PCR en tiempo real 1

PCR en tiempo real

PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del inglés quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (del
inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y
simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).
Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores
específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le
adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir
fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o
más productos específicos.[1] Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que
también se le denomina PCR en tiempo real. En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no
es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por
retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa, RT-PCR en
tiempo real o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada «PCR tras transcripción inversa»
(RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero
que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.
La PCR cuantitativa es la metodología más moderna para el estudio de la expresión génica, junto a los chip de ADN,
si bien otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien, no con tanta precisión, también permiten su
abordaje.[2] La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a un error en la estima deriva de la
integridad de ADN, eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos
sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más
común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado «normalizador», que
se selecciona debido a su expresión casi constante; estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes
debido a que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una
expresión constitutiva.[3] [4] De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y
dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aun sin conocer
en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican
para las siguientes proteínas: tubulina , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, RNA
ribosomales, etc.[2]

Fundamento
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz
de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este
termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se
aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces,
llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 °C, permite la
separación de los ácidos nucleicos de doble cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite
el alineamiento de los cebadores al ADN molde;[5] el tercero, a 68 - 72 °C, facilita la polimerización por parte de la
ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede
omitirse el último paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento
y la de desnaturalización. Además, algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura,
por ejemplo 80 °C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante
inespecífico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros,
como: la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos
(dNTPs) en la reacción y la temperatura de unión de los cebadores.[6]
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Clasificación
Podemos clasificar las técnicas de PCR cuantitativa según el empleo de fluorocromos no específicos o bien de
sondas moleculares dependientes de la secuencia.
• En las técnicas basadas en fluorocromos inespecíficos se detecta la generación exponencial de ADN de doble
cadena empleando un fluorocromo que se une inespecíficamente a aquél. Un ejemplo de colorante que permite
esta detección es el SYBR Green), que, excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522
nm).[7] Posee la ventaja de requerir sólo un par de cebadores para efectuar la amplificación, lo que abarata su
coste; sin embargo, sólo es posible amplificar un producto en cada reacción.
• Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan al menos un oligonucleótido marcado fluorescentemente.
Típicamente esta sonda está unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicón. De este modo, cuando la sonda está intacta, presentan
una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando los dos
fluorocromos están distantes debido a la degradación de la sonda mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de la
ADN polimerasa, o bien debido a la separación física de los fluorocromos por un cambio en la conformación de la
sonda. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

Análisis de temperatura de fusión

La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unión inespecífica a
la doble hebra de ADN, generalmente SYBR Green, identificar
fragmentos amplificados de DNA concretos a partir de la temperatura
de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting
temperature), que es específica para el fragmento amplificado que se
está buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la
observación de la curva de disociación de las muestras de DNA
analizadas.[9]

Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir del

posterior empleo de técnicas de electroforesis para la visualización de
los resultados de todas las muestras. Porque, pese a que la PCR
cuantitativa es una técnica cinética, suele ser evaluada a punto final.
Así esta técnica lleva a la obtención de resultados más rápidos, y/o en
Distintas curvas de fusión de varias productos de
el menos gasto de reactivos empleados en las técnicas de PCR (en colores distintos). Se observan
electroforesis; si según el criterio del investigador, posteriormente es reacciones con amplificación de un producto
necesario correr en geles solo las muestras cuyo resultados previos en específico (rosa, azul) y otras con resultado
negativo (verde, naranja); se señala con una
el PCR en tiempo real se pueden considerar dudosos y/o para ratificar
flecha el pico de fusión dado para los dímeros de
resultados en muestras positivas. los cebadores, diferente al esperado para el
[8]
producto de amplificación en cuestión.

Cuantificación de la expresión génica

La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la
señal de amplificación obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado; para este enfoque es
vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de
amplificación. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm)
interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por retrotranscripción del ARNm); esta cuantificación
relativa es más fácil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparación entre el
nivel de expresión del gen a estudiar versus un gen control (también llamado de referencia, interno o normalizador o,
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en inglés, housekeeping gene.

Por tanto, en la cuantificación relativa es irrelevante en qué unidades se expresa la cuantificación, y sus resultados
son comparables entre múltiples experimentos de RT-Q-PCR. De hecho, el propósito de emplear uno o más genes de
normalización es corregir la variación no específica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN
empleado, que pueden afectar a las eficiencias de retrotranscripción y de PCR. No obstante, el aspecto crucial es que
la estabilidad del gen de referencia sea una realidad.[10]
La selección de los genes internos se ha realizado clásicamente en Biología Molecular analizando la estabilidad de la
expresión en estudios cualitativos o de baja sensibilidad, como el examen visual de geles de ARN, densitometría de
Northern blots o PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era de la genómica, es posible realizar una
aproximación a gran escala empleando los chips de ADN para muchos organismos.[11] No obstante, se ha descrito
que la mayoría de los genes empleados como normalizadores en la cuantificación de la expresión de ARN mensajero
varían según las condiciones experimentales.[12] [13] [14] Por ello, es preciso realizar un estudio metodológico previo
a emplear a fin de seleccionar, con ayuda de herramientas estadísticas, los más apropiados.
Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que detectan qué gen o genes son los más apropiados para la
normalización de un conjunto de tejidos bajo unas condiciones dadas: algunos, como geNORM o BestKeeper,
realizan, sobre una matriz de expresión de genes de referencia para diversos tejidos, comparaciones por pares y
medias geométricas.[15] [16]

Modelización
A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de
producto obtenido en cualquier momento de la amplificación mediante la señal de fluorescencia (en realidad,
mediante su nivel sobre un umbral). Los valores de fluorescencia, expresados como logaritmos a fin de estudiar
fácilmente la fase exponencial de amplificación, que aparece como una línea recta al representar gráficamente el
logaritmo de la fluorescencia frente al número de ciclo; este segmento, denominado segmento cuantificable, permite
valorar la cantidad de ADN inicial.

Gráfica de la izquierda (A)

Las cinéticas de tres PCR de tres muestras distintas (K, L y M) de concentraciones de ADN inicial decrecientes
(concretamente, se reducen a la décima parte cada vez) se representan en un gráfico del logaritmo de la fluorescencia
(en ordenadas) frente al ciclo de PCR (en abscisas). No se representan las fases previas a la exponencial.
1. Zona de segmentos cuantificables de cada muestra. En gris la zona de saturación, fuera ya de la zona lineal.
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2. Cada uno de los segmentos cuantificables permite definir una ecuación de la recta de tipo U=ax+b, que permite
modelizar la eficiencia de la amplificación (la pendiente a) y, mediante la ordenada en el origen b, la cantidad de
ADN en el ciclo 0, al menos teóricamente.
3. Si bien, puesto que las medidas experimentales conllevan un error, dicha cuantificación arrastra un error
estocástico. Si las muestras de concentraciones K, L y M fueran amplificadas durante más ciclos, se obtendrían
cinéticas diferentes, si bien bastante próximas (ser representan sus segmentos cuantificables en rojo, rosa y
naranja). Cada una de estas medidas permite establecer una nueva ecuación, representada en puntos del mismo
color. Las ordenadas en el origen (b) diferentes son también medidas. Así, podemos evaluar el error o
incertidumbre de la técnica evaluando las diferencias entre las pendientes b (EK, EL, EM).
4. No obstante, dicha imprecisión en la medida varía para cada muestra (EK es inferior a EL, que es, a su vez, más
pequeña que EM). Una proyección de la ecuación de la derecha sobre el eje de ordenadas o una de sus paralelas
dará lugar a un «error dependiente de la concentración de ADN inicial».
Gráfica de la derecha (B)
1. Las ecuaciones obtenidas según los segmentos cuantificables pueden extrapolarse hacia el eje de abscisas, aunque
se trate de un valor carente de significado bioquímico sino simplemente matemático.
2. Los ángulos que modelizan el error experimental (líneas de puntos rojos, naranjas o rosas) permiten definir las
nuevas incertidumbres EK, EL y EM. Estas incertidumbres son mayores que en la gráfica de la izquierda (gráfica
A), si bien se mantiene su proporcionalidad. Por tanto, sobre la medida ahora generamos un «error independiente
de la concentración de ADN inicial».
3. Es posible proyectar rectas paralelas entre sí, sobre la recta definida sobre una paralela al eje de abscisas de modo
que se corten los segmentos cuantificables por la mitad. Este segmento es denominado «umbral de detección».
4. Los valores en X (número de ciclos) de estas intersecciones son denominados «CT» (o «Ct», del inglés cycle
threshold, cuya traducción es ciclo umbral), aunque también pueden llamarse «CP» (del inglés crossing point, o
punto de cruce). Se trata, pues, de los valores matemáticos definidos sobre el espacio de reales positivos y no de
los enteros positivos (aunque una fracción del ciclo no posea realidad experimental). Estos valores, inversamente
proporcionales a la cantidad de ADN inicial, suelen poseer una incertidumbre sobre la medida mínima, en general
inferior al 5%.

Rectas de calibrado
Como se indicaba en el apartado de cuantificación, emplear el CT, como valor matemático, permite obtener
resultados fiables, pero este hecho puede no ser explotado directamente. A fin de conocer la cantidad de ADN
inicial, es preciso pues realizar nuevas transformaciones matemáticas que requieren conocer la eficiencia de PCR,
que suele determinarse gracias a una recta de calibrado.
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Gráfica de la izquierda (A)

Las nuevas muestras F, G, H, I, J, K, L, M y N, de concentración de ADN inicial decreciente (un orden de magnitud
cada vez) son amplificadas mediante PCR en un mismo experimento. Cada cinética permite determinar un CT para
cada uno (es decir, un número en referencia a un ciclo en concreto). Se representan las concentraciones de ADN
como número de moléculas por tubo (en este caso, F posee 70 millones y N, 0,7).
Los rendimientos representados corresponden a «n» reacciones, cuya fiabilidad se debe a la existencia de réplicas
independientes en la reacción, personal y reactivos. La fluorescencia se muestra en unidades arbitrarias y el ruido de
fondo ha sido limpiado. Cabe destacar que la muestra Nn no ha amplificado en absoluto.
Gráfica de la derecha (B)
Los valores CT medios en función de la cantidad de ADN inicial de todas las réplicas pueden representarse en un
gráfico semilogarítmico. De este modo, la recta de calibrado para estos valores medios puede definirse gracias a una
regresión lineal con un determinado coeficiente de correlación (r2) que, para ser considerado de calidad, debe poseer
un valor de 0,9999. No obstante, han de representarse los errores, generalmente definidos según el rango de valores
obtenidos para un punto.
Con estos datos, es posible estudiar:
1. La fase «cuantitativa y detectable de la PCR». En la cual todas las muestras son detectables y se alinean en todos
sus puntos con su recta particular. Generalmente, esta fase comprende las concentraciones de ADN iniciales en
torno a 102 o 108 copias del ácido nucleico. Por debajo de estas cifras los fenómenos estocásticos alteran
perceptiblemente los resultados, si bien es posible compensarlos con un alto número de réplicas en las medidas.
Por encima de estos valores, el «ruido de fondo» es suficientemente bajo como para no poder ser determinado; en
este caso, es posible compensar esta deficiencia mediante un protocolo de PCR con una eficiencia muy alta o, de
forma más simple, diluyendo la muestra inicial.
2. La fase «a veces detectable pero no cuantitativa de la PCR». Que comprende las concentraciones de ADN inicial
entre una copia y la decena de copias. El porcentaje de muestras medidas, en el ejemplo de la gráfica, se indica
mediante las concentraciones M y N, o sea 83% para una concentración media de siete copias y 28% cuando tres
de los cuatro tubos contienen una copia (0,7 de concentración, o -0,15 en logaritmo). La dispersión de las
medidas, y por ello el margen de error, se incrementan perceptiblemente. Nótese que un buen número de medidas
M y N no se alinean con su recta particular, aunque no lo hagan por motivos de azar. Por tanto, sólo replicando
más veces las medidas es posible determinar con precisión esta fase.
3. La recta de calibrado, por tanto, representada en un gráfico semilogarítmico da lugar a una recta definida por la
fórmula Y = aX + B donde:
• Y es el CT medido por el termociclador.
• La pendiente a deriva de la eficiencia de la PCR, y puede ser calculada mediante la ecuación
Nótese que en el esquema se representa el caso más frecuente en el que la concentración está expresada
en logaritmos decimales. Esta pendiente está a menudo considerada como una constante de
amplificación para cada gen, par de cebadores y condición de PCR particular. Por ello esta pendiente o
eficiencia de amplificación se emplea para cuantificar en la PCR cuantitativa.
• X es la concentración de ADN inicial expresada en logaritmo de copias/tubo, ng/µL, unidades arbitrarias, etc.
• B es un punto matemático sin realidad experimental (log 0 = 1/∞) que, sin embargo, puede ser empleado para
calibrar cada experimento de PCR (los «runs», en inglés) con sus semejantes. De este modo, si las rectas de
calibrado lo fueron por su intersección al origen B, la dispersión será menor, salvo para los puntos M y N.
1. La recta de regresión no pasa por el punto central de la dispersión en cada medida para las concentraciones M y
N, pero sí según la pendiente y un factor de «amortiguación». Esto es: si consideramos CT medios para L y N
serán modelizados de mejor manera mediante un polinomio de segundo grado. El software de algunos
termocicladores permite tener en cuenta esta «amortiguación», si bien hay que tener en cuenta que:
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• Dicha amortiguación es extremadamente variable de una recta de calibrado a otra, y la corrección que se
modeliza no corresponde probablemente a aquélla que pasa por la muestra cuantificada. El software comercial
lo modeliza para una sola muestra.
• La imprecisión en la cuantificación a estas concentraciones es tan importante que la modelización de la
«amortiguación» puede ser necesaria.
• Esta «amortiguación» corresponde, cuando se dibujan las rectas, a una reducción de la pendiente luego de un
aumento de la eficacia de PCR, así que el incremento de los efectos estocásticos puede reducirse. Nótese
además que esta «amortiguación» se define principalmente según la concentración más baja (N, 0,7 copias en
el ejemplo). O lo que es lo mismo, no podrá realizarse amplificación alguna si no se tiene al menos una
molécula completa del ADN a amplificar. El sesgo producido en la distribución gaussiana del error puede
provocar esta aparición de datos extraños o «amortiguaciones medias».
Luego la recta de calibrado permite una cuantificación para un protocolo experimental dado pero hay que tener en
cuenta que existen multitud de fuentes de error potenciales, como diferencias de composición química del tampón de
reacción, de las muestras (presencia de proteínas, ARN, etc) e incluso del diluyente (el agua, generalmente).

Enfoques
Como se indicaba anteriormente, es posible por tanto cuantificar la expresión génica en términos absolutos como en
relativos (es decir, por comparación con la expresión de otro gen). En el segundo caso, es de vital importancia
seleccionar como gen estándar aquél que cuya expresión realmente no varíe cuando se somete al individuo al
tratamiento experimental cuyo efecto en la transcripción se desea estudiar (por ejemplo, un estrés ambiental,[17]
biótico[18] o tipo de tejido[19] ).
Cuantificación absoluta
Que se basa en las características de la fase exponencial de la curva sigmoide de emisión de fluorescencia.[20]
Responde a la ecuación:

donde Q es la cantidad de ADN, n corresponde al número de ciclo, o es el ciclo de partida y E la eficiencia de

la reacción.
Luego en el ciclo en el que se sobrepasa el nivel umbral (esto es, el CT), se dice que:

(1)

Cuantificación relativa
Que establece una relación R entre la cantidad de ADN inicial de una muestra respecto de la de un testigo, que se
asume se expresa de forma invariable e independiente del tratamiento. En su detección tenemos que:[4]

sustituyendo de (1) tenemos que

y, por tanto
o:
Desde 2002 existe una tendencia a emplear varios genes normalizadores para realizar una cuantificación relativa
fiable; de este modo, se generan factores de normalización que ponderan de algún modo el impacto de cada gen
interno; una aproximación común se basa en el empleo de medias geométricas de estos genes normalizadores.[15]
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Selección de genes de normalización

El análisis estadístico que permite la detección de los genes expresados de forma más estable en la serie de tejidos
estudiada es crucial, puesto que de él depende la elección de los genes que se emplearán como control interno
durante los ensayos de cuantificación relativa. Con el fin de evaluar esta estabilidad, en algunos casos se comparan
sus valores CT; en otros, sus cantidades relativas empleando la muestra cuyo CT es menor como elemento
normalizador.
Como primera aproximación el algoritmo geNorm[15] permite el cálculo de un valor de estabilidad M inversamente
proporcional a la estabilidad del gen en cuestión, y de una serie de valores "PV" que definen el número mínimo de
genes adecuado para efectuar una normalización fiable. El cómputo de valor M se basa en definir la variación media,
calculada comparando pares dos a dos, de un gen frente a todos los demás genes presentes en el estudio. El algoritmo
se realiza en varios pasos, puesto que en cada ronda de comparaciones se suprime el gen que ha obtenido un peor
valor; de este modo, es capaz de adjudicar un valor M a cada gen salvo para los más estables, que comparten el
mismo. En cuanto a valores PV, su cómputo se basa en el diseño de un factor de normalización óptimo; al principio,
éste se realiza con los dos genes más estables pero, secuencialmente, se le van añadiendo otros hasta que dicha
adición no mejora significativamente la precisión de aquél. Así, se define un valor PV para las comparaciones entre
Vn/n+1, estimado como la desviación estándar de los ratios transformados logarítmicamente de .

Otro algoritmo, denominado NormFinder, aprovecha los valores CT para ajustar un modelo matemático de la
expresión génica capaz de evaluar las variaciones presentes dentro y entre los grupos (tipo de órganos, tratamientos
químicos...) definidos por el investigador. De este modo, los genes con una variación inter e intragrupo mínima son
los considerados más estables, poseyendo un valor de estabilidad S mínimo.[21]
También es posible evaluar no ya la estabilidad mediante comparaciones dos a dos, sino analizar el coeficiente de
variación de los niveles de expresión relativos normalizados. Esta aproximación, propia de qBase o qBasePlus[22] ,
requiere de la transformación de los valores CT iniciales en cantidades relativas teniendo en cuenta los valores de
eficiencia de la PCR y empleando como calibrador el gen con menor CT; tras esto, se calcula un factor de
normalización para cada muestra empleando la media geométrica de los valores relativos estmiados para todos los
genes candidatos.

Empleo de sondas específicas

La PCR en tiempo real puede realizarse marcando fluorescentemente oligonucleótidos que detectan específicamente
la aparición del producto deseado. El fundamento de esta técnica se basa en el empleo del FRET o transmisión de
energía de resonancia, que es un mecanismo de transferencia de energía entre cromóforos. EL FRET se fundamenta
en que la excitación de un cromóforo puede transferirse a otro cercano, generalmente cuando ambos se sitúan en la
misma molécula, mediante un mecanismo acoplador dipolo-dipolo.[23] En el caso de que los cromóforos sean
fluorescentes (esto es, fluorocromos), el mecanismo subyacente continúa siendo el mismo: la energía se transfiere, lo
que desemboca en la aparición de fluorescencia (cabe destacar que no es la fluorescencia la transferida)[24] [25] Las
sondas empleadas en PCR a tiempo real existentes son:
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Sondas tipo Taqman.

• Las sondas TaqMan permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas
mediante dos fluorocromos. Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el
5' que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada hibrida
específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener. De este modo, cuando se efectúa la PCR (con
la sonda más el par de cebadores específicos), la sonda hibrida en el amplicón, pero, debido a la cercanía del
fluoróforo al quencher, no se emite fluorescencia; cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante
su actividad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, la emisión
de fluorescencia. Fluorescencia que está relacionada con la cantidad de amplicón producido.[26]
• Las sondas tipo Molecular Beacons son también olignucleótidos de
cadena simple que, por su estructura, poseen una zona de
apareamiento de bases interna y, que, por tanto, forman una
horquilla. En presencia del amplicón la sonda se abre y se une
preferentemente a aquél, lo que produce la emisión de
fluorescencia. Estructuralmente, poseen la zona complementaria al
amplicón en el giro de la horquilla, la de complementariedad interna
en el cuello y los fluoróforos en sus extremos: el donador en el 5' y
el aceptor en el 3'. Cuando la sonda está cerrada en horquilla, el
Sondas tipo molecular beacons.
fluoróforo del 3' impide la emisión de fluorescencia por parte del
propio del 5', cosa que no sucede al unirse al amplicón.[27]

• Sondas Scorpion. Se trata de moléculas mixtas conteniendo un

cebador específico para el amplicón unido covalentemente a una
horquilla similar a las sondas del tipo molecular beacon que, en su
zona de giro, poseen un elemento complementario al amplicón. Los
fluoróforos donador y aceptor se encuentran en la estructura de
horquilla; de este modo, cuando ésta se encuentra cerrada no se
produce la emisión de fluorescencia, cosa que sí sucede cuando
ambos se separan debido a la presencia del amplicón y la apertura
de la zona en horquilla.[28]
Sondas tipo scorpion.
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Aplicaciones tecnológicas
Si bien el uso más ampliamente difundido de la Q-PCR consiste en la evaluación de la expresión génica de genes
concretos de forma relativa (empleando ARNm de la muestra y retrotranscribiéndolo a ADNc, que es medido
mediante la técnica), otras aplicaciones han sido desarrolladas fuera del entorno puramente académico. Las
aplicaciones de impacto en la industria incluyen la cuantificación de carga microbiana en alimentos o en material
vegetal, la detección de OGM (organismos genéticamente modificados) y la cuantificación y genotipado de
patógenos virales en humanos.

Detección de fitopatógenos
La producción de propágulos vegetales o plántulas libres de patógenos es una constante en la industria agronómica
por cuestiones de económicas y de sanidad. Para el caso de Phytophthora ramorum, un hongo que causa muerte
súbita en robles y otras especies, se han desarrollado sistemas basados en sondas Taqman que son capaces de
detectar una cantidad de 10 a 100 fg mezclados en el ADN de la planta hospedadora. La discriminación entre el
ADN del patógeno y de la planta se hace amplificando secuencias ITS, unos espaciadores situados en la zona
codificante de los genes de ARN ribosomal que son característicos para cada taxón.[29] Existen variantes con sondas
scorpion, molecular beacon y LAMP para el mismo patógeno que, además, pueden ser aplicadas en campo.[30]

Detección de OGM
La Q-PCR (precedida de retrotranscripción) se emplea en la detección de OGMs debido a la alta sensibilidad y rango
dinámico de detección de ADN; sus alternativas, como son el análisis del ADN o de las proteínas suelen poseer
menos sensibilidad. Para ello se emplean cebadores específicos que amplifiquen no ya el propio transgén, sino su
promotor, terminador e incluso sus secuencias intermedias, empleadas durante el proceso de ingeniería del vector.
Además, puesto que el proceso de creación de una planta transgénica suele conducir a la inserción de más de una
copia del transgén, es preciso evaluar su cantidad; para ello, se efectúa una cuantificación relativa empleando como
gen control uno, propio de la especie tratada, que se encuentre en copia única.[31] [32]

Cuantificación y genotipado en clínica

Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patógenos concretos o a coinfecciones, y este
hecho no sólo puede dificultar el diagnóstico mediante las técnicas clásicas, sino que puede redundar en un distinto
pronóstico y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la Q-PCR posibilita tanto la
cuantificación como el genotipado (caracterización de la cepa, que se hace mediante curvas de melting) de virus
como el HBV (virus de la hepatitis B).[33] El grado de infección, cuantificado como las copias de genoma viral por
unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes
simple de tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios.[34] Esta
cuantificación se realiza mediante retrotranscripción o sin ella, en el caso de que los virus se integren en el genoma
humano en algún momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano), alguna de cuyas
variantes está asociada con la aparición de cáncer de cérvix.[35]
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Referencias
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Citas en línea
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Fuentes y contribuyentes del artículo

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Fuentes de imagen, Licencias y contribuyentes

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Frederique and Toomes, Carmel and Bransfield, Kieran and Leong, Fong and Douglas, Susan and Field, Sarah and Bell, Sandra and Combaret, Valerie and Puisieux, Alain and Mighell, Alan and
Robinson, Philip and Inglehearn, Chris and Isaacs, John and Markham, Alex
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User:S._Jähnichen

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