PRACTICA N 06

REVELACIN DE LOS ENZIMAS, QUE SE RELACIONAN A DIFERENTES CLASES

Todos los enzimas, en dependencia del tipo de reacciones qumicas catalizadas se dividen en seis clases:
oxidoreductasas, Transferasas, Hidralasas, Liasas, Isomerasas, Ligases (sintetasas). Al interior de cada
clase los enzimas se subdividen en subclases y sub-subclases, que especifican la naturaleza de la reaccin
enzimtica.
Para la identificacin de los enzimas de cada clase en el material biolgico se tienen sus particularidades, por
eso es necesario determinar las condiciones del curso de la reaccin enzimtica.
Las reacciones cualitativas en los enzimas los utilizan en la prctica higinica en la disposicin de las
muestras sobre la presencia de enzimas en los productos alimenticios (leche, papa, etc.) En el fraccionamiento
de los enzimas por el mtodo de electroforesis su identificacin tambin la realizan con la ayuda de reacciones
cualitativas.

1. DETERMINACIN DE XIDO-REDACTASES EN MATERIAL BIOLGICO

En las reacciones, catalizadas por las xidoreductasas, el substrato que se oxida se considera como
donador de hidrgeno o electrones, y aceptor pueden ser sustancias naturales (coenzimas NAD, NADP,
FMN, FAD, CoQ, oxgeno, compuestos orgnicos, citocromos, etc.) y xenobiticos.
Para la mayora de los enzimas de esta clase se recomiendan las denominaciones: deshidrogenasas y
reductasas. En aquellos casos, cuando el aceptor es el oxgeno se emplea el trmino oxidasa, y si el oxgeno,
en el curso de la reaccin, se incluye en la composicin del substrato, el enzima se le denomina oxigenasa.
Peroxidasa es el enzima que utiliza H2 02 en calidad de aceptor, y catalasa el enzima que cataliza las
reacciones, donde el par donador-aceptor lo constituyen dos molculas de H2 02.
Instrumental, reactivos. Gradillas con tubos de ensayo; bao de agua; termmetro; pipetas de 1 y 5 mL;
formaldehdo, solucin al 0,4%; azul de metileno, solucin al 0,01%.
Material. 1. Jugo de papa (papa fresca se ralla en el rallador y la exprimen a travs de dos capas de gasa).
2. Leche fresca de vaca

a. Revelacin de aldehdoxidasa (aldehdo: oxgeno-oxidoreductasa; EC 1.2.3.1) en la leche.

El mtodo se basado en la observacin visual de la decoloracin del azul de metileno (AM), que liga el
hidrgeno, que se desprende del sustrato por accin de aldehdoxidasa.
El enzima aldehdoxidasa cataliza la reaccin de deshidrogenacin de diferentes aldehdos, por
ejemplo, el formaldehdo. El hidrgeno se transporta a FAD, que es el coenzima del enzima dado, y luego sobre
el aceptor final oxigeno por la ecuacin:

Al agregar AM aceptor artificial de hidrgeno en condiciones de ausencia de oxigeno se origina su forma

reducida (forma leico) AM H2.

Si la solucin incolora de azul de metileno se agita, entonces nuevamente adquiere el color azul:

Curso de la determinacin. En dos tubos de ensayo colocan 5 mL de leche fresca y le agregan al primero 1
mL de agua, y al segundo el mismo volumen de formaldehdo. A ambos tubos de ensayo le aaden I mL de
solucin de azul de metileno, el contenido lo mezclan y le agregan 3-4 gotas de aceite de vaselina (para
proteger a la mezcla lquida del contacto con el oxgeno del aire).
Los tubos los colocan en bao de agua, calentado hasta 37 C. Despus de 5-10 min comparan el cambio de
coloracin en ambas muestras. Luego de agitar fuertemente el tubo de ensayo, nuevamente observar la
variacin del color.

b. Revelacin de la peroxidasa (donador: H2O2 oxidoreductasa; EC 1.11.1.7) en la papa y en la

leche
El fundamento del mtodo se encuentra en la reaccin con benzidina, basado en la capacidad del enzima
de catalizar la reaccin de oxidacin de la benzidina a difenoquinoidimina con perxido de hidrgeno. El
compuesto difenilquinoidimina, se condensa con la molcula de la benzidina no oxidada con la formacin de un
complejo de color verde-azulado.

Peroxidasa

Curso de la determinacin. En dos tubos de ensayo agregan, en uno 1 mL de leche cruda fresca y en el otro jugo
de papa. A ambos tubos aaden 5 gotas de la solucin alcohlica de benzidina y una gota de perxido de
hidrgeno. Observar la coloracin caracterstica.
Presentacin del trabajo. Los resultados anotarlos en la tabla y establecer la coloracin caracterstica del
indicador de la reaccin.

En las conclusiones se debe indicar sobre la presencia, en el material biolgico, de los enzimas
estudiados y el significado prctico del trabajo.

c. Revelacin de catalasas en la papa

Instrumental y reactivos: Tubos de ensayo, probeta de 50 ml, vasos de 100 ml, manguera, cuchillo, mechero con
trpode y rejilla, tapn perforado con tubo en ngulo recto, pipeta Pasteur y peroxido de hidrogeno de 20 vol.
Material de trabajo: 2 papas.
Procedimiento:
En dos tubos en ensayo colocar 2mL de zumo de papa y en otros dos tubos de ensayo colocar 2 mL de zumo de
zanahoria, dos de los tubos uno que contiene zumo de papa y otro que contiene zumo de zanahoria, calentarlos a bao
mara a 80C, luego djelos entibiar, una vez que estn tibios verter a los cuatro tubos de ensayo III gotas de perxido
de hidrogeno de 20 vol o una solucin diluida 1:30 y observe.
Adems de visualizar la produccin de burbujas que indican la gran actividad de la catalasa se puede colectar el O 2
por desplazamiento de agua en una probeta graduada como indica la Figura:

Dispositivo para colectar O2 desprendido del H2O2 por la catalasa.

Resultados:
a. Observe lo que ocurre en cada uno de los tubos y antelo.
b. Compare ambos resultados y explique las diferencias.

d. Determinacin de la peroxidasa (donador: h202-oxidoreductasa; ec 1.11.1.7) en la papa

Instrumental y reactivos: Rallador; papa fresca; pirogalol al 1%, perxido de hidrgeno al 2%.
Rallan la papa en el rallador. Una pequea parte de ella sin exprimirla la colocan en un tubo de ensayo le agregan
1-2 ml, de la solucin de pirogalol y 1-2 gotas de la solucin de perxido hidr6geno. Durante el reposo se forma un
precipitado pardo-amarillento de la prpurogalina. La formacin de prpurogalina se expresa por el siguiente
esquema:

La deshidrogenacin reiterada (Oxidacin) del pirogalol y de una serie de productos intermedios en la va

hacia la formacin de purpurogalina se realiza con la participacin de la peroxidasa, que cada vez transfiere al
perxido de hidrgeno los tomos de hidrgeno separados.