Pamela Machuca
Seccin 10: Prof. Pa Viera /Rhonda Veas
Seccin 11: Prof. Rhonda Veas/ Pa Viera
Seccin 12: Prof. Valeska Herrera/Karina Espinoza
Seccin 13: Prof. Karina Espinoza/Valeska Herrera
Seccin 14: Prof. Camila Miranda/ Luis Saona
Seccin 15: Prof. Luis Saona/Camila Miranda
BIOL 150T-2
Lu 3 de Agosto
Vi 7 de Agosto
Vi 7 de Agosto
Filogenia y Taxonoma
Morfologa y Agrupaciones
Ma 11 de Agosto
Lu 10 de Agosto
Fisiologa Bacteriana
Vi 14 de Agosto
Vi 14 de Agosto
Ma 18 de Agosto
Lu 17 de Agosto
Gentica Bacteriana I
Vi 21 de Agosto
Vi 21 de Agosto
Gentica Bacteriana II
Ma 25 de Agosto
Lu 24 de Agosto
Antimicrobianos y Resistencia I
Vi 28 de Agosto
Vi 28 de Agosto
Antimicrobianos y Resistencia II
Ma 1 de Septiembre
Lu 31 de Agosto
Relacin hospedero-parsito
Vi 4 de Septiembre
Vi 4 de Septiembre
Infecciones estafiloccicas
Ma 8 de Septiembre
Ma 8 de Septiembre
Ma 22 de Septiembre
Lu 21 de Septiembre
Infecciones Estreptoccicas
Vi 25 de Septiembre
Vi 25 de Septiembre
Ma 29 de Septiembre
Lu 28 de Septiembre
Enterobacterias I
Vi 2 de Octubre
Vi 2 de Octubre
Ma 6 de Octubre
Lu 5de Octubre
Vi 9 de Octubre
Vi 9 de Octubre
Ma 13 de Octubre
Vi 16 de Octubre
Ma 20 de Octubre
Ma 20 de Octubre
Vi 23 de Octubre
Vi 23 de Octubre
Ma 27 de Octubre
Lu 26 de Octubre
Vi 30 de Octubre
Vi 30 de Octubre
Virologa. Generalidades
Replicacin viral
ACTIVIDAD
Presentacin del Curso
Introduccin
SOLEMNE I
Mdulos 12 y 13
SOLEMNE II
Mdulos 12 y 13
Ma 3 de Noviembre
Lu 2 de Noviembre
Vi 6 de Noviembre
Vi 6 de Noviembre
Ma 10 de Noviembre
Lu 9 de Noviembre
Vi 13 de Noviembre
Vi 13 de Noviembre
Nemtodos Intestinales II
Cstodes Intestinales
Ma 17 de Noviembre
Lu 16 de Noviembre
Protozoos Intestinales
Helmintos Tisulares
Vi 20 de Noviembre
Vi 20 de Noviembre
Protozoos Tisulares
Ma 24 de Noviembre Ma 24 de Noviembre
Vi 27 de Noviembre
Vi 27 de Noviembre
Mi 9 de Diciembre
Mi 9 de Diciembre
SOLEMNE III
Mdulos 12 y 13
Artrpodos de inters mdico
Malaria, amebas de vida libre
EXAMEN
Mdulos 7 y 8
Fecha
Seccin
ACTIVIDAD
10 Agosto
4-6-8-10-12-14
11 Agosto
5-7-9-11-13-15
17 y 18 Agosto
4-6-8-10-12-14
24 y 25 Agosto
5-7-9-11-13-15
31 Ago y 1 Sept
4-6-8-10-12-14
7 y 8 Sept
5-7-9-11-13-15
21 y 22 Sept
4-6-8-10-12-14
28 y 29 Sept
5-7-9-11-13-15
5 y 6 Oct 2014
4-6-8-10-12-14
19 y 20 Oct 2014
5-7-9-11-13-15
26 Octubre
4-6-8-10-12-14
27 Octubre
5-7-9-11-13-15
16 Nov 2014
4-6-8-10-12-14
07. Parasitologa
17 Nov 2014
5-7-9-11-13-15
07. Parasitologa
23 Nov 2014
23 Nov 2014
5. Requisitos de asistencia
La asistencia a clases tericas debe ser superior al 80%. La asistencia a los laboratorios debe ser
de 100%. La justificacin de inasistencia a alguna actividad se debe realizar en la Direccin de la Escuela de
Enfermera. Los alumnos debern presentar una fotocopia validada del certificado mdico o similar al
profesor encargado de ctedra o laboratorio (segn corresponda) dentro de los 7 das hbiles despus de
presentado el justificativo. Ms de un 20% de inasistencia (incluso justificada) equivale a la Reprobacin
automtica del curso.
La puntualidad para las actividades prcticas es indispensable, ya que los controles de entrada
se realizarn durante los primeros 10 minutos. El alumno que llegue al laboratorio despus de ese tiempo ser
calificado con nota 1,0. Si un alumno llega con un atraso superior a 30 minutos, no podr realizar la actividad
prctica y la situacin ser considerada como inasistencia.
No se permitirn cambios de seccin en los trabajos prcticos, cada alumno debe permanecer en
la seccin que le corresponde durante todo el semestre.
5. Condiciones para aprobar el curso:
El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, segn la planilla de clculo del sistema
en Intranet.
La nota de presentacin se calcular de acuerdo a los siguientes parmetros:
TERICO:
La ponderacin de la parte terica del curso corresponde al 70% de la nota de presentacin, segn:
Prueba Solemne I: 25%,
Prueba Solemne II: 25%,
Prueba Solemne III: 20%.
PRCTICO:
La ponderacin de la parte prctica del curso corresponde al 30% de la nota de presentacin, segn:
1) Controles de entrada: 70%,
2) Informes: 30%.
El promedio de las actividades sealadas con la ponderacin establecida corresponde a la nota de
presentacin.
PROMEDIO FINAL:
1) Nota presentacin: 70%
2) Examen Terico!Prctico: 30%
Los alumnos que sean sorprendidos en actividades irregulares (copia, uso de torpedos, plagio, etc) en
pruebas solemnes, controles de laboratorio, informes de laboratorio, pruebas parciales o durante el examen
final, sern evaluados con nota 1,0 en esa actividad. Particularmente, se considerar plagio la facilitacin y/o
utilizacin de informacin de otros grupos del curso, as como el uso de informacin de internet sin
citar con su respectiva referencia bibliogrfica.
Los alumnos que presenten bloqueos de cualquier tipo y no aparezcan en las listas oficiales tienen
como plazo mximo para regularizar su situacin el da Lunes 14 de Septiembre, de lo contrario no podrn
hacer ingreso a la sala de clases.
6. Prueba Recuperativa
Ante la inasistencia a una Solemne, se considerar el Examen como prueba recuperativa. Slo
tendrn derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas ante la Escuela
de Enfermera.
7. Condiciones de eximicin
Se eximirn del examen final SLO los alumnos que alcancen una nota 4,95 superior que NO
hayan obtenido ninguna nota roja en las pruebas solemnes ni en los controles e informes del laboratorio
(Condiciones establecidas que se rigen segn el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artculo 40).
8. Metodologa de actividades acadmicas
El curso se desarrollar a travs de clases tericas presenciales, distribuidas en 4 horas semanales, con
uso de material audiovisual y guas de apoyo. Los trabajos prcticos se desarrollarn en los laboratorios de
microbiologa con actividades programadas para que cada alumno manipule material microbiolgico y
aprenda las tcnicas bsicas de la microbiologa, bajo la supervisin de dos profesores por sala.
Los controles son de tipo verdadero y falso, donde solo las preguntas falsas se responden de la
siguiente manera:
Pregunta1:
__F_ El pasto es azul.
Respuesta: El pasto es verde.
No se evaluaran como respuestas correctas si Ustedes justificaran que el cielo es azul. Porque no se le esta
preguntando por el cielo, sino que por el pasto.
Informes:
Durante cada trabajo prctico los alumnos debern entregar un informe de las actividades realizadas,
los resultados obtenidos y la correspondiente discusin de estos, para esto los alumnos realizaran un informe
pre-establecido, el cual se completara durante las secciones practicas de laboratorio. Los informes se deben
completar con los datos solicitados segn corresponda en cada actividad prctica. En los informes se
evaluarn los resultados obtenidos (si fueron realizados correctamente los objetivos del practico) y las
metodologas utilizadas. Los grupos de trabajo son de DOS PERSONAS, las cuales deben trabajar juntas
durante todo el semestre, SIN DERECHO A SEPARARSE.
Participacin: Se espera participacin activa en clases teoricas y practicas, por lo que el alumno
debera tener conocimiento de los contenidos que se abordaran en la clase y de materias anteriores.
En todas las clases se realizarn interrogaciones orales sorpresas de materia del prctico
correspondiente o prcticos pasados, una buena respuesta conlleva a una evaluacin positiva, de lo
contrario una mala respuesta ser evaluada con puntaje negativo, reflejado dicho puntaje en el
control.
Evaluacin: Cada alumno es responsable de traer consigo lpiz, goma y corrector. No se aceptarn
prstamos entre los alumnos mientras se realice la evaluacin.
Queda estrictamente prohibido el uso de celulares dentro de la sala, por lo que se solicita apagar!"
silenciar estos previo al ingreso a las actividades del curso. Ademas, el uso de grabadoras, mp 3, mp4, etc.
durante las evaluaciones y revisiones de las solemnes y controles queda extrictamente prohibido.
La asistencia al laboratorio es obligatoria, y de la misma manera es obligatorio el
cumplimiento de las siguientes normas:
Asistencia con delantal blanco y calzado apropiado (cerrado).
En caso que el alumno(a) tenga pelo largo debe asistir al laboratorio con este tomado con un moo
tipo tomate.
TRABAJO PRCTICO N1
PROCEDIMIENTOS BSICOS
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRCTICOS DE MICROBIOLOGA
Durante el desarrollo de las actividades prcticas se debe mantener una serie de normas, cuyo propsito
fundamental es la preservacin de la salud del alumno, sus familias y la comunidad.
1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminacin de sus ropas.
2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.
3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado, se exige moo tipo tomate.
4. Est estrictamente prohibido comer, beber, fumar, masticar chicle, o llevarse cualquier objeto a la boca, por
el riesgo de contagio.
5. No ingresar bolsos, pauelos, bufandas o chaquetas a la sala de trabajos prcticos.
6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y despus de su uso. Al enfriarla, evite salpicar, los
aerosoles son muy contagiosos.
7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material cortopunzante.
8. Las placas de Petri slo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor a los 30 cm del
mechero Bunsen encendido.
9. Los tubos deben flamearse (la boca del tubo) antes y despus de ser utilizados.
10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto tambin se recomienda
frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto con material contaminado.
11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. ste slo debe encenderse al momento de la
observacin de su tincin. La que debe retirarse terminada la observacin (y ser eliminada donde corresponde),
y para limpiar el objetivo 100 x se utiliza solucin limpia lentes y papel tissue.
12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y despus de realizado el trabajo prctico, por
lo tanto en su bandeja Usted encontrara un aspersor con Etanol 70 % y algodn.
El estudio de bacterias, virus, parsitos y hongos potencialmente patgenos para el hombre, animales u otros
seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los procedimientos empleados. Las normas
de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable el riesgo asociado a su manipulacin. Deben considerarse
para lograr que el personal que manipula estos agentes infecciosos en el mbito hospitalario estn
mnimamente expuestas a adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.
Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A travs del flameado se evita
la contaminacin de tubos y matraces., al someterlos directamente a la llama.
b) Radiaciones
Rayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicacin del DNA durante la
replicacin celular.
Se usa principalmente en ambientes de quirfanos, sala de prematuros, esterilizacin de superficies.
Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilizacin en fro de
materiales desechables como: jeringas, bisturs, catteres, prtesis, guantes de ciruga y equipos de transfusin.
2.- Mtodos Mecnicos
Ondas snicas y ultrasnicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendo desnaturalizacin de protenas
y muerte celular.
Filtracin: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias lquidas o gases, mediante su paso
a travs de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es la esterilizacin de sueros o lquidos
que contengan protenas o metabolitos termolbiles.
3.- Mtodos Qumicos (antispticos y desinfectantes)
La penetracin de estos agentes es ms rpida en bacterias Gram positivo, debido principalmente a la presencia
protectora de la membrana externa en las bacterias Gram negativo.
Los agentes qumicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al encontrarse contaminados
con bacterias, siendo el gnero Pseudomonas el ms habitual. Esto es de suma importancia y para evitarlo es
imprescindible que el personal de salud cuente con un acabado conocimiento del tema.
El siguiente cuadro resume los principales agentes qumicos y su utilidad
AGENTE
Alcoholes 70%
ACCIN
Sobre formas vegetetivas (no esporas). Desnaturaliza
protenas.
APLICACIN
Piel y superficies inertes
Cloro
Yodo/povidona
yodada
No
Si
Qumica
Autoclave
Autoclave
Llama Mechero
Autoclave
Autoclave
Qumica
Tubos estriles**
Si
No
Si
Si
Si
No
Desechable
Desechable
Re-utilizable
Re-utilizable
Desechable
Desechable
Re-utilizable
Re-utilizable
Tipo de material
** Cada vez que se destape un tubo estril, se debe flamear su boca y repetir la operacin inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar
la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.
* Este material se pueden encontrar en cilindros metlicos o envueltas en papel, ya estriles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo
y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.
No
No
Si
No
Asa de platino
Tipo esterilizacin
Esterilizacin
Material
18 24 Hrs.
Figura N 3: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.
h.
colonias.
Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e
introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla.
Flamear y tapar la boca del tubo.
Colocar la tapa de la placa sobre el mesn cerca del mechero.
Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello:
v. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la
placa. Flamear el asa.
vi. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector
contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamear el asa.
vii. A partir de las ltimas lneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario
de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.
viii. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener
cuidado de que cuando se hacen las estras en ii.) y iii.) no tocar las que ya se
encuentran en la placa.
Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin.
D
18 24 Hrs.
4.
Figura N 4: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a agar en placa Petri.
Figura N 5: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar tendido.
Figura N 6: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar blando.
Figura N 7: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar semi tendido.
8.
Tcnicas de esterilizacin
7.1. Flameado
c. Flamear el asa para su esterilizacin, enfrela en la tapa y deslcela suavemente por la otra
mitad del agar.
d. Cerrar la placa.
e. Incubar la placa a 37C.
9.
Desinfeccin y Asepsia
8.1. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos.
b. Tomar una trula estril y humedecerla en suero fisiolgico.
c. Deslizarla rpidamente por un sector del mesn de trabajo, alejado del mechero (ms de 30
cm).
d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag).
e. Humedecer la misma trula con la solucin de cloro, espere tres minutos.
f. Ahora pasar la trula por la otra mitad del agar (Zig-Zag).
g. Incubar la placa a 37C por 24hr.
8.2 Yodo
a.
b.
c.
d.
Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar.
Tome un trozo de algodn con yodo y aplquelo en el dedo que utiliz, espere unos segundos.
Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
Incubar la placa a 37C.
8.3 Alcohol
Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo slido (Placas de Agar).
2.
3.
2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo lquidos y slidos sembrados en la primera
sesin. Describa lo observado.
3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Describa
lo observado en ambas mitades del agar.
4. Realizar anlisis de morfologa microscpica
4.1 Preparacin de frotis bacteriano a partir de una colonia.
a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lmina (del tamao de una arveja).
b. Flamear el asa para su esterilizacin.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.
d. Obtener una pequea muestra desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto, suavemente,
formando una capa delgada.
f. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque.
4.2 Tincin simple
a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%
b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusin del colorante
c. Lavar suavemente con agua.
d. Secar con papel absorbente
e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil (USAR ACEITE DE INMERSIN).
f. Describa lo que observa: forma, agrupacin, color.
MICROSCOPIO PTICO:
Sistema ptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecnico
o SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
o REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico
que consigue el enfoque correcto.
TRABAJO PRCTICO N2
MORFOLOGA BACTERIANA
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es una preparacin slida o lquida hecha especficamente para el crecimiento,
almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios lquidos pueden ser usados en tubos de ensayo o en
botellas de vidrio. Los medios slidos se obtienen de una solucin de nutrientes solidificada con agar
(polisacrido obtenido de ciertas algas marinas que acta como agente gelificante) o gelatina y se usan en
placas Petri. El agar es el agente gelificante ms comnmente usado ya que no es atacado por la mayora
de las bacterias y no se funde a 37C (T usada para la incubacin de las bacterias).
Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de microorganismos que se
desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (protenas, aminocidos y/o sales inorgnicas que
contengan nitrgeno) y fuentes de energa (carbohidratos, protenas o sales inorgnicas).
Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clnica:
- Agar nutriente (corriente): Es un medio bsico usado con propsitos generales para el cultivo de
muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la adicin de sustancias adecuadas.
- Agar sangre: Es un medio enriquecido y diferencial. Se prepara en base a agar nutriente enriquecido con
5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella
pertussis (agente causal de tos convulsiva) y tambin para detectar hemlisis. Al calentar el agar sangre a
70-80C hasta obtener un color caf se obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es
ms apropiado que el agar sangre para el crecimiento de ciertos patgenos, como por ejemplo Neisseria
gonorrhoeae.
- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y cristal violeta para
inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan de
las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entricas que utilizan lactosa (tales como E. coli)
forman colonias rojas debido a que los productos acdicos que se forman a partir de lactosa afectan el
indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entricas que no usan lactosa (por
ejemplo muchas cepas de Salmonella spp.) forman colonias incoloras.
Clasificacin de los medios de cultivo
1.- Segn estado fsico:
a. Slidos (solidificados por adicin de agar al medio lquido o de alguna protena coagulada).
b. Lquidos
c. Semislidos
por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la espora se debe
a la estructura proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace
resistentes a tincin. Por este motivo las esporas se tien en caliente.
b. Observacin de cpsula: se trata de una tincin negativa usando tinta china que permite determinar la
presencia de cpsulas polisacardicas.
El estudio macro y microscpico de una muestra bacteriana permite obtener una orientacin preliminar de
su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioqumicas especficas que permitirn una identificacin
ms certera y precisa.
La tcnica de mayor importancia en el rea de la microbiologa, es la tincin de Gram (Figura N 2), pues
divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Adems permite
diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupacin bacteriana (pares, cadenas, racimos).
La tincin de Gram consiste en teir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego tratarlas con una
solucin mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se tien en estas condiciones. Sin
embargo, slo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como
etanol o una solucin decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram
positivo; las que se decoloran son Gram negativo y para observarlas debern teirse con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se vern de color violeta y las Gram negativo de
color rojo o rosado.
La diferencia en la reaccin frente a la tincin de Gram se debe a la diferencia en la composicin
qumica de las estructuras externas de las bacterias (pared celular). Las bacterias Gram positivo tienen
una capa gruesa de peptidoglicn o murena, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad
de peptidoglicn y tienen una membrana externa (adems de la membrana citoplasmtica). La
explicacin ms aceptada es que, luego de la accin de la solucin decolorante, las bacterias Gram
positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicn. En cambio, las Gram negativo,
pierden parte de los lpidos de su membrana externa por accin del decolorante (un solvente orgnico
como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicn, hace que se
decoloren. Es importante destacar que la etapa crtica en la tincin es la de decoloracin, por lo que se
debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.
Tambin es importante sealar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como Gram negativo en
algunas condiciones: en cultivos viejos (de ms de 24 48 horas), a pH cido y en condiciones de
decoloracin muy prolongada.
Un gnero bacteriano que representa una excepcin a la tincin de Gram (no se tien) es Mycobacterium
(bacilos cido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M. tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae
(Bacilo de Hansen) deben ser teidos con la tincin de Ziehl Neelsen.
Son bacterias que se tien con dificultad, pero una vez teidas, el colorante no se libera, an por accin de
decolorantes enrgicos como una solucin de alcohol y cido clorhdrico. Esta resistencia se debe a la gran
cantidad de lpidos que tiene su cubierta, incluyendo cidos grasos de alto peso molecular que constituyen
entre el 20 y 40% del peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lpidos le confiere a este
grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio lquido),
resistencia a la accin de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido a la dificultad de absorcin
de nutrientes a travs de esta pared celular lipdica.
Permanganato de Potasio
Auramina Rodamina
Ziehl-Neelsen
Auramina / rodamina
(fluorescencia)
Naranja de Acridina
Gimnez
Anaranjado de acridina
Kinyoun
PRINCIPIO
REACTIVOS
Tincin de esporas
Gram
TINCIN
Micobacterias
Micobacterias (BAAR*)
de Chlamydia
UTILIDAD
ACTIVIDADES PRCTICAS
Primera sesin prctica
OBJETIVOS
1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo slido (Placas de Agar) de
acuerdo a criterios macroscpicos.
2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tincin de Gram, tincin de cpsula y tincin de esporas.
3. Observar endosporas y su disposicin en formas vegetativas de Bacillus spp.
4. Observar la presencia de cpsula en Klebsiella spp.
SIEMBRA DOS BACTERIAS EN DISTINTOS MEDIOS SOLIDOS
1.- Siembre mediante tcnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el laboratorio tanto en agar
sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37C por 24hrs.
OBSERVACIONES MICROSCPICAS
1. Tincin de Esporas.
Procedimiento:
a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamao de una arveja) sobre el portaobjeto.
b. Esterilizar el asa y obtener una pequea muestra desde la placa de Bacillus spp.
c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
d. No olvidar esterilizar el asa despus de usarla.
e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuacin agregar solucin colorante Verde de malaquita. El
colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.
f. Esta tincin se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del
mechero hasta observar emisin de vapor durante 3 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra
o se rompa el portaobjeto.
g. Si la emisin de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.
h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de malaquita y el papel.
i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.
j. Lavar con agua.
k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersin.
D
Papel
Absorbente
Verde Malaquita
Safranina
NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamao que las bacterias) son
pequeas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas ltimas se
determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de la clula y, si la espora deforma o no al bacilo.
2. Tincin de Cpsula.
Procedimiento:
a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamao de una arveja.
b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 4 veces (slo agregar la bacteria). La
Tinta china impide ver si la solucin tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con
suficiente cultivo.
d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegrese de esterilizar el asa
previamente y de enfriar sta en las paredes del tubo.
e. Realizar un frotis extendiendo la suspensin de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza
tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta chinabacteria. Ver figura.
f. Fijar suavemente en el mechero.
g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.
h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersin.
F
E
Fucsina
Bacteria
s
Cpsula
Figura N 9: Procedimiento Tincin de Cpsula.
TRABAJO PRCTICO N3
FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLNICAS DE
BACTERIAS GRAM POSITIVO
Como en la mayora de los animales, el organismo humano posee lugares que normalmente se
mantienen estriles y otros donde cohabitan, tambin normalmente, una gran diversidad y una cantidad
sorprendente de microorganismos, an en las personas ms sanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la
mdula sea y las vas areas inferiores (bronquios y alvolos), entre muchos otros, carecen de
microorganismos debido a los mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos,
vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal
(microbiota comensal) del ser humano.
La colonizacin microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros
microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del rea perineal, hacia la
piel, la boca, la nariz y regin farngea del nio. Las biotas caractersticas de stas y otras reas, se desarrollan
posteriormente y probablemente se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.
Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de sustancias alimenticias, que favorecen el crecimiento de
saprfitos.
Zona boca, regin orofarngea y vulva: Con sustancias provenientes del exterior o acumulacin de restos
celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia de anaerobios.
Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido lipdico, que tiende
a seleccionar una biota algo diferente.
Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en nmero a las formas facultativas y aerobias por un
factor de 10 a 100 o ms. Existe una interaccin permanente entre los componentes de la flora y el hospedero,
que provoca fluctuaciones en la biota, tanto cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones
incluyen los beneficiosos, inaparentes, hasta los perjudiciales.
Algunos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del
cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus
mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como Clostridium
tetani.
La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram positivo, como
Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fngica como Candida albicans.
Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a travs de la nasofaringe, la
trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y
deglutidos. As, los senos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles. La
nasofaringe es el hbitat natural de bacterias y virus patgenos que causan infecciones en la nariz, garganta,
bronquios y pulmones.
Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos descargando estos
microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.
Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin embargo este
equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crtica
- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecnicas por traumatismos.
Esto produce una proliferacin e invasin de los microorganismos, dando origen a una infeccin endgena. Por
lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades, como son:
- Deficiencia en el estado inmunitario del husped.
- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugas.
- Uso de antibiticos.
Como ejemplos de infeccin endgena se pueden mencionar:
- Infeccin urinaria por Enterobacterias.
- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)
- Diarrea por sobreinfeccin de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibiticios.
ETAPAS DEL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
Para llegar a la identificacin de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El primero implica la toma
de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados segn la sospecha clnica.
El segundo paso corresponde al examen microscpico directo, con o sin tincin.
El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de cultivo adecuados donde
la muestra y las bacterias, que sta pudiese o no contener, puedan encontrar los nutrientes y factores adecuados
para propiciar su crecimiento y desarrollo.
El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrir a determinar su morfologa bacteriana
como su posible agrupacin, y se aplicar distintas pruebas bioqumicas y fisiolgicas destinadas a conocer sus
caractersticas metablicas.
Por ltimo se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.
TOMA DE MUESTRA
EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO
(Gram o Ziehl-Neelsen)
AISLAMIENTO DEL AGENTE
IDENTIFICACIN FISIOTAXONMICA DEL AGENTE
Tincin: Morfologa y agrupacin
Pruebas Bioqumicas
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
INFORME
SELECCIN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS
MICROBIOLGICOS
En la recuperacin del o los microorganismos causantes de la infeccin, lo ms importante es la correcta
recoleccin de una muestra para su estudio microbiolgico.
Esta recoleccin comprende cuatros pasos importantes:
1.
2.
3.
4.
Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea
posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados.
Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo etiolgico real, y la
recuperacin de contaminantes puede llevar a indicar una antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso
perjudicial. Debe recordarse entonces, que la calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser
superior a la calidad de la muestra recibida.
Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo ste parte activa, es necesario
explicarle el porqu del procedimiento y el tipo de tcnica a realizar, para lograr as su colaboracin y
participacin, lo que lleva a la obtencin de la muestra en ptimas condiciones.
Recoleccin y transporte de la muestras:
Preparacin del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por aspiracin, se
debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%, seguido por povidona yodada, la
que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se
debe usar solo alcohol.
Volumen. Si es posible obtener muestras lquidas (mediante aguja o aspiracin) no debieran usarse trulas. El
volumen de muestra que se enva al laboratorio es generalmente menor de lo requerido. No existe consenso
sobre los volmenes mnimos para cada tipo de muestra.
Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes mtodos de recoleccin, desde la trula hasta aparatos
recolectores de muestra.
Las trulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de calcio o polyster).
stas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estril con un medio de transporte. Para muestras
lquidas, lo ms adecuado es usar envases plsticos estriles, o tubos con tapa rosca.
Tcnicas de recoleccin. Con el fin de obtener una muestra ptima para la recuperacin del agente etiolgico
es necesario seguir las instrucciones dadas ms adelante.
Medio de transporte. No deben usarse trulas sin medio de transporte (excepto para ciertas tcnicas
especficas) porque esto lleva a la desecacin de la muestra y a la prdida de la viabilidad bacteriana. Los
medios de transportes recomendados cuando se usan trulas, en el caso de las secreciones, son del tipo tampn
(Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til para suprimir
cambios oxidativos en el medio de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los
microorganismos durante su envo al laboratorio.
PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS DE
DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS
INFECCION TRACTO URINARIO (ITU)
(Orina, secrecin uretral y prosttica)
UROCULTIVOS
Muestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y retrayendo el prepucio
en el varn durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de orina, a fin de arrastrar mecnicamente la
flora externa del tracto genitourinario.
Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptculo estril y sin interrumpir la miccin. Tener presente de
poner un tapn vaginal en la mujer a fin de evitar contaminacin con la flora vaginal.
Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las primeras dos
horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4C y trasladarla manteniendo la cadena de fro.
Muestra por puncin de catter urinario: Desinfectar el sitio de puncin del segmento proximal del catter
con alcohol 70%, aspirar con jeringa estril entre 2 a 5 ml de orina, vaciar en tubo estril y transportarla al
laboratorio de la misma forma que la muestra miccional.
Muestras por puncin suprapbica: Antisepsia de la piel en el sitio de puncin, aspirar con tcnica asptica
entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual forma que los casos anteriores.
Secrecin uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secrecin en trula estril, colocar en medio
de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera hora de la maana o despus de una hora
de orinar.
Secrecin prosttica:
La tcnica de recoleccin es exprimir la prstata a travs de un masaje prosttico por va rectal e impregnar una
trula estril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.
INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)
(Neumona, TBC)
TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS
Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger la muestra en
receptculos estriles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible mantenerla
refrigerada transitoriamente a 4 C por no ms de dos horas. Es recomendable facilitar la expectoracin con
kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En pacientes intubados realizar la aspiracin endotraqueal con
sonda estril y tcnica asptica, introducirla evitando su contaminacin con grmenes exgenos y aspirar
depositando el contenido en tubo estril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este ltimo
tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el diagnstico etiolgico
en pacientes conectados a ventilacin mecnica.
TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS
Cuando se trata de identificar el agente etiolgico de neumona nosocomial, las muestras que tienen mejor
rendimiento; pero tambin mayores riesgos para el paciente, son aquellas tomadas por broncoscopas (lavado
broncoalveolar, aspirado telescopado protegido), Toracocentesis y Biopsia.
Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a travs de broncoscopa y con tcnica asptica aspirar
entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo estril al laboratorio para su estudio.
Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopa introducir cepillo a travs del catter protegido frotar la
zona alterada y enviar en tubo estril de inmediato al laboratorio para estudio semicuantitativo. *
Toracocentesis: Realizar el procedimiento con tcnica asptica, aspirar 10 ml si es posible. Transportar de
inmediato al laboratorio para su estudio.
Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con tcnica asptica, enviar un trocito de tejido en tubo estril o
en medio de transporte con caldo especfico. Trasladar la muestra de inmediato para su estudio.
*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumona es:
Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal
Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido
Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar
INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)
Secrecin farngea: Deprimir la lengua y frotar con trula estril amgdalas, pilares anteriores y pared
posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible
la muestra se mantiene transitoriamente a temperatura ambiente.
Secrecin nasal: Introducir trula estril ms o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y colocar en medio de
transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra transitoriamente a temperatura ambiente
INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)
(Superficial, profunda abscesos cerrados)
Infeccin superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular subcutneo.
Infeccin profunda: son aquellas que incluyen fascia y msculo, pudiendo comprometer o no cavidades u
rganos.
Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiolgico o Ringer, frotar con trula estril el
centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio para
su siembra y estudio
Toma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiolgico o Ringer, tomar la muestra
con trula de la parte ms profunda de la herida, colocar en medio de transporte y enviarla al laboratorio.
Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antispticos la superficie y los bordes de la herida, aspirar de la
zona profunda de la herida 0,5 ml de secrecin y enviar en la misma jeringa sellada al laboratorio, teniendo la
precaucin de eliminar toda burbuja de aire de su interior.
Si no es posible aspirar material, introducir trula en lo ms profundo de la herida y colocarla en tioglicolato.
De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido (6 mm) con pinza estril y dejarlo caer en el
tioglicolato o en suero fisiolgico e incluso en tubo estril sin ningn preservante.
Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de puncin con antisptico, aspirar material en lo posible 10 ml y
vaciar a tubo estril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios enviar en la misma jeringa sellada,
eliminando todo el aire remanente.
COMENTARIO
Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH cido de este material destruye rpidamente los
microorganismos, siendo difcil su aislamiento posterior a la siembra.
INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS
Secrecin conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estril, frotar con trula humedecida el
borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.
Secrecin tica: Limpiar el canal auditivo con jabn antisptico, tomar la muestra con trula estril y
colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.
Secrecin umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza, colocar en medio de
transporte y enviar al laboratorio.
COMENTARIO.
Las muestras tomadas por puncin ocular u tica deben ser enviadas en la misma jeringa o en caldo de cultivo
tioglicolato.
Figura N 10: Catter venoso central tunelizado. Catter venoso central implantable.
INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)
Coprocultivos
Introducir trula limpia en la zona ms alterada de las deposiciones recin emitidas (mucus o sangre) y
colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse directamente del recto, del
paal o receptculo limpio.
Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de transporte. Las
muestras tomadas por rectoscopa o colonoscopas tienen mayor rendimiento, por cuanto de ser posible es
recomendable obtener las muestras de esta forma.
Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recin emitidas en tubo o frasco limpio y seco.
Aspirado gstrico en RN
Aspirar por sonda nasogstrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estril. Slo se justifica esta muestra
en las primeras 24 horas de vida.
Agrupacin de
algunas cocceas
Gram +
Las especies del gnero Micrococcus son saprfitas, se encuentran habitualmente en la piel de mamferos, en
el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del gnero
Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otra caracterstica que diferencia ambos gneros,
es la propiedad de Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no as los Micrococcus que no tienen
esta propiedad (Tabla 1).
Las principales especies del gnero Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus es patgeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas y enzimas responsables
de su patogenicidad. Algunas enzimas son:
a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasin de los tejidos por las bacterias.
b. Fibrinolisina: Disgrega cogulos de fibrina.
c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana, coagulando el plasma.
d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.
Las toxinas producidas por S. aureus causan los sntomas asociados a las enfermedades estafiloccicas. Estas
toxinas son:
a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glbulos rojos. Es una protena antignica de peso
molecular 30.000.
b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulacin de los leucocitos y macrfagos.
c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el sndrome de piel quemada.
d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.
Aislamiento y Caracterizacin:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es un alimento o una
muestra clnica.
Para muestras clnicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:
a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada de cordero o conejo.
Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus y adems visualizar la produccin de
hemolisinas, por lisis de los glbulos rojos alrededor de las colonias (figura 2).
S. aureus: produce halos de hemlisis completa alrededor de las colonias, producida por la alfa toxina.
S. epidermidis : no produce hemlisis o lo hace dbilmente.
Micrococcus: no produce hemlisis.
b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencial que contiene
manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es
decir, son capaces de crecer en esta concentracin de NaCl. Adems se evidencia la fermentacin de manitol,
la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.
S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la fermentacin)
S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus: no fermenta el manitol.
En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tincin de Gram la
presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y caractersticas en medios selectivos se realiza
las pruebas bioqumicas para confirmar el diagnstico. Si se sospecha que la colonia corresponde a
Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.
La enzima es un activador del fibringeno a fibrina, adems, la pared de Staphylococcus aureus posee receptor
de fibringeno lo que permite la formacin de puentes entre bacteria y bacteria, formndose un cogulo.
Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.
sta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, segn el tipo de enzima:
a) Tcnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo
lquido de Staphylococcus. La reaccin positiva se observa como la aparicin de un cogulo a las 4 horas.
b) Tcnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo de Staphylococcus
en medio slido, se hace una suspensin abundante sobre una gota de agua. Esta suspensin debe ser lo ms
homognea posible. Sobre sta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reaccin
positiva se observa como aglutinacin de las bacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de
aglutinacin, que ser empleado en el laboratorio.
Test comercial de aglutinacin: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus. La
metodologa consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre un crculo de la tarjeta; a continuacin se
emulsiona sobre sta la colonia sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formacin de grumos
visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo includo en el kit (figura 3).
Bacterias
A su vez el Gnero Streptococcus corresponde a cocos Gram positivo, anaerobios facultativos que se disponen
en pares o cadenas y son catalasa negativo reaccin que los diferencia de la Familia Micrococcaceae. Bajo
ciertas condiciones de cultivo las clulas son ovoides o alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y
mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies
son utilizadas en la industria lechera para la elaboracin de quesos, leches fermentadas y yoghurt
(Streptococcus lactis).
Los miembros del gnero Streptococcus se clasifican de acuerdo a:
1.- ACTIVIDAD HEMOLTICA: segn el tipo de hemlisis que presenten al ser cultivadas en placas de agar
sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolticos: producen halos limpios de hemlisis alrededor de las colonias.
b) Alfa hemolticos: producen halos de hemlisis incompleta de color verdoso (S. viridans) alrededor de las
colonias.
c) Gama hemolticos: no producen hemlisis
2.-SEGN CONSTITUCIN ANTIGNICA DE LA PARED CELULAR: clasificacin de Lancefield. Se
basa en la composicin qumica y antignica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite
clasificar a los Streptococcus spp. en grupos serolgicos que van desde la A hasta la U.
Ambas clasificaciones se asocian entre s, as tenemos por ejemplo estreptococos beta hemolticos del grupo
A como Streptococcus pyogenes, que es el ms patgeno del gnero.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patgeno. Es el agente
causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Adems provoca enfermedades
sistmicas como fiebre puerperal y escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este gnero, agente causante de
neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esfrico, tiene forma de cabeza de lanza
(lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cpsula. Es habitante normal de la faringe del
hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S.
pneumoniae presenta alfa hemlisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium). Existen
otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el nombre
de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no hemolticos y pueden
crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH bsico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros
estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminacin fecal.
Aislamiento y Caracterizacin:
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efecta sembrando la muestra sobre una placa de agar sangre.
Streptococcus pyogenes presenta las siguientes caractersticas:
1. Hemlisis en placa de agar sangre. Se observa hemlisis limpia alrededor de las colonias, las cuales son
muy pequeas.
Se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena, ya que otras
especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se
realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los Streptococcus spp. beta hemolticos del grupo A (Streptococcus
pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar a un antibiograma. Otros
Streptococcus spp. tambin son sensibles, sin embargo no son beta hemolticos.
b) Pruebas serolgicas. El diagnstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante reacciones
serolgicas con antisueros especficos para el antgeno superficial.
c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:
Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y pueden hidrolizar la esculina.
Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus de otros cocos Gram (+) catalasa-negativo.
En la prueba positiva, el tubo donde est el medio se torna de color chocolate oscuro, caracterstico al
desdoblar la bilis esculina.
d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del
fenmeno
La mayora de los Streptococcus grupo B producen una protena extracelular difusible (factor CAMP), la que
acta sinrgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas de Staphylococcus aureus causando
la hemlisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangre se inocula los Streptococcus en estudio trazando
estras perpendiculares a una estra central de Staphylococcus aureus. Tras la incubacin se observa la
presencia de una zona hemoltica en forma de punta de flecha en el rea de interseccin, donde el factor CAMP
y la beta-hemolisina han difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los
Streptococcus del grupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.
inhibir el crecimiento del microorganismo, producindose entonces una zona circular de inhibicin (halo de
inhibicin) alrededor del disco. El dimetro del rea de inhibicin puede ser convertido a las categoras de
susceptible, intermedio o resistente de acuerdo a las tablas publicadas por el National Committee for
Clinical Laboratories Standars (NCCLS).
Bacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogneamente. Se coloca un disco de bacitracina, se
incuba 16-24 horas y despus se mide el tamao del halo.
Se considera sensible cuando existe un halo de inhibicin 10 mm de dimetro y resistente cuando el halo de
inhibicin es < 10 mm de dimetro.
Micrococcus es sensible a bacitracina.
Staphylococcus es resistente a bacitracina.
Optoquina: compuesto qumico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana. A bajas
concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otros Streptococcus
hemolticos. El disco de Optoquina se deposita en una placa de agar sangre, sembrada homogneamente con la
colonia sospechosa. Se incuba a 37C por 24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus
pneumoniae.
Novobiocina: antibitico activo por va oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por S. aureus e
infecciones urinarias resistentes a otros frmacos. Es bacteriosttica e interfiere con la sntesis de la pared
bacteriana. Este frmaco se utiliza muy poco debido a que su uso est asociado a una alta incidencia de
reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes. Se considera sensible cuando existe un
halo de inhibicin 16 mm de dimetro y resistente cuando el halo de inhibicin es < 16 mm de dimetro.
Amoxicilina / cido Clavulnico: esta asociacin se indica para el tratamiento a corto plazo de infecciones
bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que estn causadas por cepas resistentes a
Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otras situaciones, debera considerarse la Amoxicilina sola.
Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis recurrente. Estas
infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis y Streptococcus pyogenes.
Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de bronquitis crnicas,
bronconeumonia. stas son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y
Moraxella catarrhalis.
Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis (especialmente cuando
sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto sptico, sepsis plvica o puerperal y sepsis
intraabdominal. Son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente Escherichia coli,
Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)
Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y abscesos dentales
con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y
Bacteroides spp. Algunas cepas de estos grmenes producen beta-lactamasas, de modo que no responden a
Amoxicilina sola.
NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar
(-)
R
Staphylococcus
saprophyticus
Test de Novobiocina
Staphylococcus
Coagulasa negativo
S. Coagulasa negativo
No saprophyticus
Staphylococcus aureus
(+)
Micrococcus
Enterococcus
Bilis positivo
NaCl positivo
Streptococcus
grupo viridans
Optoquina
resistente
Streptococcus
pneumoniae
Optoquina
sensible
Hemlisis
Alfa
Enterococcus
Bilis Esculina
NaCl 6,5 %
Test de Latex
Streptococcus
Grupo A, B, C,
D, F, G
Hemlisis
Gamma
Hemlisis
Beta
Observar Hemlisis
Streptococcus
S
Test de Bacitracina
Test de Coagulasa
Negativo
Bacilo en empalizada
Bacilos finos
Bacilos Grandes
Esporulados
Bordes netos
Catalasa positivo
Catalasa
Positivo
Bacilos
Cocaceas
Corynebacterium sp
Listeria
Bacillus sp
ACTIVIDADES PRCTICAS
Objetivos
1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra
2. Conocer y practicar el procesamiento microbiolgico de cocceas Gram positivo aisladas a partir de
muestras clnicas as como de flora normal
3. Realizar pruebas bioqumicas para la identificacin de cocceas Gram positivo
4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clnicas.
5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.
Observaciones
Para S. aureus
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus -hemolticos y Enterococcus (MuellerHinton con sangre de cordero)
DROGA
CONTENIDO
SENSIBLE
INTERMEDIA
RESISTENTE
DEL DISCO
(Halo en mm)
(Halo en mm)
(Halo en mm)
Penicilina
10 unidades
20-27
28
19
Eritromicina
16-20
15 g
21
15
Clindamicina
16-18
2g
19
15
Vancomicina
30g
17
Optoquina
5 g
14
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton con sangre de
cordero)
DROGA
CONTENIDO
SENSIBLE
INTERMEDIA
RESISTENTE
DEL DISCO
(Halo en mm)
(Halo en mm)
(Halo en mm)
Penicilina
1 g de oxacilina
20
Eritromicina
16-20
15 g
21
15
Trimet/sulfame
16-18
1.25/25.75g
19
15
Vancomicina
30g
17
Optoquina
5 g
14
TRABAJO PRCTICO N4
FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO
Triptona.
Urea.
Indicador de pH fenolftaleina.
Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de degradar urea a
amonaco y CO2. Esta reaccin es fcilmente evidenciable, porque el pH vara hacia alcalino debido al efecto
del amonaco. Este cambio se observa por viraje del indicador de pH como Fenolftalena (Figura 1)
3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, adems de sales minerales:
Fosfato de amonio.
En este medio slo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato Permeasa, la que les
permite transportar el citrato a travs de la membrana citoplasmtica.
Una vez en el interior de la clula, el in citrato es metabolizado a travs del ciclo de los cidos tricarboxlicos
(Figura N 15)
Glucosa al 0,1%
Lactosa al 1,0%
Sacarosa al 1,0%
Citrato de amonio.
Hierro.
a. Si la bacteria inoculada es fermentadora slo de glucosa usar sta y se obtiene slo una pequea cantidad
de cido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubacin es suficiente para convertir ambas porciones
(tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las prximas horas, sin embargo, la glucosa sobrante es
completamente agotada y la bacteria comienza la degradacin oxidativa de los aminocidos en el tendido del
tubo, donde hay oxgeno, lo que lleva a la liberacin de aminas que neutralizan las pequeas cantidades de
cido presente en el tendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En la
porcin profunda (anaerbica) del tubo, la degradacin de aminocidos es insuficiente para neutralizar el cido
formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un organismo fermentador de glucosa y
lactosa o sacarosa, an cuando la glucosa se agota en las primeras 8 a 12 horas, la fermentacin contina ya
que el organismo es capaz de usar lactosa o sacarosa. As, a las 18 a 24 horas, ambas porciones estn amarillas.
b. Si se produce gas se observar como quiebres en el agar o separacin de la columna de agar del fondo del
tubo.
c. Para la deteccin de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfato de sodio es la
fuente de tomos azufre en la mayora de los medios usados para la produccin de H2S. Sales de fierro (Sulfato
ferroso y citrato frrico amoniacal) incorporadas en el medio de cultivo reaccionan con sulfuro de hidrgeno
para producir un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato
ferroso, un compuesto insoluble de color negro. (Figura 16)
Aminocido lisina
Aminocidos azufrados
Glucosa
a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo cido por lo que el pH baja y el indicador vira a amarillo.
Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendr esta coloracin amarilla (reaccin K/A,
negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la
lisina dando como producto CO2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado
alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado (reaccin K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de
desaminar a la lisina, la superficie se ver roja y el fondo amarillo (reaccin R/A).
b. Si la bacteria produce H2S ste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso (negro). (Figura 17)
Figura N 18: Resultados medio MIO (Los pares estn organizados sin y con reactivos de Kovacs)
1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia)
2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo)
3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).
2. Sistemas comerciales usados en la identificacin de Enterobacterias
2.1- API 10S: Sistema de identificacin estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativo,
como algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11 pruebas bioqumicas que usan
sustratos deshidratados.
2.2- SensIdent: Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos Gram negativo
fermentadores y no fermentadores de glucosa. La identificacin se hace mediante pruebas bioqumicas las que
vienen liofilizadas en placas de microtitulacin y se rehidratan con la suspensin bacteriana.
2.3 VITEK: Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificacin de los bacilos Gram negativo
fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a travs de pruebas bioqumicas que vienen incluidas en
tarjetas de identificacin. Los tiempos de incubacin varan entre 2 y 15 horas. El sistema vitek determina si
cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidez mediante un lector ptico. Cuando finaliza el periodo
de incubacin, las reacciones son analizadas automticamente y la identificacin es impresa.
3. Oxidasa
Busca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente la colonia sospechosa en
el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reaccin es positiva cuando aparece un color
prpura despus de 1 min.
Esta prueba es positiva para Neisseria spp. y para bacilos Gram negativo no fermentadores, y es negativa para
Enterobacterias.
4. Susceptibilidad a Antibiticos
Los antibiticos son agentes teraputicos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los
agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad estn indicados para apoyar la terapia antimicrobiana de
tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente
para predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa
que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos
ms comnmente usados.
Los mtodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son mtodos que determinan in vitro la
sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones especficas y
estandarizadas.
ACTIVIDADES PRCTICAS
Objetivos
1. Realizar pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de bacterias Gram negativo.
2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios o
finales, debido a la accin bacteriana.
3. Realizar test comercial API 10S, para la identificacin de bacterias Gram negativo.
4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusin en agar.
5. Identificar el agente etiolgico (Gnero y especie) presente en una muestra clnica.
e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servir para hacer una comparacin
con el resultado final.
f. Para cada tubo de la batera el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredes del tubo antes
de sumergirla en el caldo inoculado.
Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que:
1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en superficie, es decir,
atravesndolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran slo en la superficie, es decir, se
realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inculo dentro del tubo con el medio.
4. Los medios semislidos (agar MIO) se siembran slo en profundidad con un asa en punta, pinchando el agar
hasta la mitad del tubo aproximadamente.
3b. Siembra y Lectura de API 10 S
1. Prepare una suspensin bacteriana en 5 ml de suero fisiolgico, hasta una medida de densidad igual a 0.5
Mac Farland (estndar)
2. Con una pipeta Pasteur estril, inocule cada una de las celdas de la galera hasta el menisco, tal y como se
muestra en la figura adjunta (lnea azul). Evite la formacin de burbujas en los micropocillos, pues interfiere
con sus resultados.
3. Llene la prueba CIT hasta la cpula
4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S, despus de inocular, llene las cpulas con aceite mineral, para crea
un ambiente microaeroflico.
5. Coloque la galera en la cmara de incubacin, a la que debe colocarle previamente agua para crear un
ambiente hmedo. Que NO quede un exceso
6. Cierre la cmara e incube 18 a 28 horas a 37C.
A
AG
AG
A
AG
AG
AG
AG
V
AV
AV
AG
-
Shigella dispar
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi A
Salmonella paratyphi B
Salmonella gallinarum
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter aerogenes
Enterobacter hafniae
Serratia marcescens
Serratia rubidae
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Pseudomonas
aeruginosa*
AG
V
(+)
+/-/+
Alcaligenes faecalis*
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
+/-
Shigella flexneri
AG
Escherichia coli
-/+
(+)
+/-
+/-
H 2S
+/-
+/-
Motilidad
Indol
-/+
+/-
V-P
-/+
-/+
-/+
R-M
Pigmento Urea
Citrobacter freundii
Salmonella Arizonaa
Escherichia coli
Positivo
Enterobacter spp.
Klebsiella spp.
Negativo
Negativo
Positivo
Indol
Indol Negativo
Lisina Descarboxilasa
Negativo
Positivo
Produccin de H2S
TABLA I
Proteus vulgaris
Proteus morganii
Negativo
Proteus mirabilis
Negativo
Proteus rettgeri
Providencia spp.
Positivo
Indol Positivo
Indol
Positivo
Citrato
Negativo
Positiva
Produccin de H2S
TABLA II
Salmonella Typhi
Salmonella Arizona
Salmonella Paratyphi B
Positivo
Citrobactera
Serratia
Indol Negativo
Citrato Positivo
Positivo
Positivo
Shigella spp.
Yersinia enterocolitica
Negativo
Salmonella Paratyphi A
Shigella spp.
Indol
Citrato Negativo
Negativo
a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo
Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de
Glucosa
Edwarsiella
Citrato
Citrato
Negativo
Negativo
Negativo
Citrato Positivo
Indol
Positivo
Negativo
Lisina Descarboxilasa
Lisina Descarboxilasa
Positivo
Negativa
Positiva
Produccin de H2S
TABLA III
Interpretacin API 10
Antes de realizar la interpretacin del tes comercial API 10, debe agregar los siguientes reactivos en sus
correspondientes posillos:
TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloracin marrn oscura indica
positivo.
IND (Produccin de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloracin rosa indica positivo.
NO2 (Produccin de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU. Espere 2
a 3 minutos. Una coloracin roja indica positivo.
Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numrico. Sume los nmeros de cada
grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dgitos que corresponden al perfil numrico.
Busque el perfil numrico en el catlogo que tendr su profesor o en un software.
REACCIONES
POSITIVO
NEGATIVO
ONPG
Beta galactosidasa
Amarillo
Incoloro
GLU
Fermentacin /oxidacin
Amarillo,amarillo/ gris
Azul, azul/verdoso
Amarillo
Azul, azul/verdoso
Naranja
Amarillo
Rojo/naranja
Amarillo
glucosa
ARA
Fermentacin/oxidacin
arabinosa
LDC
Enzima lisina
descarboxilasa
ODC
Enzima ornitina
descarboxilasa
CIT
Azul/verde, azul
verde plido/amarillo
H2S
Produccin de H2S
Depsito/lnea negra
Incoloro/gris
URE
Enzima ureasa
Rojo/naranja
Amarillo
NOTA: Los diversos tamaos de los halos de inhibicin producidos por antibiticos diferentes para una
misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de
inhibicin de 30mm para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20 mm para
Tetraciclina.
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Enterobacteriaceae (Mueller-Hinton):
DROGA
Ampicilina
Gentamicina
Cloranfenicol
Ciprofloxacino
Cefotaxima
Tetraciclina
Ceftazidima
Amoxicilina /
c. Clavulanico
Carbenicillin para
Especies de Proteus
E. coli
Carbenicillin para
P. aeruginosa
Ceftazidima para
P. aeruginosa
Clindamicina
Ciprofloxacino
CONTENIDO
DEL DISCO
10 g
10 g
20 g
5 g
30 g
30 g
30 g
SENSIBLE
(Halo en mm)
17
15
18
21
26
15
21
INTERMEDIA
(Halo en mm)
14 16
13 14
13 17
16 20
23 25
12 14
18 20
RESISTENTE
(Halo en mm)
13
12
12
15
22
11
17
20 / 10 g
18
14 17
13
100 g
23
18 22
17
100 g
17
14 16
13
30 g
18
15 17
14
2 g
5 g
21
21
15 20
16 20
14
15
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Bacilos Gram (-) no fermentadores (Mueller-Hinton):
DROGA
CONTENIDO DEL
DISCO
mm)
mm)
(Halo en mm)
Ceftazidima
30g
18
15-17
14
Gentamicina
10g
15
13-14
12
Ciprofloxacino
5g
21
16-20
15
TRABAJO PRCTICO N5
LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS
OBJETIVOS
1.- Conocer y caracterizar la morfologa macroscpica de las colonias de hongos unicelulares (levaduras) y
pluricelulares (filamentosos).
2.- Conocer la morfologa microscpica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares (filamentosos).
MARCO TERICO
El ser humano est constantemente expuesto a la propagacin de organismos eucariontes como son los
hongos.
La mayora tolera esta exposicin sin secuelas, pero algunos desarrollan una hipersensibilidad
alrgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a la colonizacin de hongos y porque la
virulencia inherente en estos microorganismo es muy baja.
Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infeccin puede desencadenar enfermedades que, si
no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se
aprovechan de la debilidad del hospedero se les denomina hongos oportunistas. Hongos como Candida
(Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus arrhizus) son
ejemplos de ellos.
Unicelular
Pluricelular
Micelio
Levaduras
Sifonado
Colonias semejantes a las
bacterianas
Septado
Colonias algodonosas,
lanosas, aterciopeladas
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en Agar Sabouraud, cuyo contenido en
glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es cido (pH 5,6) para impedir la contaminacin
bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30C por un tiempo que depende de la especie fngica (levaduras y
hongos ambientales, 48 horas aproximadamente, hongos dermatofitos, 15-30 das).
flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la cavidad oral, vagina,
tracto gastrointestinal y rea rectal. Sin embargo, cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos
pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo, riones, hgado, corazn y cerebro. Este gnero se
caracteriza por un aspecto macroscpico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura
N 19).
Figura N 19: Observacin microscpica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiesto las
levaduras en yemacin y las pseudohifas de las especies de Candida.
Hongos Filamentosos:
Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados.
multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son prolongaciones de la
membrana citoplasmtica (ej. Aspergillus, Dermatophytos).
1) Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como patgenos
oportunistas (ej. Aspergillus) y como patgenos (ej. Dermatophytos).
Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a ste gnero son extremedamente frecuentes
en el medio ambiente y de crecimiento rpido (48 hr). En contraste con la mayora de las infecciones
producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exgenas.
Estos microorganismos se
de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollndose en 3-4 das. En 1929, Sir
Alexander Fleming observ que una especie de Penicillium haba contaminado su cultivo de Staphylococcus
aureus, destruyendo las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo.
observacin casual llev al descubrimiento de la penicilina.
Esta
Los hongos que petenecen a este gnero se caracterizan por la produccin de conodiforos en el
extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en superficies, como una placa de agar,
germinan y crecen rpidamente produciendo colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.
P. marnefeii es la nica especie patgena de Penicillium y es causa de infecciones espontneas del
sistema retculoendotelial, afectando vasos linfticos, pulmn, hgado, bazo y hueso. Ver figura N 21.
Esta infeccin se origina en los senos paranasales y puede afectar rbita y el paladar,
Figura N 22:
Aspecto microscpico de hongos sifonados.
Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifngico, se recomienda suspender el tratamiento, por lo menos
2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orienta principalmente a pacientes portadores de micosis
superficiales o cutneas y las consideradas no graves.
III.- Procedimiento General del Diagnstico de Laboratorio
En general, el examen microscpico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados para todas las muestras
clnicas que se reciben. Estos exmenes forman parte del mtodo directo de identificacin de hongos y se
recomienda en todas las micosis. La microscopa proporciona informacin vital y frecuentemente una
inmediata corroboracin del diagnstico presuntivo al observar el agente fngico en el material clnico. Los
hongos filamentosos se presentan en parasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco septadas) o
septadas, hialinas o dematiancias (oscuras) segn el tipo de hongo. Algunas levaduras presentan caractersticas
microscpicas particulares en parasitismo, lo cual orienta su identificacin.
a)
El EMD puede ser realizado en frotis, fijndose la muestra al portaobjetos y usando la tincin de
Gram o Giemsa, para poder observar con el objetivo de inmersin (100X). Lo ms frecuente, es la
preparacin al fresco con soluciones clarificadoras con o sin colorantes como KOH 10 o 20%.
Adems, se emplea la tinta de China para observar la presencia de cpsula en levaduras del gnero
Cryptococcus, observndose con objetivos de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido, adems
puede solicitarse examen histopatolgico donde se ver adems la reaccin tisular.
b)
El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo los medios
de cultivo segn la sospecha clnica. Las micosis causadas por hongos filamentosos se incuban
generalmente a 25C y el tiempo de incubacin depender de la sospecha clnica. As, en las
dermatofitosis o tias los medios se incuban hasta por 30 das, debido a que estos hongos demoran
aproximadamente 20 das en crecer y presentar sus estructuras micromorfolgicas caractersticas que
permitirn su diagnstico a nivel de especie. Sin embargo, los hongos filamentosos oportunistas como
Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen ms
rpido, obtenindose colonias entre los 5 a 10 das de incubacin. Las levaduras crecen mejor a 37C
y sus colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.
c) Pruebas Bioqumicas
El estudio bioqumico de levaduras comprende principalmente el anlisis de asimilacin de hidratos de
carbono conocido como Auxanograma, sometindose a la cepa en estudio a diferentes azcares dependiendo
del gnero de levadura que se sospeche. Este examen se complementa con asimilacin de fuentes de nitrgeno,
fermentacin de azcares denominado Zimograma e hidrlisis de urea. El auxanograma y la asimilacin de
nitratos son incubados a 25C hasta por 3 das. Entretanto, el zimograma e hidrlisis de urea se incuba a 37C.
El perfil bioqumico obtenido ser comparado con los datos en las tablas de identificacin respectivas, segn el
gnero de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especies que presentan el patrn bioqumico
determinado.
d) Sistemas Comerciales de Identificacin de Levaduras
En virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultados bioqumicos realizados
por el mtodo estndar, la industria ha desarrollado progresivamente nuevos sistemas para facilitar y disminuir
el tiempo de identificacin de las especies de levaduras de inters clnico. La mayora de los sistemas
disponibles en el mercado son galeras que contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los
pocillos que, al ser inoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fcil interpretacin, las
cuales, en su mayora generan un cdigo numrico de varios dgitos que son interpretados por registros propios
de cada empresa. El primer inconveniente observado por los laboratorios es la necesidad de contar con
disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que algunos de estos sistemas se incuban a 30C por 24 y 48hr.
Sistema comercial
Productor
- Api Candida
BioMrieux
- ID 20C e ID 32C
BioMrieux
- Fungichrom I
International Microbio
En resumen, a partir del diagnstico clnico los pasos importantes que favorecen el aislamiento e identificacin
del hongo son:
- Apropiada recoleccin del material clnico y rpido transporte al laboratorio
- Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra
- Adecuada eleccin de la o las soluciones en el examen microscpico directo
- Correcta seleccin del o los medios de cultivos
- ptimo procedimiento de inoculacin e incubacin
- Adecuada realizacin, lectura, anlisis e interpretacin de las tcnicas de identificacin
ACTIVIDADES PRCTICAS
1.- Observacin y descripcin de cultivos de levadura.
1.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscpico: Describa, tal como lo haca para colonias bacterianas, forma, color, aspecto
de la superficie, borde, elevacin y brillo de las colonias. Anote lo que observe.
b) Examen microscpico: Realice una tincin Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la colonia
de levaduras en una gota de agua y contine con el protocolo por usted. conocido. Observe con
inmersin y dibuje lo que observa.
Nota: La tincin Gram es slo una tcnica de tincin. Las levaduras no son Gram + ni Gram -. Recuerde
que la caracterstica de ser Gram+ o Gram- est relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas
bacterianas.
c)
(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano y se cultiva a
37C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas para observar filamentacin. Recuerde
que slo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras que varias especies de Candida
presentan filamentacin a las 24 horas.
d) Tincin de cpsula:
1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china.
2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparacin con otro portaobjeto.
3. Seque suavemente en la llama del mechero
4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos.
5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersin en 100X
PSEUDOHIFAS O HIFAS
CON BLASTOCONIDIAS
Candida sp.
PSEUDOHIFAS O HIFAS
BLASTOCONIDIAS Y
CLAMIDOCONIDIAS
Candida albicans
ASIMILACIN/ FERMETACIN
DE AZCARES
(API 32 U OTRO))
FILAMENTACIN (+)
Candida albicans
TUBO GERMINATIVO
LEVADURAS
CULTIVO
POSITIVO
API32, probable
Rhodotorula o
Torulopsis
CPSULA (-)
CPSULA (+)
Cryptococcus sp.
FILAMENTACIN (-)
TRABAJO PRCTICO N6
PARSITOS
1.- Reconocer formas infectantes y parsitos adultos de inters clnico.
2.- Observar las caractersticas ms importantes de estos parsitos.
MARCO TERICO
Se define como parsito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de su existencia, a
expensas de otro ser vivo (hospedero), del cual vive causndole o no dao, que puede ser aparente o
inaparente, y con quien tiene una dependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:
1. Parasitismo obligatorio: los parsitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este estado puede ser
permanente, permanente estacionario, peridico o temporario.
2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen vida parasitaria.
3. Parasitismo accidental: no son parsitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo.
4. Parasitismo extraviado: parsitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse en el hombre.
5. Parasitismo errtico: cuando la localizacin del parsito, en el husped, no es en el rgano o tejido
habituales.
Ciclos de vida del parsito:
1. Ciclos directos (monoxnicos): son aqullos en los que no hay la presencia de un hospedero intermediario.
Pueden ser cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos, donde la forma emitida necesita un
determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo) para transformarse en infectante. En general, los
parsitos con ciclos directos cortos son cosmopolitas y los directos largos estn condicionados por las
situaciones climticas.
2. Ciclos indirectos (heteroxnicos): son los que necesitan un hospedero intermediario para completar su ciclo.
La presencia de estas parasitosis en un rea determinada depende de la existencia de dicho hospedero
intermediario.
Caractersticas ms importantes de los parsitos:
Resistencia al medio exterior: para enfrentar los factores climticos y algunos agentes qumicos, los huevos,
quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacen resistentes.
Patogenicidad: est relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parsitos son patgenos por s
mismos, y otros lo son dependiendo de las caractersticas del hospedero; sto hace que un mismo parsito
pueda o no producir enfermedad. Por esta razn existen el portador sano y los parsitos oportunistas, que se
manifiestan en pacientes inmunocomprometidos.
Autoinfeccin: es la forma para que el parsito permanezca por ms tiempo en el hospedero. Puede ser
autoexoinfeccin, en la que est en el exterior un tiempo muy corto (por ejemplo oxiuriasis); o
autoendoinfeccin, en la que se multiplica dentro del husped, y la recontaminacin se hace en el interior del
mismo (por ejemplo teniasis).
Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parsito al hospedero y la demostracin de la
presencia de ste, o de sus formas de desarrollo, ya sea por la observacin directa, estudios bioqumicos,
cultivos, etc.
Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parsito sean viables a travs de
estructuras resistentes, tanto al medio como a los huspedes intermediarios. Se asegura de esta forma la
continuidad del ciclo y su permanencia.
Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parsitos permanecen en el organismo del
husped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir la respuesta inmunolgica.
Longevidad: la longevidad de un parsito admite dos formas: longevidad verdadera, cuando permanecen
muchos aos en un organismo (por ejemplo Trypanosoma cruzi, agente etiolgico de la enfermedad de
Chagas); o perpetundose -por medio de la autoinfeccin- aunque el parsito tenga vida muy corta.
Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias que le sirve al parsito para
perpetuarse. Es til conocerla, ya que a travs de ello (por ejemplo, en los helmintos, postura diaria de huevos),
es posible hacer el clculo aproximado del nmero de parsitos que infectan al husped.
Prevencin de las parasitosis
La Organizacin Mundial de la Salud estableci que, dado que las parasitosis son patologas con alto
componente social, podran ser controladas pero difcilmente eliminadas. Las medidas de prevencin estn
vinculadas a la modificacin de los hbitos, la educacin y el bienestar de la poblacin. Incluyen:
1.
Disminuir el fecalismo a travs de medidas de saneamiento bsico, como facilitar el acceso al agua
potable, la correcta eliminacin de heces, etc.
2.
No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas para riego.
3.
4.
Controlar los vectores mecnicos (moscas, cucarachas) y los vectores biolgicos (vinchuca, mosquitos
etc.).
5.
6.
7.
8.
Modificar hbitos de convivencia del hombre con los animales para evitar el contacto con las heces de
los mismos.
9.
Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que sta protege contra determinadas
parasitosis, principalmente las que originan diarreas.
11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma, especialmente
cuando la ingieran lactantes y nios.
12. No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo hmedos.
13. Utilizacin de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra.
14. Antes de utilizar abono o turba de ro comercial rociar el material con agua recin hervida.
15. Tratar de evitar que los nios jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera factible,
establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociar peridicamente, si es posible en forma
diaria, o en los perodos de clima clido y despus de las lluvias, con agua recin hervida.
16. Colocar los juguetes de los nios al sol las veces que se pueda, ya que la mayora de las formas
parasitarias no resisten a la desecacin y temperaturas superiores a 50C.
LABORATORIO DE PARASITOLOGIA
OBTENCIN DE LA MUESTRA
CONDICIONES GENERALES
Los parsitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, tambin llamados gusanos
intestinales. Estos helmintos pueden ser cilndricos (nemtodos), anillados o segmentados (cstodos).
Para observar los trofozotos, quistes u ooquistes de los protozoarios as como las larvas y huevos de
helmintos se debe usar un microscopio. La mayor parte de los helmintos adultos son macroscpicos y
su morfologa puede estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa.
Las formas evolutivas de los protozoos intestinales se eliminan por las heces (trofozoto, quiste,
ooquiste y espora), segn la especie involucrada.
Los helmintos intestinales adultos (progltidas de Taenia sp., Enterobius vermicularis y Ascaris
lumbricoides) pueden salir al exterior espontneamente o despus del tratamiento.
Los mtodos de diagnstico de los parsitos intestinales pueden ser: directo o por concentracin de los
elementos parasitarios que se eliminan en las heces.
En las heces podemos encontrar formas adultas y microscpicas (huevos, larvas, trofozoitos, quistes,
ooquistes y esporas) de los parsitos intestinales; por ello, es importante obtener una buena muestra
fecal, as como la conservacin ptima del espcimen.
La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo ms fresca posible (mximo 90 minutos, si se
busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha con tapa rosca y rotulada
correctamente con los datos de identificacin.
La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5 das despus
de su administracin.
Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnstico, debido a que pueden
contaminarse con formas biolgicas, como por ejemplo: larvas similares a los enteroparsitos del
hombre, larvas de nemtodos, huevos de caros o insectos, etc.
Figura N 24. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y progltido grvido de Taenia solium (4X) (izq.),
coloracin: Tionina
EXAMEN DIRECTO MICROSCPICO
Fundamento.
Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao
microscpico (trofozotos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli,
etc.; as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator
americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus, Fasciola, etc.).
Ejemplos
ACTIVIDADES PRCTICAS
Las actividades del laboratorio de parasitologa consistirn en la observacin de elementos
parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observacin de diapotecas segn
disponibilidad de cada laboratorio.