REPORTE FINAL PARA EL PROYECTO Deteccin de Salmonella en chile habanero (Capsicum chinense) Muestreo: El muestreo fue realizado en 4 puntos

s diferentes en las localidades de Muna, Halach, Yucatn, Central de abasto y Mercado local de Mrida Yucatn. Se bas en el Proyecto de norma toma y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico NOM-109-SSA1-1994. La toma de muestra se realiz in situ bajo condiciones aspticas, se envaso en bolsas estriles y fueron trasladadas al Laboratorio de Inocuidad Alimentaria para ser analizadas.

METODOLOGIA: Se procesaron 4 muestreos mensuales de 25 g de chile habanero utilizando un control positivo siendo la cepa de Salmonella y un control negativo E. colli para comparar los resultados. Los muestreos realizados del mes de febrero a mayo fueron las siguientes fechas:
LUGAR DE MUESTREO Halach Muna Central Mercado Halach Muna Mercado Central Mercado Halach Muna Central Mercado Halach Muna FECHA DE MUESTREO 09/02/2013 09/02/2013 16/02/2013 16/02/2013 09/03/2013 09/03/2013 19/03/2013 10/04/2013 10/04/2013 20/04/2013 20/04/2013 07/05/2013 07/05/2013 25/05/2013 25/05/2013

Cada muestra de chile habanero fue hecha por triplicado siguiendo el protocolo de la Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994 se realiz en cuatro etapas: Pre-enriquecimiento: Para el pre-enriquecimiento no selectivo. En condiciones de asepsia se cort el chile habanero en rajas y se pes en 25 g aadiendo en los matraces diferentes homogenizando correctamente y para los controles positivo y negativo se tomaron con un asa estril una colonia aislada de Salmonella y E. colli introduciendo a una matraz con caldo lactosado estos fueron incubados a 35 C 2 C por 24 h.

Enriquecimiento selectivo: Para el enriquecimiento selectivo se prepararon con anterioridad tubos que contenan 10 ml de caldo tetrationato y otros tubos que contenan 10 ml de caldo selenito cistina .Se aadi 1 ml de cada muestra de los matraces que contenan el medio pre-enriquecido a 2 tubos (uno con selenito cistina y otro con caldo tetrationato) .Los tubos fueron incubados a 35 C 2 C por 24 h. Aislamiento en medios slidos selectivos y diferenciales: Se aisl los microorganismos en medios selectivos en placas que contenan 20 ml de agar verde brillante (VBA), agar Salmonella-Shigella (SSA) y en agar xilosalisina-desoxicolato (XLDA). Por cada tubo de enriquecimiento selectivo se sembraron 3 placas por estra cruzada .Las placas fueron incubadas 35 C 2C por 24 h. Posteriormente se determin el crecimiento de colonias caractersticas de Salmonella. Pruebas Bioqumicas A las colonias sospechosas se les realizo las pruebas bioqumicas en agar tripleazcar-hierro (TSIA), agar lisina-hierro (LIA) y agar urea de christensen.Estos fueron preparados con anterioridad utilizando la tcnica pico de flauta. En los tubos se solidifica el agar inclinado en un ngulo aproximadamente de 45 y se realiza la siembra por picadura y estra en superficie tomando el inoculo en las placas con colonias sospechosas. Los tubos fueron incubados a 35 2C por 24 h para la observacin de los resultados.

RESULTADOS RELEVANTES Y DISCUSIONES El pre-enriquecimiento con caldo lactosado permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, mantenindolas en condiciones fisiolgicas estables. El enriquecimiento selectivo donde utilizamos caldo tetrationato y selenito cistina permite incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. El enriquecimiento selectivo en AXLD, ASS y AVB restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas .Las caractersticas de las colonias tpicas de Salmonella vara segn el medio solido selectivo segn la norma oficial (cuadro 1). Cuadro 1: Caractersticas tpicas de Salmonella en medios slidos selectivos Medio slido Agar brillante Color antes inoculacin de la Caractersticas coloniales de Salmonella Rosas o rojas pueden ser transparentes, rodeadas de medio enrojecido.
Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras Translcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas

verde Oscuro, color marrn

Agar Xilosa Claro, color rojo brillante Lisina Desoxicolato

Agar Salmonella Claro, color rosa y Shigella

En el muestreo realizado el 9 de febrero en Muna y Halach las muestras dieron positivas en Halach desde las colonias sospechosas hasta en la pruebas bioqumicas.

Tabla1: Colonias sospechosas en medio de cultivo en placa de Halacho y Muna

MEDIOS DE CULTIVO EN PLACA Muestra en placa M6M1 M6M2 M6M3 M7M1 M7M2 M7M3 Lugar de muestreo Halacho Fecha 09/02/2013 AXLD + AVB + + ASS + + -

Muna

09/02/2013

(+) Crecimiento de colonias sospechosas de Salmonella ( -) Crecimiento de colonias diferentes a Salmonella

Las colonias que resultaron sospechosas (tabla 1) en los medios de cultivo fueron manifestadas de la siguiente manera: En agar verde brillante las colonias fueron presentadas de color rosa aunque tambin se presentaron colonias verdes. (Imagen 1) En agar Salmonella y Shigella fueron con centro negro aunque tambin se encontraron colonias rosadas. (imagen 2) En agar XLD fueron colonias completamente negras

Imagen 1: Control positivo Salmonella en agar verde brillante.

Imagen 2: Colonias sospechosas de color rosa del muestreo de Halach.

Imagen 3: Control positivo Salmonella y Shiguella.

Salmonella en agar

Imagen 4: Colonias sospechosas de color negro del muestreo de Halach en agar Salmonella y shigella

Para la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos se procedi a realizar las pruebas bioqumicas. Los resultados positivos en las pruebas bioqumicas fueron comparados con el control positivo. Las colonias positivas se presentaron de la siguiente manera en: Agar triple-azcar-hierro (TSIA) en la superficie del tubo se encuentra la fermentacin de lactosa y sacarosa tomando un color rojo, en el fondo del tubo la fermentacin de la glucosa como formacin de cido que se manifiesta por cambio de color del indicador rojo fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo. En agar lisina-hierro (LIA) fueron considerados positivos aquellos que presentaron una intensificacin del color purpura en todo el tubo debido a la descarboxilacin de la lisina y en el fondo del tubo ennegrecido por la produccin de cido sulfhdrico en el medio. La prueba bioqumica con urea de christensen revelo la presencia de Salmonella debido a que no hubo un vire de color en el medio ya que Salmonella no es capaz de utilizar la urea .Las muestras de chile habanero realizadas el 9 de febrero en la localidad de Halach dieron resultados positivos de Salmonella. Tabla 2: Resultados con pruebas bioqumicas del muestreo de Halach
PRUEBAS BIOQUMICAS Agar de triple azcar y hierro + + Agar de hierro y lisina + -

Lugar de Sospechosas muestro M6M1 M6M2 Halacho M6M3 M7M3 Muna

Fecha 09/02/2013 09/02/2013

Agar con urea de + -

(+) Presencia de Salmonella segn las pruebas bioqumicas ( -) Ausencia de Salmonella segn pruebas bioqumicas

Los siguientes muestreos en febrero (central de abasto y mercado) no dieron resultados positivos de Salmonella, en el mes marzo, abril , mayo se volvi a muestrear en los 4 puntos que son mercado de Halacho , Muna, central de abasto y mercado central de Mrida donde no se volvi a encontrar Salmonella sin embargo cabe aclarar que en cada muestreo fueron encontradas colonias sospechosas en los medios de cultivo en placa , pero estas posibilidades de presencia de Salmonella eran descartadas al dar un resultado negativo en las pruebas bioqumicas.

Tabla 3: Resultados finales de los muestreos durante el mes de febrero a mayo

MUESTRA MUESTREO 6 MUESTREO 7 MUESTREO 8 MUESTREO 9 MUESTREO 10 MUESTREO 11 MUESTREO 12 MUESTREO 13 MUESTREO 14 MUESTREO 15 MUESTREO 16 MUESTREO 17 MUESTREO 18 MUESTREO 19 MUESTRO 20 LUGAR DE MUESTREO Halacho Muna Central Mercado Halacho Muna Mercado Central Mercado Halacho Muna Central Mercado Halacho Muna FECHA DE MUESTREO 09/02/2013 09/02/2013 16/02/2013 16/02/2013 09/03/2013 09/03/2013 19/03/2013 10/04/2013 10/04/2013 20/04/2013 20/04/2013 07/05/2013 07/05/2013 25/05/2013 25/05/2013 RESULTADO FINAL + -

(+) Presencia de Salmonella en 25 g de chile habanero. ( -) Ausencia de Salmonella en 25 g de chile habanero

CONCLUSIONES: El muestreo realizado el 9 de febrero en la localidad de Halach se obtuvo resultados positivos, aquellas colonias que eran sospechosas fueron confirmadas en las pruebas Bioqumicas, por lo tanto se concluye que en ese muestreo existe la presencia de Salmonella en 25 gramos de chile habanero. En los siguientes muestreos realizados en los meses posteriores no se detect presencia de Salmonella aunque no se descarta la presencia de otros microorganismos patgenos como una alta concentracin de coliformes E. colli. Las pruebas bioqumicas realizadas con agar de triple azcar y hierro y agar de hierro lisina dieron resultados negativos por lo tanto no fue necesario la realizacin de las pruebas bioqumicas con agar urea de christensen en los dems muestreos.