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2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
INTRODUCCIÓN
Durante los tres siglos que han pasado desde que
Leeuwenhoek observara bacterias y protozoos por pri-
mera vez con un microscopio primitivo, se ha acumula-
do un vasto conocimiento acerca de los pequeños "ani-
máculos" que ahora se conocen colectivamente como
microorganismos. Los microorganismos se pueden en-
contrar en todos los ambientes, incluidos el suelo, el agua
y el aire. Participan de todas las funciones vitales que han
sido observadas en formas de vida superiores, más com-
plejas. Estos microorganismos se encuentran en asocia-
ción con el medio ambiente inanimado y con otros orga-
nismos vivientes como plantas, animales y el hombre.
Debido a sus actividades en esos entornos, los microor-
ganismos contribuyen de un modo inmensurable al equi-
librio que permite que la vida florezca. Los mecanismos
de muchos procesos vitales que ocurren en todas las for-
mas de vida han podido ser dilucidados mediante el estu-
dio de los microorganismos. Su papel en la naturaleza y
sus contribuciones a los ciclo~iológico y ecológico que
mantienen el delicado equilibrio en nuestro medio am-
biente recién ahora comienzan a ser apreciados plena-
mente. Por necesidad, los capítulos siguientes de este
texto tratan de un número relativamente pequeño de mi-
croorganismos capaces de producir patologías y enfer-
medades en el hombre. La historia de los microorganis-
mos patógenos -su morfología, fisiología, bioquímica e
interacciones corno agentes infecciosos en el hombre- se
desarrolla en los siguientes capítulos. Este texto capta só-
lo una pequeña porción de una base de datos que se ex-
pande en forma exponencial, respecto del número y cla-
ses de microorganismos y de las propiedades que los ha-
cen capaces de causar enfermedad. El material presenta-
do aquí es so!arnente un vistazo rápido de la microbiolo-
gía clínica del presente, con una mirada respetuosa a los
avances científicos de los años pasados y con la visión de
que las nuevas tecnologías descritas en éste y en próxi-
mos capítulos han revolucionado ya las prácticas de la-
boratorio y continuarán afectando las estrategias actuales
y futuras del arte y la ciencia de la microbiología clínica.
Hacia fines del siglo XIX, Pasteur había destruido ex-
perimentalmente el mito de la generación espontánea y
Koch, entre otros, había demostrado que los microorga-
nismos eran capaces de ocasionar enfermedades infec-
ciosas. Aunque-Jas técnicas actuales permiten detectar de
un modo más directo la virulencia y patogenicidad mi-
crobianas, que de alguna manera hacen que los postula-
dos de Koch se tomen obsoletos, los supuestos funda-
·mentales de aquellos postulados todavía sirven corno ba-
se para relacionar inequívocamente a los microorganis-
mos con la enfermedad que ellos causan. Los postulados
de Koch se exponen en el recuadro 1-1
Desde hace un poco más de cien años, los sistemas
han ido evolucionando para poner a los microorganismos
dentro de un esquema .pe clasificación lógico: dentro de
taxones, sobre la base de la morfología, la filogenia, la fi-
siología, la bioquímica y, más recientemente, del paren-
tesco genético,
Con el advenimiento de los medios de cultivo sólidos,
que permitieron aislar los microorganismos patógenos en
cultivos puros, se hizo necesario el desarrollo de un sis-
tema estandarizado mediante el cual los nuevos microor-
gánisrnos aislados se pudieran identificar, nombrar y aso-
R ECll,\1)1!0 1-1. POSTULADOS DE Kou,
1. Un microorganismo determinado debe estar presente_
en todos los casos de una enfermedad infecciosa dada.
2. El microorganismo puede ser aislado de muestras ob-
tenidas de individuos enfermos con esta patología.
3. La inoculación del aislamiento en animales suscepti-
bles produce una enfermedad similar.
4. El mismo microorganismo que es asociado con el es-
tado de enfermedad puede ser recuperado de muestras
representativas obtenidas de animales infectados ex-
perimentalmente. -
ciar precisamente con una enfermedad determinada. El
primer paso para familiarizarse con estas bacterias es el
mismo que se debe seguir para conocer a una persona; es
necesario saber su nombre. Dado que aquí comienza
nuestro estudio del mundo de los microorganismos como
agentes causales de enfermedad en el hombre, es impor-
tante señalar primero cómo se "non¡bran" las bacterias
y otros microorganismos, es decir, la ciencia de la taxo-
nomía.
TAXONOMÍA: CLASIFICACIÓN,
NOMENCLATURA E IDENTIFICACIÓN
DE LAS BACTERIAS
La taxonomía de las bacterias se refiere específica-
mente a tres conceptos básicos: clasificación, nomencla-
tura e identificación. La clasificación se refiere a la divi-
sión sistemática de microorganismos en grupos relacio-
nados por sus características similares e incluye a la es-
pecie corno el nivel de división más pequeño y definido...,
Aunque phylum o división, subphylum, clase, subclase,
orden, suborden y superfarnilia son grupos taxonómicos
(taxones) progresivamente más abarcativos dentro de los
reinos de las plantas superiores y los animales, los taxo-
nes que comprenden familia, género y especie son los ni-
veles de clasificación más usados para las bacterias, los
protozoos y los hongos patógenos. La especiación de los
microorganismos ocurre en el momento en que un mi-
croorganismo es clasificado y nombrado, aunque la re-
clasificación de microorganismos individuales puede
ocurrir de tanto en tanto.
La nomenclatura hace referencia al nombre de los
microorganismos. La nomenclatura de los microorganis-
mos está gobernada pQr reglas internacionales desarro-
lladas y aplicad~ sientíficos dedicados a la taxono-
mía, de modo que un microorganismo con un nombre
dado (p. ej., una especie) es reconocido internacional-
mente de modo inequívoco como el mismo. Estas reglas
son publicadas en el International Code of Nornenclatu-
re of Bacteria (Código Internacional de Bacterias); la
revisión más reciente de este documento fue publicada
en 1992.240 Estas reglas se enumeran en el recuadro 1-2.
Tanto la taxonomía corno la clasificación dependen
del uso de técnicas de identificación, que consisten esen-
cialmente en el proceso de caracterización de un mi-
croorganismo dado a fin de determinar su clasificación
su relación con· otros microorganismos similares o dife: i
rentes y, de esta manera, asignarle un nombre. r ,

R ECUADRO 1-2.
R EGLAS PARA LA NOMENCLATURA DE
LOS MICROORGANISMOS
I. Existe un solo nombre correcto para un microorganis-
mo. ~uand º exiSle más de un nombre para la misma
especie, el _nombr~ legitimado más antiguo para ese
microorgam~mo nene prioridad. Los nombres pro-
pueSlos ocasionalmente Yaceptados deben ser cambia-
dos para .refleiar
, las te rrmnac1ones
· · . .
latm1zadas .
apropia-
d~s (p. eJ., el nombre Alloiococcus otitis se debe cam-
biar por Alloiococcus otitidis).'·211
2· Los nombres que causen error o confusión deben ser
rechazados.
3. Todos
. dánlos nombres esta'n en lat'm o 1a1·1mza . dos (es de-
cir, dales tenninaciones que concuerden en uso y
género _apropiados [masculino, femenino, neutro]) in-
dependientemente de su origen.
a. La primer~ palabr~ (género) se escribe siempre con
letra mayuscula 1mcial.
b. La s~gunda palabra (especie o epíteto específico) se
escnbe en minúsculas.
c. Tanto el nombre del género como el de la especie, a
los cuales se hace referencia en forma conjunta co-
mo la especie, se subrayan o se escriben en bastar-
dilla cuando aparecen impresos.
d. El. ~?mbre correcto de una especie o de una desig-
nac1~n taxonómica superior se determina por una
pubhcac1ón válida, por la legitimidad del nombre
de_ ª':uerdo con las reglas de nomenclatura y por
pnondad de publicación.
Una especie bacteriana es una colección de cepas que
com~arten caract~rísticas comunes. Las cepas son des-
cen~1entes de un a1sla~o a partir de un cultivo puro; .la ce-
pa tipo representa e_l e1emplo permanente de la especie y
lleva el nombre de referencia. El nombre de la especie
generalmente refleja un .rasgo morfológico o una carac-
terística bioquímica del microorganismo o puede conme-
morar a una persona famosa (usualmente un microbiólo-
go) o un lugar. Todas las especies están asignadas a un
género, que en general se encuentra morfológica y bio-
químicamente bien definido; sin embargo, muy a menu-
do entre los microbiólogos suele haber subjetividad res-
pecto de qué es exactamente un género y una especie.
Los géneros son a su vez agrupados en tribus y familias,
cada w;io de los cuales presenta rasgos morfológicos, fi-
siológicos y biqquímicos generales pero distintivos. Por
convención taxonómica aceptada, los nombres de los ór-
denes terminan en -ales (p. ej., el orden Eubacteriales),
los nombres de las familias poseen la terminación latina
-aceae (p.ej., la familia Enterobacteriaceae, la familia
Neisseriaceae) , y los nombres de las tribus terminan en
-eae (p.ej., la tribu Proteae). El agrupamiento taxonómi-
co se ha basad<;> históricamente sobre características fe-
notípicas.
Debido a que los fenotipos pueden cambiar o a que se
pueden· descubrir caracterí~ticas bio9uímic~s adicionales
que determinan que un microorganismo pierda una de-
signación previa, de vez en cuando ocurren camb10s de
nombre que consternan a microbiólogos y médicos. El
enfoque actual de la taxonomía y la nomenclatura en los
determinantes genéticos que reflejan parentescos (horno-
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 3
logía del DNA, análisis de secue?~i~ del DNA, análisis
del RNA ribosómico 16S) perm1t1ran finalmente a los
microbiólogos establecer sistemas taxonómicos más es-
tables en los que los cambios de nombre futuros sean me-
nos frecuentes.
Como fue señalado por Staley y Krieg (Bergey 's Ma-
nual of Systematic Bacteriology, Volumen 1, 1984), "no
242
existe una clasificación 'oficial' de bacterias". ª Una de-
signación nueva o revisada de una especi~ puede ser rea-
lizada por cualquier investigador al publicar u? nombre
legítimo, que siga las reglas de nom_enclatura_c1tadas an-
tes. Una vez que el.nombre de un lillCroorgamsmo es pu-
blicado en el /nternational Journal of Systematic Bacte-
riology (/JSB), queda validado y se considera correcto a
menos que sea objetado en publicaciones posteriores. Las
discrepancias respecto de la validez del nombre de nuevas
especies se canalizan mediante la publicación de una "so-
licitud de opinión" de la Judicial Commission of the In:
ternational Un ion of Microbiological Societies (Comisión
Judicial de la Unión Internaciona.1 de Sociedades Micro-
biológicas). Esta comisión generalmente remite las peti-
ciones a cuerpos más pequeños que tratan sobre grupos
específicos de microorganismos (p. ej., el International
Committee on Systematic Bacteriology Subcommittee on
the Taxonomy of Pasteurellaceae and Related Organisms
[Subcomité de Bacteriología Sistemática del Comité In-
ternacional sobre Taxonomía de Pasteurellaceae y Mi-
croorganismos Relacionados]). Los criterios para la pu-
blicación válida de especies nuevas incluyen:
l. La denominación de nuevas especies.
2. La provisión de la descripción detallada de las carac-
terísticas morfológicas, bioquímicas y genéticas de la
nueva especie propuesta.
3. La designación y caracterización de una cepa vivien-
te o "cepa tipo" de la especié. Esta cepa tipo es envia-
da y depositada en colecciones de cultivos de referen-
cia tipo (p. ej., la American Type Culture Collection
[ATCC] y la National Type Culture Collection
[NTCC]).
Las prioridades para los nombres bacterianos fueron
establecidas entre el 1º de mayo de 1953 y el 1º de ene-
ro de 1980. En esa fecha se publicó ert la IJSB la prime-
ra "Lista de nombres bacterianos aprobados".238 Esta lis-
ta posteriormente fue corregida, actualizada y republica-
da en 1989.239 Cada cuatrimestre, la revista de la IJSB
suele incluir listas de nuevos nombres de especies. Las
descripciones de estas nuevas especies son publicadas en
la IJSB o en otras revistas estadounidenses o de otros
países; sin embargo, se requiere la publicación del nom-
bre de un microorganismo en el IJSB para la validación
del nombre de una especie, sin importar dónde fue publi-
cada la descripción de la especie original. Antes de su
aprobación, los nuevos nombres de las especies se escri-
ben_ entre comillas. \.Los géneros y los nombres de las es-
pecies que aparecen en el IJSB •se pueden cambiar de
acuerdo con las siguientes reglas:
1. Al transferir una especie de un género a otro se man-
tiene el epíteto de la especie (p. ej., Campylobacter
pylori cambió por Helicobacter pylori).
2. Si se encuentra que una cepa tipo pertenece a otro gé-
nero, el género de la cepa tipo se considera nulo.
4 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
3. Si un microorganismo es incluido en dos o más géne-
ros o posee dos o más designaciones específicas, el
nombre del género/especie que contenga a la cepa ti-
po correcta se considera el nombre válido.
El esquema óptimo para la clasificación de bacterias
sería_aquel que sea filogenético, es decir, un esquema que
refleJe las relaciones evolutivas de los microorganismos.
Este tipo de sistema de clasificación sólo ha sido factible
recientemente merced a la aplicación de técnicas mole-
culares y genéticas a las sistemáticas bacterianas. Los
agrupamientos taxonómicos o taxa que originalmente se
basaban sobre las características fenotípicas se están exa-
minando de nuevo con métodos moleculares. Estos mé-
todos incluyen la hibridación de ácidos nucleicos y el
análisis de la secuencia del RNA ribosómico (rRNA)
(se trata más adelante). Con el advenimiento y la expan-
sión de estas técnicas en las sistemáticas bacterianas han
ocurrido cambios taxonómicos significativos y que con-
tinuarán a medida que más microorganismos sean carac-
terizados genotípicamente por estas técnicas. A lo largo
de muchos años de prácticas de laboratorio en microbio-
logía clínica, se han reconocido, publicado y codificado
métodos para una caracterización fenotípica exhaustiva
de microorganismos clínicamente importantes que per-
miten a los laboratorios determinar si un microorganismo
pertenece a una especie dada. La incorporación de esta
información en bases de datos computarizadas para su
utilización en equipos de identificación de bacterias ha
determinado, en muchos casos, la necesidad de organizar
la gran cantidad de datos fenotípicos acumulados. Los
textos de referencia que sirven como compendio para la
descripción fenotípica de los microorganismos incluyen
el Bergey 's Manual of Systematic Bacteriology, consti-
tuido por cuatro volúmenes que contienen información
exhaustiva sobre características fenotípicas, y el Bergey 's
Manual of Systematic Bacterio/ogy, un resumen del an-
terior dispuesto en un volumen único. Los datos -fenotí-
picos que se encuentran en éstos y otros textos de refe-
rencia incluyen la información contenida en los puntos
1 al 8 del recuadro 1-3. La información sobre las carac-
terizaciones genéticas y moleculares de los microorga-
nismos (el punto 9 del recuadro 1-3) espera su inclusión
en nuevas ediciones de estos manuales.
Por el análisis de los microorganismos y la aplicación
de los criterios de identificación enumerados anterior-
mente, los microorganismos pueden ser clasificados den-
tro del marco taxonómico ya descrito y el nombre defini-
tivo del género y la especie pueden ser determinados. La
función primaria del laboratorio de microbiología clínica
es proveer a los médicos de una identificación precisa y
rápida de los microorganismos recuperados de muestras
clínicas y determinar y proveer información acerca de la
susceptibilidad de estos microorganismos a los agentes
antimicrobianos. Los médicos, a su vez, usan esta infor-
mación como una guía para la selección de intervencio-
nes terapéuticas apropiadas, el monitoreo de la respuesta
clínica del paciente y la evaluación del curso clínico.
A fin de brindar al lector suficiente información bási-
ca para la comprensión de los capítulos siguientes que
tratan sobre patógenos bacterianos específicos y las en-
fermedades que ellos causan, la siguiente sección de es-
te capítulo trata acerca de la_ morfo)ogía general, l_a fisio-
logía y los mecanismos de vlrlllencia de las bactenas. Es-
R ECUA DRO ]-3. M l'.TODOS P,\R ,\ LA CARACTER IZAC'IÓN
f)E MICROO RGAN IS~IOS
L. Morfología celular (p. ej., forma de la célula, ta-
maño celular, disposiciones celulares).
2. Características de tinción (p. ej., coloración de
Gram, tinción para ácido-resistencia).
3. Movilidad.
4. Presencia o ausencia de esporas.
5. Características de crecimiento.
a. Velocidad de crecimiento.
b. Morfología de las colonias en el medio de cre-
cimiento.
c. Condiciones atmosféricas óptimas para el cre-
cimiento (p. ej., requerimientos de ox.ígeno,
dióxido de carbono, ambientes aerófilos, etcé-
tera.).
d. Temperatura óptima de crecimiento.
e. Morfología de las colonias en medios selecti-
vos no selectivos y diferenciales.
6. Caract~rísticas bioquímicas (p. ej., formación de
distintos productos bioquímicos finales , produc-
ción de ácidos a partir de distintos carbohidratos,
presencia de ciertas e~zim~s bacterian~s). .
7. Pruebas serológicas, mcluida la detección duec-
ta de antígenos, así como la de~ección serológica
de los anticuerpos formados en respuesta a la in-
fección.
8. Análisis de los productos finales del metabolis-
mo o de componentes estructurales de los mi-
croorganismos por distintos métodos (espectros-
copia, cromatografía gas-líquida, cromatografía
líquida de alta presión). . ,
9. Análisis genéticos •con sondas de ácidos nuclei-
1 • cos y ofras técnicas moleculares (p.-ej.; reac€ión•
··· -''en cadena de la polimerasa). ,. ·
te material provee la información básica necesaria para la
comprensión de los matices en la morfología, las propie-
dades de tinción, el crecimiento y las características me-
tabólicas y bioquímicas de los microorganismos bacte-
rianos que se describen en los capítulos que siguen. A
continuación de esto se presenta una discusión sobre mé-
todos bioquímicos, metabólicos, inmunológicos y sero-
lógicos rápidos utilizados en microbiología clínica. La
última sección de este capítulo trata los nuevos enfoques
genéticos para la detección e identificación de microor-
ganismos, que incluyen la tecnología de sondas para áci-
dos nucleicos y la amplificación de genes (p. ej., la reac-
ción en cadena de la polimerasa). Los capítulos siguien-
tes que tratan sobre bacterias, hongos, virus y protozoos
específicos se ocupan no sólo del enfoque clásico de la-
boratorio para su aislamiento e identificación sino que
también se ocupan de las técnicas más nuevas que están
actualmente en uso o en perspectiva de ser empleadas pa-
ra la detección y caracterización de estos microorganis-
mos y sus propiedades patógenas. La morfología y la fi-
siología básica de hongos, parásitos y virus se presentan
en los capítulos 19, 20 y 21, respectivamente.
Las bacterias son procariotas mientras que los hon-
gos, protozoos y otros organismos son eucariotas. Las
células eucariotas contienen un núcleo con una membra-
 BACTERIOLOGfA BÁSICA 5

CUADRO 1-1 PRO

• PIEDADES DE LAS CE! ULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
_.._:.,j

Características
Células procariotas Células eucariotas
Grupos mayores
Bacterias, algas verde-azuladas Algas, hongos, protozoos, plantas, animales
Pared celular
Contiene peptidoglicanos, lípidos, proteínas Ausente; cuando está presente contiene quitina
o celulosa (plantas verdes)
Estructura nuclear
Membrana nuclear
Ausente Presente
Cromosomas
Ploidia Único, cerrado, circular, DNA de doble cadena Múltiple, lineal, cromosomas
Haploide Diploide, haploide (hongos)
Transcripción/traducción Continuo, con RNA mensajeros de vida corta y
Discontinua, mRNA de vida larga transcripto
formación de polirribosomas (polisomas) en el núcleo y traducido en el citoplasma
Histonas Ausente Presentes
Citoplasma
Ribosomas Presentes; 70S (50S + 30S) Presentes; 80S (60S + 40S)
Mitocondrias Ausentes Presentes
Complejo de Golgi Ausente . Presente
Retículo endoplasmático Ausente Presente
Membrana citoplasmáti- Presente, fosfolípidos, sin esteroles (excepto en Presente; fosfolípidos y esteroles (colesterol, er-
ca especies de Mycoplasma) gosterol)
Triglicéridos Ausentes Presentes
Movilidad Flagelos (simple) Flagelos (complejos); seudópodos; otros órga-
nos locomotores complejos
Generación de energía Asociada a la membrana citoplasmática Mitocondrias
Reproducción sexual Ausente (innecesaria) Presente (puede alternar con ciclos reproducti-
vos asexuales)

Recombinación/intercam- Intercambio cromosómico o de plásmidos vía Cigota diploide formada a partir de células ger-
bio génico transformación, transducción o conjugación minales haploides; la meiosis da como resul-
tado la recombinación genética

na nuclear que encierra múltiples cromosomas, mientras
que las células procariotas tienen un solo cromosoma que
no está encerrado en una membrana nuclear. Las células
eucariotas también poseen una variedad de organelas
subcelulares con funciones especializadas, como mito-
condrias (sitios donde se desarrolla la respiración aeróbi-
ca) y cloroplastos (sitios donde se realiza la fotosíntesis
en las plantas verdes). De hecho, estas organelas subce-
lulares probablemente hayan evolucionado a partir de
microorganismos procariotas que entraron en las células
eucariotas y hayan desarrollado con éstas relaciones sim-
bióticas a lo largo del tiempo con .pérdida de las funcio-
nes metabólicas asociadas con su existencia autónoma y
desarrollo de rasgos o atributos que beneficiaron al mi-
croorganismo "huésped". Como se describe brevemente
en el cuadro 1-1 , las células procariotas y eucariotas di-
fieren sustancialmente en muchas otras características.
ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA BACTERIANAS
BÁSICAS
TAMAÑO Y FORMA DE LAS BACTERIAS
Las células bacterianas tienen una gran variedad de
formas y tamaños. Por lo general, tienen 0,2 a 2 µm de
diámetro y I a 6 µm de largo. Existen cuatro morfologías
básicas para la bacterias: células esféricas o cocos, célu-
las con forma de bastón o ·tmcilus, cdulas con forma de
e s ¡ i i i ' l l t 1 J e ~ 1 ma de coma llamadas
vibriones. La disposición de los cocos en pares, cadenas
o racimos define a grupos de microorganismos que se de-
nominan, respectivamente, diplococos, estreptococos y
estafilococos (fig. 1-1 ). Los microorganismos con forma
de bastón pueden ser de morfología regular, más cortos
(cocobacilares) o tener alguno de sus extremos ensan-
chado (corineformes). Las células con forma de coma
definen una característica básica de ciertas especies
(p. ej. , especies de Vibrio). Lo mismo es válido para cier-
tas bacterias con forma de espiral (p. ej., especies de
Campy/obacter, Borrelia y Treponema), en las que la for-
ma espiralada puede ser laxa (alrededor de cuatro vueltas
por microorganismo) o más apretada (entre 14 y 20 vuel-
tas por microorganismo) . Además de su tamaño, forma y
disposición celular, otro criterio de diferenciación de las
bacterias se basa sobre sus características de tinción con
la coloración de Gram. on esta técnica de tinción, la
mayor parte de las bacterias pue en ser clasiñcaclas co-
mo grampositivas o gramnegativas. La coloración de
Gram diferencia a las bacterias sobre la base de la estruc-
tura de la pared celular y se trata más adelante en este ca-
pítulo y nuevamente en el capítulo 2. La estructura gene-
 6 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
o o
o oD
o o o
o ººoº
Cocos Estafilococos
o~ ººa
oº
ºº Bacilos Cocobacilos
¡J
Espirilos Espirilo de tipo
Borrelia
Fig. 1-1. Morfología básica de distintas bacterias.
ral de una célula bacteriana (grampositiva y gramnegati-
va) se representa en la figura 1-2.
ESTRUCTURA NUCLEAR, REPLICACIÓN DEL DNA,
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN
Las características hereditarias de todos los organis-
mos vivientes están determinadas por la estructura de su
material genético. El material genético de una célula in-
dividual está compuesto por ácido desoxirribonucleico
(DNA) organizado en uno o en múltiples cromosomas.
Colectivamente, el material genético es nombrado como
el genoma del organismo. En los organismos procario-
tas, el genoma está constituido por un único cromosoma
circular de DNA de cadena doble cerrado de manera co-
valente (dsDNA). El cromosoma circular, denominado
nucleoide, no se encuentra unido a la membrana, pero se
encuentra libre en el citoplasma en una porción central
aislada de la célula bacteriana. El DNA celular bacteria-
no mide de 300 a 1.400 µm de largo y se presenta en la
célula superenrollado (es decir, la molécula de cadena
doble está enrollada sobre sí misma como una banda
elástica entrelazada). Los genes individuales se encuen-
tran ordenados linealínente sobre el cromosoma. El nu-
cleoide representa alrededor del 10% del volumen celu-
lar aunque el DNA es sólo el 2 al 3% del peso seco de la
célula. En Escherichia coli, ~ cromosoma contiene aire,
dedor de 5 x 106 pares de bases, y su longitud es unas
1.000 veces la longitud de la célula bacteriana en la que
está contenido. A diferencia de procesos similares en cé-
lulas eucariotas, la replicación y la transcripción del
DNA a ácido ribonucleico mensajero (mRNA) se produ-
V
Estreptococos
Diplococos
(? ))
i],~
G
(?
Vibriones
(j fl
Bacilos corineiformes
' Espirilo de tipo
Treponema
Espirilo de tipo
Leptospira
ce continuamente. El cromosoma también parece. estar
unido al lado interno de la membrana celular en ciertos
puntos. En los organismos eucariotas, el material genéti-
co se encuentra organizado en varios cromosomas dentro
del núcleo. Los cromosomas se encuentran, a su vez, aso-
ciados con diversas proteínas básicas llamadas histonas,
que ayudan a estabilizar !ª estructur~ del cr~mosoma.
Los cromosomas de organismos eucanotas estan separa-
dos del resto del material celular por una membrana nu-
clear, que está compuesta por una bicapa lipídica, que es
similar en composición a la membrana celular. La mem-
brana nuclear también posee poros, que permiten el pa-
saje de pequeñas moléculas hacia adentro del núcleo o
hacia afuera.
Los ácidos nucleicos de toda bacteria, al igual que los
de otros microorganismos, están compuestos de polinu-
cleótidos (polímeros de nucleótidos) que constan de los
siguientes tres elementos (fig. 1-3): l) un azúcar cíclico
de 5 carbonos (ribosa en el RNA, desoxirribosa en el
DNA), 2) una base purina (adenina, guanina) o pirinúdi-
na (citosina, timina, uracilo) unida al carbono l' de la
pentosa por una unión N-glucosídica y 3) un grupo fos-
fato (PO 3) unido al carbono 5' de la pentosa por un enla-
ce fosfodiéster. Las partes con desoxirribosa están unidas
mediante la alte_m ancia de grupos fosfato para formar
~na _cadena que tiene las características de una espiral he-
hc~1dal, con las bases dirigidas hacia el eje central de la
espiral. La estructura descrita constituye un ácido nuclei-
co de cadena simple (ssDNA).
La estructura de doble hélice del DNA, específicamen-
te, resu_lta de I_a !nteracci~n entre dos filamentos comple-
mentar10s de ac1do nucleico. La complementariedad está

Peptidoglicano
de la pared Cápsula
celular Mesosoma
1
Ribosomas t""----iH+----"c:=--)
Flagelo Membrana Proteínas de
citoplasmática superficie
Grampositiva
~ig. l-2. S~c.ción transversal de una célula bacteriana en general. La mitad izquierda de esta figura representa la estructura de una bacte-
ria grampos1tiva; la mitad derecha muestra la estructura de una bacteria gramnegativa.
asociada con la-secuencia de bases de una cadena simple
Y los puentes de hidrógeno que se producen entre bases
específicas de la cadena complementaria (fig. 1-4). Las
bases purina son la adenina (A) y la guanina (G) y las ba-
ses pirimidina son la citosina (C), la timina (T) y el ura-
cilo (U). La purina adenina se unirá específicamente só-
lo con la base pirimidina timina, la purina guanosina se
unirá específicamente con la pirimidina citosina. Las ca-
denas antiparalelas del ssDNA permanecen unidas por
tres puentes de hidrógeno entre C y G y por dos puentes
de hidrógeno entre A y T (véase fig. 1-4). El DNA nati-
vo existe en la forma helicoidal de cadena doble mientras
que el RNA existe primariamente en la forma de cadena
simple como RNA mensajero (mRNA) y parcialmente
en formas de cadena doble como moléculas de RNA ri-
bosómico (rRNA) y RNA de transferencia (tRNA). En
todas las especies de RNA , el uracilo está presente en lu-
gar de la timina (véase fig. 1-3).
La secuencias de bases purina y pirimidina en el DNA
constituyen el código genético, con codones específicos
(secuencias de tres pares de bases) que codifican para
aminoácidos específicos. El mRNA de cadena simple es
sintetizado a partir de dsDNA durante el proceso de
transcripción por una RNA polimerasa DNA-depen-
diente, en la que una cadena complementaria de mRNA
es sintetizada con el filamento de DNA de sentido posi-
tivo como molde. Durante el proceso de traducción, el
mRNA es "decodificado" en asociación con muchos ri-
bosomas en un complejo mRNA-polisoma, donde ocu-
rre el apareamiento de bases del codón y el anticodón a
través de moléculas de RNA de transferencia (tRNA).
Las moléculas de RNA de transferencia llevan (os antico-
dones específicos a los codo~es correspondientes del
mRNA y también acarrean, urudos covalentemente, los
minoácidos correspondientes. De este modo, el código
:enético presente en el DNA es traducido en moléculas
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 7
Cápsula
Septo de Membrana externa (ME)
división
Capa de peptidoglicanos
W t--,--f~H /- Cuerpo de
inclusión
Flagelo
Gramnegativa
de proteínas "estructurales" y enzimáticas, que a su vez
catalizarán la síntesis y degradación del resto de los com-
ponentes celulares. La síntesis de nuevas moléculas de
DNA, denominada replicación, ocurre merced al desen-
rollamiento y apertura de la molécula de dsDNA por la
enzima DNA girasa y la síntesis de una cadena comple-
mentaria de DNA a partir de una DNA polimerasa
DNA-dependiente. Cada nueva molécula de dsDNA
contiene una de las cadenas del DNA parental. La rela-
ción entre la replicación del DNA, la transcripción del
RNA y la traducción del código genético en polipéptidos
se resumen en la figura 1-5.
Debido a que la secuencia de nucleótidos es única pa-
ra cada especie individual de microorganismo, el análisis
de la relación del ácido nucleico entre microbios se ha
transformado en un arma poderosa para los taxónomos.
El dsDNA puede ser separado en las dos cadenas que lo
constituyen por aplicación de calor o concentración sali-
na alta. Por enfriamiento y por disminución de la concen-
tración salina, las dos cadenas se vuelven a asociar o hi-
bridar en la forma de cadena doble por apareamiento es-
pecífico de bases. El punto hasta el cual dos cadenas de
DNA se ensamblan nuevamente una con la otra es una
medida indirecta de su relación y puede ser usada para
determinar si dos microorganismos son miembros de la
misma especie. A nivel genético, las especies pueden ser
definidas como cepas de bacterias que exhiben una rela-
ción mayor del 70% entre sus DNA y un 5% o menos de
divergencia en sus secuencias de nucleótidos. 275 Aunque
estos criterios resultan útiles para la mayoría de los mi-
croorganismos, algunas especies bacterianas tienen más
del 70% de relación entre sus DNA, y a pesar de ello aún
se consideran especies distintas debido a su significancia
clínica. Por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria
meningitidis son virtualmente idénticas cuando son ana-
lizadas por hibridación de ácido nucleico, pero las dos
8 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

Fig. t-3. Estructura molecular de los polinucleóti-

[s~ dos y de las bases del ácido nucle,~o. Los polinu-
cleótidos consisten de un azúcar cíclico de 5 carbo-
N /O'-.,__ H H
nos (ribosa o desoxirribosa), una b~ e puno? o piri-
,-----+! / '-.,__ 1 1

~\J~
cLc5-o- P-OH midina unida al átomo de carbono I del azucar por
, e,
:' b~¡el - eª1/~
un unión N-glucosídica y un grupo fosfato unido al
carbono 5' del azúcar por un enlace fosfodi éster.
Enlace También se muestra la estructura d~ las dos purinas
N-glucosídico ¡ 2
Unión (adenina y guanina) y de las tres pmm1dmas (citosi-
:· : fosfodiéster na, timina y uracilo).
'f OH

H para DNA
OH para RNA
y
Azúcar

NH2
1
C
N::::, '-c.,- N '-
1 11 C-H
e, r., /
H/ ~N/- N
\
H
Adenina Guanina

H CH2 H
1
1 o 1

H,~'-.,,C-NH
11
2
H, 7~ -1/'
e e
1 1
H
'-?-7 "?7'
C O

N N N N
H"¾c.,,-N H.,,- '--e/ '--H H.,,- '--e;" '-H
11 11
o o
11
o
Cltoslna Timina Uracilo

especies causan entidades clínicas diferentes, la enferme-
dad transmitida sexualmente llamada gonorrea y la me-
ningitis cerebrospinal epidémica/endémica, respectiva-
mente.
Otra aplicación de la tecnología del ácido nucleico a la
taxonomía microbiana es el análisis de secuencias de
RNA ribosómico (rRNA). Las secuencias de nucleóti-
dos de las especies de RNA de cadena simple que se in-
corporan en las subunidades de los ribosomas bacteria-
nos pueden ser utilizadas para asegurar la relación de pa-
rentesco entre microorganismos, ya que en especies indi-
viduales estas secuencias han sido muy conservadas (es
decir, no han sido alteradas po_r mutaciones) durante la
evolución. Las mutaciones en estas secuencias altamente
conservadas generalmente son letales y los microorga-
nismos que poseen esas mutaciones no sobreviven ni se
propagan. Por el examen de la secuencia de nucleótidos
del rRNA 16S se pueden asegurar las relaciones filoge-
néticas y la evolución de los microorganismos a partir de
ancestros comunes. El análisis de las secuencias de RNA
ribosómico es muy útil principalmente para determinar
la relación entre los microorganismos por encima del ni-
vel de género, aunque esta técnica también ha sido utili-
zada también para validar las diferencias fenotípicas
existentes entre especies y géneros muy relacionados.
Estudios de secuenciación de las moléculas de RNA ri-
bosómico han revelado también secuencias que son úni-
cas para especies individuales. Dado que estas secuen-
cias únicas de RNA también están altamente conservadas
y que existen múltiples copias en los ribosomas de una
célula bacteriana, oligonucleótidos sintéticos capaces de
hibridar con estas secuencias únicas pueden ser utiliza-
dos para detectar e identificar bacterias. Una aproxima-
ción de este tipo es la base de la tecnología de las sondas
de ácido nucleico para la detección directa de microorga-
nismos en muestras clínicas. Estas sondas también se
pueden aplicar a microorganismos recuperados en me-
dios de cultivo como un método para la identificación o
pueden ser usadas para detectar secuencias únicas direc-
tamente en las muestras clínicas. La tecnología de las
sondas de ácido nucleico y sus aplicaciones en microbio-
logía clínica se discuten más adelante en este capítulo.
CITOeLASMA
El citoplasma es un gel amorfo que contiene enzimas,
iones, organelas subcelulares que cumplen diversas fun-
ciones y una gran variedad de gránulos, muchos de los
cuales constitúyen reservas de alimento y energía. Las
enzimas citoplasmáticas de células procariotas funcionan
en procesos anabólicos y catabólicos y muchas de ellas
están relacionadas con la cara interna de la membrana
(véase más adelante). Las células procariotas carecen de
organelas subcelulares unidas a la membrana, mientras
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 9

que las células eucar·10t .

tructuras sube as ~ontienen una variedad de es-
1 1
doplasmático e~ ~rs (p. eJ ., IIlltocondrias o retículo en-
d
. mento
t
nas constit • e c. co!llpuestas o rodeadas por membra-
nes intrac
~t as por bi~apas fosfolipídicas . Las inclusio-
Iar~s O gra?~los representan reservas de ali-
. (pd sacandos, hp1dos o polifosfatos). El número
Y e ¡ tipo e ºoránulos de a1macenam1ento
d. . , con el me-
vana
(º Y el ~stªdo funcional de las células El glucógeno es
. be ma!enal de almacenamiento más i~portante de las
actenas
. entér1·cas IIllentras
· . de Ba-
que algunas especies
cillus Y de Pseudomonas acumulan un 30% o más de su
peso seco en poli-~-hidroxibutirato. Los polímeros de al-
to peso mole~ular como el polihexametafosfato conocí- -
dos como gran~los metacromáticos o volutina se pro-
d_ucen en esp~c1es de Corynebacterium, en Yersinia pes-
·tls _Y en especies de Mycobacteria . Esos gránulos de vo-
1~:ma se ven de color rojo rosáceo cuando las células se
tmen con azul de metileno .
. Tanto los microorganismos procariotas como los euca-
nota~ ~lbergan una gran cantidad de ribosomas, que son
los s1t10s de-síntesis de proteínas. En los microorganis-
mos procariotas los ribosomas son 70S· en los eucario-
tas, los ribosomas son SOS. La "S" se refiere a las unida-
des Svedburg, que son una medida indirecta del tamaño
de los ribosomas determinado en función de la tasa de se-
dimentación obtenida cuando son sometidos a la fuerza
centrífuga. El ácido ribonucleico ribosómico (rRNA)
comprende el 80% de la totalidad del RNA celular. El ri-
bosoma bacteriano 70S posee un peso molecular de alre-
dedor de 800.000 daltons y existe en un estado disociado
como dos subunidades denominadas 30S y SOS. La sub-
unidad 30S contiene RNA 16S, mientras que la subuni-
t
Fig. 1-4. En la molécula de DNA, las dos cadenas de polinucleó-
dad SOS contiene tanto RNA 23S como SS; ambas subu- tidos de la doble hélice de DNA son "antiparalelas", es decir, el ex-
nidades también contienen varias especies de proteínas tremo 3'-0H de una cadena es adyacente al extremo 5'-P de la ca-
ribosómicas específicas. El 20% restante del RNA celu- dena complementaria. Las bases, que se encuentran dirigidas hacia
lar se encuentra como ácido ribonucleico de transfe- el eje central de la hélice, unen las dos cadenas polinucleótido me-
rencia (tRNA) y ácido ribonucleico mensajero (mR- diante uniones puente de hidrógeno, las cuales son relativamente
débiles. La adenina se aparea con la timina a través de dos puentes
NA). Cuando forman un complejo con el mRNA trans-
de hidrógeno,, mientras que la citosina se aparea con la guanina a
cripto, las subunidades ribosómicas SOS y 30S forman el través de tres puentes de hidrógeno. Estas fuerzas interactivas en-
ribosoma intacto 70S que se encuentra en las células bac- tre las cadenas de polinuFleótidos pueden ser vencidas por energía
terianas. Los agregados de mRNA y ribosomas denomi- térmica (calor) o por una fuerte alcalinidad en su proceso de des-
nados polirribosomas o polisomas contienen todos los naturalización.
componéntes del sistema de síntesis de proteínas; los po-
Iisomas son esencialmente cadenas de ribosomas 70S
(monómeros) unidos al RNA mensajero (mRNA). Histo-
nas o proteínas similares a las histonas que estabilizan cionadas con la virulencia bacteriana, que incluyen genes
para la resistencia antirnicrobiana, adhesinas relaciona-
los polipéptidos nacientes que son sintetizados por los
das con la virulencia, producción de toxinas y resistencia
polisomas, sólo recientemente han sido encontradas en
a iones de metales pesados. Algunas bacterias también
pequeñas cantidades en asociación con el DNA de Es-
pueden poseer transposones, que son secuencias de
cherichia coli mientras que la presencia de proteínas po-
DNA capaces de "saltar" de un lugar a otro en el genoma
!iamínicas (p. ej., putrescina y espermidina) en asocia-
bacteriano. 161 Las secuencias transponibles pueden ser
ción con el DNA bacteriano es bien conocida.
Un DNA extracromosómico se encuentra frecuente- cromosómicas o derivadas de plásmidos.
mente presente en el citoplasma de microorganismos
procariotas en la forma de plásmidos. Los plásmidos MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
existen como círculos de ssDNA cerrados covalentemen-
te. En general no se encuentran en los microorganismos El citoplasma de todas las células bacterianas está ro-
eucariotas si bien algunas organelas subcelulares de los deado por una membrana citoplasmática. La membrana
microorganismos eucariotas (p. ej., mitocondrias) contie- citoplasmática bacteriana se encuentra inmediatament~
nen moléculas de DNA que semejan plásmidos bacteria- por dentro de la capa de peptidoglicanos de la pared ce-
nos. Los plásrnidos son capaces de una replicación autó- lular en las bacterias grampositivas y adyacente al espa-
noma y son heredados por las células de la progenie bac- cio periplasmático en las bacterias grarnnegativas (se tra-
ta más adelante). La membrana citoplasmática tiene la
teriana. Los plásrnidos pueden contener información ge-
nética para una variedad de estructuras o funciones rela- estructura básica de una bicapa fosfolipídica en la cual se
 10 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

oDNA
1Replicación 1

Transcripción

i/
Aminoácidos (aa)

1 ATP (eae,gfa)

ORNA VMfas ea,fm~

Aminoacil
tRNA

Iniciación
mRNA 1111111111 ti 111 de la síntesis
de proteínas
Polisoma

/ lTraducción Elongación de la cadena

peptídica (factores de
elongación)

ggg l
Terminación de la
Ribosomas síntesis de proteínas
Complejos
con proteínas l
ribosómicas .....__ Plegamiento del péptido_para
......-- adquirir su conformación
secundaria y terciaria

Proteína
nativa
Fig. 1-5. Replicación, transcripción y traducción del código genético en microorg~smos procariotas. El DNA es replicado por una poli-
merasa DNA dependiente para producir dos moléculas de DNA de cadena doblea (dsDNA). El código genético en el dsDNA es copiado
para producir un RNA de cadena simple (ssRNA) llamado RNA mensajero (mRNA) durante el proceso de transcripción. El RNA de trans-
ferencia (tRNA) y el RNA ribos.ómico (rRNA) también son transcriptos. El rRNA forma un complejo con proteínas específicas para for-
mar parte de la estruc;:tura <;!el ribosoma. El m~A forma un complejo con los ribosomas para formar polisomas, que son los sitios de sín-
tesis de proteínas. En el polisoma, codones específicos para aminoácidos individuales son reconocidos por anticodones en moléculas de
tRNA por apareamiento de bases esI?ecífico. Codones específicos se corresponden con diferentes aminoácidos unidos a la molécula de ami-
npacil tRNA. Durante el estado de traducción, se inicia la síntesis de proteínas, se elongan las cadenas de polipéptidos y la síntesis conclu-
ye con la liberación de una molécula de proteína.

encuentran incluidas varias proteínas. La membrana está
compuesta en peso por un 30% a un 60% de fosfolípidos
y por un 50% a un 70% de proteínas. La mayoría de las
membranas de las células bacterianas contienen fosfati-
dilglicerol, fosfatidiletanolamina y difosfatidilglicerol;
no contienen esteroles (p. ej., colesterol o ergosterol).
Las únicas excepciones procariotas a esto son los mico-
plasmas y los ureaplasmas, que incorporan esteroles del
medio de crecimiento a sus membranas celulares. Los
ácidos grasos que componen la porci?n lipídi~a _de la bi-
capa fosfolipídica generalmente estan const1tu1dos por
ueleto de 15 a 18 átomos de carbono y suelen en-
un esq . . t d
con trarse Satu rados O monomsa ura os. · d.
La membrana celular de ]os procanotas posee 1versas
.
fun c10nes que son relegadas a organelas subcelulares es-
pecial.izadas en los microorganismos eucariotas. La
membrana celular bacteriana contiene enzimas que ac-
túan en la respiración celular y en la fosforilación oxida-
tiva, la biosíntesis de peptidoglicanos y en la biosíntesis
de la membrana externa en las bacterias gramnegativas.
La membrana celular también actúa en la síntesis y se-
creción de enzimas y toxinas bacterianas. La membrana
citoplasmática brinda una barrera aislante a través de la
cual se puede generar un gradiente de energía o potencial
d,e n_ieI?brana, energía que puede ser utilizada para el
movmuento flagelar, la movilización cromosómica, etc.
La membrana también retiene metabolitos y excluye
compuestos externos. Las proteínas de la membrana ci-
~oplasmática se encuentran principalmente involucradas
en el transporte de electrones y la fosforilación oxidati-
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 11

O
va, la biosíntesis de l'1 1·d . , . CH 20H
constituye t d P os complejos, la smtes1s de los
DNA 1' e 1a pared celular y la replicación del
orte · ~m ien se encuentran involucradas en el trans-
p , ac vo de materiaJes hacia el citoplasma. Estas pro- 'o o--J
temas transportado , H
ras especificas asociadas a la mem-
b rana se denorni
. . . nan permeasas. Los mesosomas, que
son l~vagmaciones de la membrana citoplasmática que NHCOCH 3
se ext~e nd en en el citopoplasma, pueden aumentar la su-
perficie d~ _la membrana disponible para enzimas celula-
N-acetilglucosamina I Ácido N-acetilmurámico
res catab~hcas Y anabólicas. Pueden funcionar también HC CH 3
en la rephcac!ón del DNA y en la separación de dúplex 1
de DNA en celulas en crecimiento activo. ___________________________ t____________________________ _
C=O

N-H
pAREDES CELULARES BACTERIANAS
L-alanina 1
(L-Ala) H3C-C -C =0
La pared celular bacteriana brinda rigidez estructural,
confiere la_ forma a la célula y crea una barrera física con- -------------------------- --~--------------------------
tra el ambiente externo. El componente rígido de la pa-
H-N
red ~elula_r de todas las bacterias está constituida por Ácido
º~ e-e -
peptidoghcanos. Los peptidoglicanos se encuentran en D-glutámico
1
(CH l - e =o
todas las .especies de bacterias excepto en los ureaplas-
mas Y m1c~plasmas, ya que carecen de pared. Esta es- ~~~~~~~----------------~~~--_A------~~--~--------------
tructura esta compuesta por un esqueleto de residuos de Ácido H N-H
carbohidratos formados por unidades aJternadas de D,L-diamino- º<::::- 1 1
N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos pimélico C-C-(CH2Ja-C-C =O
(meso DAP) HO/ 1 1
por enlaces ~-1,4 (fig. 1-6). Tetrapéptidos cortos, com-
puestos generaJmente por cadenas cortas e idénticas de -------------------------------~~.!'.-------+-------------
aminoácidos o y L, se encuentran unidos a los residuos . N-H
de ácido N-acetilmurámico por medio de una unión pep- D-Alanina 1
(D-Ala) O =C-C-CH 3
tídica al grupo lactilo del C 3. Estas cadenas cortas contie-
nen aminoácidos diferentes que no se encuentran gene-
ralmente en las proteínas, que incluyen isómeros o de ---------------------------------------~--¿-------------N- H
ácido glutámico y alanina (bacterias grampositivas) y Unidad puente 1
ácido meso-diarninopimélico (bacterias gramnegativas). de unión cruz¡¡.da R
Algunos de estos tetrapéptidos están a su vez unidos
unos con otros por péptidos cortos y forman entrecruza-
Fig. 1-6. Estructura de la unidad repetitiva del peptidoglicano de
mientos entre cadenas adyacentes de peptidoglicanos Escherichia coli.
(fig. 1-7 A). Los tipos de aminoácidos encontrados y los
grados de entrecruzamiento son componentes variables
de la estructura del peptidoglicano. Por ejemplo, en
$taphylococcus aureus, la mayor parte de los residuos des de ribitol (5 carbonos) o de glicerol (3 carbonos)
qel ácido N-acetilmurámico está entrecruzado a cadenas unidos por enlaces fosfodiéster (fig. 1-9). Los ácidos ri-
adyacentes de peptidoglicanos por cinco resid[!OS de gli- b/tol teicoicos están asociados con la pared celular,
cina, que brindan de este modo una estructura aJgo apre- mientras que los ácidos glicerol teicoicos se encuentran
tada de pared rígiqa (véase fig. 1-7 A) En las bacterias asociados con la cara interior de la membrana de la célu-
gramnegativas ,(p. ej., Escherichia coli), el entrecruza- la bacteriana. Los ácidos ribitol teicoicos están unidos
miento ocurre directamente entre el ácido meso-diamino- covalentemente al peptidoglicano por el del grupo hidro-
pimélic,o de una "cadena" de peptidqglicano y el r,esiduo xilo del C6 del ácido N-acetilmurámico; los ácidos glice-
de o-alanina terminal de una cadena adyacente (véase rol teicoicos están unidos a los glucolípidos de la mem-
fig. 1-78). Este entrecruzamiento determi_na si una es- brana citoplasmática. Las últimas moléculas se denomi-
tructura de par_ed celular se denomina "rígida" (alto en- nan ácidos lipoteicoicos. Están unidos a la capa externa
trecruzamiento) o "laxa." de la membrana celular y se extienden dentro de la pared
celular. Los ácidos teicoicos de diferentes bacterias se
PARED CELULAR DE LAS BACTERJ_A.S GRAMPOSITIVAS encuentran aun más modificados por el agregado de gru-
pos "R" que incluyen residuos de o-alanina o o-lisina
La pared celular de las bacterias grampositivas (fig. unidas por enlaces éster o glucosas, gaJactosas o N-ace-
J-8A) tiene un grosor _de casi 80 nm y está compuesta tilglucosaminas unidas por enlaces del tipo O-glucósido.
principalmente de varias capas de peptidoglicano; de he- Los ácidos teicoicos estabilizan la pared celular, mantie-
cho des~ el 40% hasta más del 80% del peso seco de aJ- nen la asociación de la pared con la membrana celular,
gun~ p~edes celulares grampositivas estáp. constit~idas quelan pequeños iones necesarios para el funcionamien-
por peptidoglicanos. Atrapadas dentr~ de esta matn; de to y la integridad de la pared celular y participan en la in-
peptidoglicanos se en_cuentra? una vaneda~ de pro!e1_nas, teracción celular y la adherencia a mucosas u otras super-
polisacáridos y molecu~as . umcas den~mmadas ac1_dos ficies. Los ácidos teicoicos también pueden tener una
teicoicos. Los ácidos te1co1cos son pohmeros de umda- función en la síntesis de peptidoglicanos y en la forma-
12 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Fig. 1- 7. Estructura del
A Peptldogllcano de Staphylococcus sureus / pepúdoglicano de Sraphy-
, /ococcus aureus (A) y Es-

--
/
" /,'/ c/1erichia coli (B).
M~;~Ac /
1 /
--(Gly)s L-'Al a GlcNAc

~~Y)s~:.H,
o-Glu-NH 2 /

GlcNAc
::t:__
__ / GlcNAc
L-Lys
1
o-Ala
1

/4
o-Ala
(Gly) 5 1
-Glu-NH 2
'
/
MurNAc
GlcNAc L-Lys 1
/ 1 L-Ala
/ o-Ala - (Gly) 5 1
/ o-Glu-NH 2
1

GlcNAc L-,Lys
// D·Ala
/ ......
(Gly) 8
'
Abreviaturas: GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, ácido N-acetilmurámico;
Ala, alanina; Glu-NH,, isoglutamina; Lys, lisina y Gly, glicina.

B Peptldoglicano de Escherlchla col/

MurNAc
/
/ L-lla-o-Glu-meso-DAP-o-Ala
GlcNAc /
M GlcNAc

/
1r e
L-Ala-o-Glu-meso-DAP-o-fla /Mur~Ac
· /

GlcNAc o-Ala-meso-DAP-o-Glu-L-Ala
/ GlcNAc
./
MurNAc
/ 1
L-Ala-o-Glu-meso-DAP-o-Ala

Abreviaturas: Véase arriba; también, Glu, glutamato; y DAP, diaminopimelato.

ción de septos durante el crecimiento y la reproducción y
pueden desempeñar también un papel en la capacidad de
transformación de algunas bacterias grampositivas
(p. ej., neumococos). En algunos microorganismos, los
ácidos teicoicos son antigénicos y forman la base del
agrupamiento antigénico (p. ej., el antígeno del grupo D
en el grupo D de estreptococos y en los miembros del gé-
nero Enterococcus) . El polisacárido C que se encuentra
en las paredes celulares de Streptococcus pneumoniae es
un ácido lipoteicoico complejo compuesto de ribitol y
fosfatos sustituido en varios puntos con N-acetil-D-ga-
lactosamina, o-glucosa, N-acetil-2,4-diamino-2,4,6-tri-
desoxihexosa por medio de uniones O-glucosídicas o con
colina unida por enlaces diéster.
En los grupos de bacterias patógenas grampositivas
pueden estar presentes otras estructuras de pared celular
que son determinantes importante_s de virulenci~. Por
ejemplo, la proteína M, un reconocido factor de Vlflllen-
cia de los estreptococos ~-hemolíticos del grupo A, se
encuentra asociada con los ácidos lipoteicoicos en la pa-
red celular de los estreptococos y se extiende fuera de la
pared como una proteína fimbrial (véase cap. 12). La es-
tructura de la pared celular grampositiva está representa-
da gráficamente en la figura l-8A.
PARED CELULAR DE LAS BAC"(ERIAS
GRAMNEGATIVAS
La pared celular de las bacterias grarnnegativas (véase
fig. 1-88) es más delgada que la de las bacterias grampo-
sitivas pero estructuralmente es más compleja. Por fuera
de la membrana citoplasmática se encuentra el espacio
periplasmático, un compartimiento que contiene enzi-
mas y que se encuentra entre la membrana citoplasmáti-
ca y!ªpo~ción exterior de la pared celular. Una capa de
peptidoghcano de una sola unidad de espesor forma el
 BACTERIOLOGIA BÁSICA 13

Fig. 1-8. Estructura de la d

lar de ba . pare celu-
c~enas grampositivas (A) Polisacáridos específicos
gramnegauvas (B). KDO, cetodesoi de la pared celular
octulonato; LPS, Iipopolisacárido.

Ácido teicoico de - - - - 4 - - - - - f
la pared celular
Ácido lipoteicoico ----4L-+.¡........,.j
de membrana

Peptidoglicano

Membrana {
citoplasmática

A Gramposltlvo

----Antígeno O

L - J - - - - Centro
LPS

Lípido A
µ.L-"--!..L..I!-- Proteína porina

"'---~-Lipoproteína

~ o
C>-<::)-.8-E:g~e>-f::H3-tH'.==3---f- Proteína OMP A

r
Periplasma

~ oul 'tt9' }
i ~ : l¿itoplasmática
::::::::ano

Fosfolípidos
Proteína
B Gramnegatlvo

borde externo del espacio periplasmático. Como los pep-
tidoglicanos se disponen en una monocapa, el entrecru-
zamiento sólo ocurre entre filamentos adyacentes de pep-
tidoglicanos en lugar de hacerlo entre capas de pep~ido-
glicanos más profundas o más externas a la superficie de
la célula. Los entrecruzamientos están formados por la
unión del grupo carboxilo del residuo terminal de o-ala-
nina en una cadena con el aminoácido libre del residuo
de ácido diaminopimélico en la cadena adyacente (véase
fig. 1-7B ). La capa de peptido~licanos. de }as bacterias
gramnegativas es bastante laxa , es decir, solo alrededor
de la mitad de las cadenas peptídicas que pueden unirse
a residuos de ácido N-acetilmurámicos están realmente
entrecruzadas. Fuera de la delgada capa de peptidoglica-
no se encuentra la membrana externa. Esta membrana
externa tiene una estructura básica que es similar a la de
la membrana citoplasmática, es decir, una bicapa fosfoli-
pídica en la que algunas moléculas grandes se encuentran
incluidas. La membrana externa está fijada a la capa de
peptidoglicano por una Upoproteína pequeña y fuerte-
mente lipofílica que se une al grupo amino del ácido dia-
minopimélico en el peptidoglicano y se extiende a través
 14 DIAGNÓSTlCO MICROBIOLÓGICO
o terales 0-esi:J~s
l[/O-CH 2 o
p 1 11 O-CH2
,
/1 RO-CH
1
p/
,, j RO-CH
1 o
ORO-CH
/ 1
o o- H c-o/1
1 2
RO-CH 11 ,
1 p/
H,C-0/1
O-
Ácido teicolco Ácido telcolco
de tipo glicerol
de tipo rlbltol
Fig. 1-9. Estructura de ácidos teicoicos de bacterias grampositi-
vas. A la izquierda se muestra el á~ido ribitol teicoico; a la derecha
se muestra el ácido glicerol teicoico. Sustituciones del grupo "R"
pueden incluir o-alanina unida por uniones éster o D-iisina u o-glu-
cósidos unidos a glucosa, galactosa o N-acetilglucosamina.
del espacio periplasmático como una estructura a-heli-
coidal. El otro extremo de esta lipoproteína está incluido
en la estructura lipídica de la membrana externa.
Un componente estructural que es único a la membra-
na externa de las bacterias grarnnegativas es el lipopoli-
sacárido (LPS) (fig. 1-lOA). Las moléculas de los LPS
son los determinantes antigénicos de superficie más im-
portantes (llamados somáticos o antígenos 0) de las
bacterias gramnegativas y son responsables de la activi-
dad de endotoxina de las células gramnegativas. Las
moléculas de los LPS son glucolípidos complejos com-
puestos por una porción lipídica llamada lípido A, la re-
gión del centro o core polisacárido que en general es si-
milar en estructura dentro de un género o una especie da-
dos de bacterias y cadenas laterales O-específicas, que
son regiones de estructura bioquímica variable que con-
fieren una entidad serológica única a las especies de bac-
terias gramnegativas. La porción conocida como lípido A
del LPS está incluida en la hoja externa de la mernbr~a
externa, con el centro polisacárido y las cadenas O-espe-
cíficas que se proyectan desde la superficie de la mem-
brana externa corno si fueran escobillas o bigotes. Cada
especie de Salmonella, por ejemplo, tiene cadenas latera-
les O-específicas que brindan un criterio valioso para la
identificación de microorganismos en el laboratorio clí-
nico. La estructura del LPS ha sido estudiada más exten-
samente en especies de Salmonella y Escherichia coli.
El lípido A está compuesto por un disacárido de glu-
cosamina en el cual los grupos hidroxilo están esterifica-
dos con P-hidroxiácidos grasos no comunes corno el áci-
do P-hidroxirnirístico (C 14), el ácido miristomirístico y el
ácido laurornirístico (véase fig . 1-108). Los ácidos gra-
sos adicionales pueden unirse a través de los grupos hi-
droxilo a otras posiciones no sustituidas de la molécula
del ácido rnirístico. Estas sustituciones adicionales difie-
ren entre los géneros de bacterias gramnegativas. Unido
a la porción de lípido A del LPS se encuentra el centro
polisacárido. El centro polisacári?o co~ti~ne dos carbo-
hidratos únicos, el 2-ceto-3-desoxrnctulomco (KDO), un
azúcar de 8 carbonos, y la heptosa, un azúcar de 7 carbo-
nos. Los azúcares adicionales (es_ ?ecir, N-acetilglucosa-
mina, glucosa y galactosa) tamb1en pueden encontr~se
en el centro polisacárido. La estructura del ce?tro pohsa.
cárido es bastante conservada dentro de un genero dado,
. de una especie a otra. Las cadenas la-
pero puede van; s están unidas al core polisacárido y
la especificidad antigénica d~ los
son resp?n} .d les Estas cadenas laterales contienen
11 /
aisla~os ;~ ~~::ie (hasta alrededor de 40) de unid~des
p' un n~me cáridos repetidas conformadas por tres a cmco
de ohgost·d ada una. Estas cadenas laterales con es-
O-
rno~os~dc d1 ost_gce'nica habitualmente contienen residuos
1
Pecdic1 a 'dantOs peculiares O poco comunes, que me · Ju-
de ncar b h
ácido aminohexaurómco, 6-desox1g uc~sa,_y '6-d',_
o I ra . · ¡ 2
ye • El lípido A parece ser el pnnc1pal com-
desox1g1ucosa. . •
de las rnamfestac10nes de ¡a act1v1-
··
ponente respo nsable · · d
dad de endotoxina en p~cientes ~on seps1s ocasiona as
or bacterias grarnnegauvas (p. eJ ., fie_bre, sho~~• colap-
p y hemorragia) La endotoxma tarnb1en puede
so vascu
. Iar rnplernento y ·causar coagulac1ón . .mtravascu-
acuvar e1co · 1 s
lar diseminada. La estructura generalizada de LP de las
. d Salmonella se muestra en la figura 1-lOA; la
especies e . , 'd ¡ ,
estructura del lípido A, el centro po1¡sacan o y os anll-
genos somáticos se muestran en la figura 1-10B, C y D,
respectivamente. ,
La disociación de la membrana mas ex(erna del LPS
llevar a cabo parcialmente mediante el trata-
se pUede , 'd ·1 d' .
miento de suspensiones celulares c~n ac1 o ell en JaIIll-
notetraacético (EDTA), el cual actua como quelante de
los cationes divalentes de la membrana externa. Los tra-
tamientos posteriores con Iisozima hiru:olizan la capa de
peptidoglicano de bacterias grarnnegauvas y las celulas
se lisan. La integridad de la membrana exte~a. depende
del calcio y del magnesio y es u_na de las pnnc1p_ales ra-
zones para la inclusión de estos 10nes en los rned10s usa-
dos para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
La membrana externa de los grarnnegativos también
contiene fosfolípidos y proteínas. Los fosfolípidos se
asemejan a aquellos encontrados en la membrana cito-
plasmática e incluyen la fosfatidiletanolamina y el fosfa-
tidilglicerol. La membrana más externa también contiene
proteínas; algunas de ellas están presentes en altas con-
centraciones y son llamadas proteínas mayores o prin-
cipales de membrana. Estas proteínas se pueden incluir
en tres grupos fundamentales: las porinas, que son pro-
teínas que forman canales de transmembrana a través de
los cuales los materiales de bajo peso molecular son in-
troducidos en el espacio periplasmático. Muchas de estas
proteínas porinas tienen una estructura de trímero (es de-
cir, tres proteínas idénticas que forman un poro con for-
ma de rosca). Las no porinas son proteínas de trans-
membrana que están asociadas con la capa de peptidogli-
cano de la pared celular. Pueden actuar en la producción
y la secreción de exoenzimas, en la unión a superficies o
en la,unión de agentes an~imicrobianos a la superficie de
l~s celulas ~!aneo (e,s decir, proteínas de unión de penici-
h~a). Las lipoprotemas son las más pequeñas de las pro-
temas de la _membrana externa y estabilizan la pared ce-
lular por um?~es covalentes con el peptidoglicano. Den-
tro de la fa~ha Enterobacteriaceae, un antígeno común
enterobactenano también se encuentra en la memhrana
externa. Este a_ntígeno es ~n polisacárido lineal com~ues-
to p~r _N-acelllglu~osamma, ácido N-acetilmanosa \ .-
nouromco y N-acelllfucosamina unidos a los fosfolípts
de la membrana externa. 1
La· estructura
d' de, la. pared bacteri·ana t'1ene una impor-
.
tancia _trecta y practica para los microbiólogos debido a
que el tipo de estructura de la pared ee1u1ar es responsa- ,
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 15

Fig. 1-10. Lipopolisacárido

de la envoltura celu.lar gramneg (LPS)
t' LPS
va. A. Segmento
. del I'
po 1mero que a 1- Unidad repetitiva } AollgeooO
muestra 1a disposició n d e 1os cons } (hasta 40)
·
tJtuyentes principales B E -
del lípido A de S 1 . . structura } Centro polisacárido
. a monel/a ty h · Centro
munum. C. Centro d 1 . p i-
d D u· e pohsaeári-
o. . rudad .repetitiva t'1p1ea . (Sal- Disacárido-difosfato
mone 11a typ/11111uriu111). (Redib .
do de Brooks GF y I UJa-
·k co · Jawetz Lípido A
Me1me y Adelberg's Medie .'
erobiology, l 9E. Norwalk Coa! M1- Ácidos grasos
ti A , nnee-
eut, ppleton & Lange, 1991.)

Lípido A ¡cENTROI
o
1

1
1

?H2 0 ?H2
c-o c--o
7/ \c c
\~c
c 1\ H H /1
H203P-ó\7
c-c
ir~ H0\1
c-c
1 1
1/ O-P03H2

9
1 1 O HN
HN------.__ 1 1
C=O C=O C=O C=O
1 1
1 1
CH 2 CH 2 CH 2 CH 2
1 1
1 1 CHOH CHOH
CH /CH
0--1 / ,1 1
(CH2)10
1
(CH2)10
1 (CH2)10 O (CH2)10
1 1
y=O
C=O 1 1 1
1 CH3 CH 3 CH 3 CH 3
(CH2)12 (CH )
1 1 2 10
CH3 CH3

(LM) (HM) (HM)

B (MM)

KDO = ceto-desoxi-octulonato
Centro Glu-GlcNAc
1 Hep = L-Glícero-o-manoheptosa
Gal HM = ácido ~-hidroximirístico (C, 4)
1
Glu-Gal LM = ácido lauroximirístico
1
Hep MM = ácido miristoximirístico
1 Eth.N = Etanolamina
Hep-P-P-Eth-N
Glu = Glucosa
1
KDO GlcNAc = N-acetilglucosamina
1 Gal = Galactosa
KDO-KDO-P-Eth-N
e 1
1
Manosa - Abecuosa
Unidad repetitiva 1
Ramnosa
Ejemplo: (repetida hasta 40 veces)
1
Galactosa
D 1

na. En las bacterias grampositivas, el complejo púrpu-

ble de la reacción frente a la coloración de Gram. Esta
tinción diferencial divide a la mayoría de las bacterias
en dos grupos, bacterias grampositivas y bacterias gram-
negativas. En los procedimientos involucrados en la co-
loración de Gram, las células son: 1) teñidas con cristal
violeta, 2) tratadas con yodo para ,formar un complejo
yodo-cristal violeta dentro de la celula, 3) lavadas con
una mezcla de solventes orgánicos (alcohol-acetona) y
4) teñidas con un colorante de contraste rojo, la safrani-
ra cristal violeta-yodo es retenido dentro de la célula
después de lavar con alcohol ácido porque la gruesa ca-
pa de peptidoglicano no permite que el complejo yodo-
cristal violeta pueda ser extraído de la célula. En las
bacterias gramnegativas, el complejo yodo-cristal vio-
leta es eliminado de la célula (es decir, las células pier-
den el color) debido a la interrupción de la membrana
exterria rica en lípidos por acción de la mezcla de sol-
16 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

d celular de las micobacterias contiene una ca-

ventes orgánicos alcohol-acetona. Estas células descolo-
radas deben ser teñidas con un colorante de contraste pa-
ra que puedan ser observadas en el microscopio óptico;
este contraste es provisto por la safranina. Las bacterias
grampositivas se ven azul-púrpura en el microscopio y
las gramnegativas son teñidas de rojo por el colorante de
contraste safranina.
PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS
ACIDORRESISTENTES
Una modificación de la pared de las células grampo-
sitivas ha sido observada en microorganismos pertene-
cientes a los géneros Mycobacterium, Nocardia y Cory-
nebacterium. En estos microorganismos, los lípidos
constituyen más del 60% del peso seco de la pared bac-
teriana. En sus paredes contienen unas moléculas llama-
das ácidos micólicos. Los ácidos micólicos son ~-hidro-
xiácidos grasos grandes, a-sustituidos, que se presentan
como ésteres unidos a los polisacáridos de la pared ce-
lular. Los ácidos micólicos varían en el número de áto-
mos de carbono; aquellos con 30 carbonos (C30) se en-
cuentran entre las corinebacterias (ácidos corinemicolé-
nicos), los de CSO se encuentran en especies de Nocar-
dia (ácidos nocárdicos) y aquellos con C90 o más cons-
tituyen los ácidos micólicos encontrados en el género
Mycobacterium.
A sa, están asociados con la virulencia de las micobacterias
OH
1
CHp--CO-CH-CH-C60H120(0H)
1 ten de este modo que los microorganismos sobrevivan
C24H49
H OH
o
o-+-Jf
H OH H en~e ~a m~mbrana y la pared celular. Las proteínas que
OH
1 estan 1~volucradas en la biosíntesis y la construcción de
OC-CH-yH-C60H120 (0H)
C24H49
B _ Los microor~anismos que son acidorresistentes se ti-
La pare . ·1 1
pa de peptidoglicano, cuya estructura _es s1m1 ar a en-
contrada en las paredes de las bacter!as gr~ega~1vas.
El peptidoglicano está unido a un pohsacárido ra~_fica-
do llamado arabinogalactano por enlaces fosfod1ester.
Los extremos distales del arabinogalactano están esterifi-
cados con el ácido micólico de alto peso molecular re-
cién descrito. Estos glucolípidos de alto peso molecular
tienen un esqueleto carbonado cuya longitud oscila entre
C y C90 • En Mycobacterium tuberculosis, el único áci-
78
do mi cólico 6,6' -dimicoliltrehalosa es conocido como el
factor cordón (fig. 1-1 !A). Esta molécula está asociada
con la virulencia de M. tuberculosis y con una amplia ga-
ma de actividades biológicas, que incluyen la citotoxici-
dad de la membrana celular, la inhibición de la migración
de los polimorfonucleares, la inducción de la formación
de granulomas, actividad adyuvante, actividad antitumo-
ral y habilidad para activar la vía alterna del complemen-
to. El complejo peptidoglicano-ácido micólico-arabino-
galactano forma el esqueleto de las paredes celulares de
las micobacterias. Las cadenas hidrocarbonadas de los
ácidos micólicos están intercaladas con las de los nume-
rosos lípidos y glucolípidos asociados con la pared. Los
lípidos asociados con la pared incluyen grupos acil gra-
sos de longitud media (C 24 a C36 ) y corta (C, 2 a C20). Es-
tos lípidos asociados con la pared incluyen a los sulfolí-
pidos de trehalosa (véase fig. 1-11B). Los sulfolípidos de
trehalosa ejemplificados por el sulfolípido principal de
M. tuberculosis, el 2' -sulfato de 2,3,6,6' -tetraaciltrehalo-
porque estas moléculas evitan la fusión fagolisosómica
que sigue a la fagocitosis de las micobacterias, y permi-
como parásitos intracelulares facultativos. Proyectándose
a_través de las capas de la pared de peptidoglicano, ara-
bmogalactano y ácido micólico se encuentran fosfolípi-
dos, s_ustitui_dos (fo~fatidilinositolmanósidos) y lipopoli-
sacandos (hpoarabmomananos) que están unidos a la ca-
pa más externa de la membrana celular de las micobacte-
rias. Estas moléculas proveen de una unión no covalente
est~n !nclmdas en la pared celular de las micobacterias
los poh_meros de la pared celular y algunas aparentemen-
te funcionan como porinas.
nen de ~olor roJo con el colorante básico carbolfucsina y

~OLo ~oo,=
Ácido graso s~n resistentes a la descoloración con alcohol ácido. De-
ÓH Ácido graso
2 1 , bido al c_arácter hidrofóbico de la pared celular de la mi-
cobactena, la penetración del colorante dentro de la cé-
lula es favorecida por el calor (método de Ziehl-Neelsen)
o por agre_gado de detergente al colorante (es decir, mé-
todo de I_<-i~youn): La resistencia a la descoloración con
H OH -\~/ alc_ohol ac1do _(ac1dorresistencia) está asociada con las
CH2
umda~es de ácido micólico arabinogalactano que consti-
,
Acido graso -o
1 tuyen a_may~r parte de los materiales de la capa externa
del pept1dog~1cano. Los lípidos solubles contribuyen pe-
ro_ n\deten_runan las propiedades acidorresistentes de las
Fig. 1-11. Estructura molecular de lípidos especializados que se :co actenas porque la extracción de esos lípidos dismi-
encuentran en la pared celular de Mycobacterium tuberculosis. A.
Estructura molecular de un factor cordón (6,6' -dimicoliltrehalosa)
cfl: ~:~~~~adtruye la acidorresistencia. La interrup-
, 'd d e ª pared celular Y la extracción de los
producido por Mycobacterium tuberculosis. B. Estructura molecu- 11P1 os e Ia pared celular .
lar del sulfolípido principal (2' -sulfato de 2,3,6,6' -tetraaciltrehalo-
ve tanto los lípidos libre con etanol alca)mo que remue-
yen la acidorresiste • como los_ estenficados destru-
sa) de M. tuberculosis. ncia e eS tos rmcroorganismos, indi-

cativo de que el contenido de , .
celular es responsable d hpidos totales de la pared
acidorresistente. e las propiedades de tinción
ENDOSPORAS
Las endosporas son e tru
madas dentro de cierta/es ctu_ras esféricas u ovales for-
sentan un estado latente ,~ecies bacterianas que repre-
O capsular laxamente asociado también puede ser llamado
cimiento de esos micro e _reposo" en el ciclo de ere-
con importancia clínica o~garusmos. Entre las bacterias
en dos géneros de bacte;ia:.s e nd0 s?oras se forman sólo
sitivos formadores de d · los bacilos aerobios grampo-
ro Bacillus y Jos bacil~~ ospora~ pertenecientes al géne-
tivos formadores de e d anaerobios o~ligados gramposi-
En estos géneros las n ~sporas del genero Clostridium.
a 1a falta de nutriente e~ osporas se forman en respuesta
getativa. Estas estruc~r entro de la célula bacteriana ve-
efectos destructivo d las slon altamente resistentes a los
chos agentes des· s13 e ca or' sequedad ·6
. , presi n y mu-
•. ectantes. Se reqmeren procedimien-
tos de estenhzac1on (es decir, 120ºC d 15-20 ._
nutos) para mat urante rru
ar esporas. Se cree que la resistencia al
calor ~e las endosporas bacterianas se debe al reducido
conterudo de ag~a en el centro propiamente dicho de la
espora. El_ ~'.111º• la forma Y la localización de las en-
dosp~ras mcip1entes en células en fase estacionaria de
es~eci~s de Clo~trid~um Y_Ifacillu~ es útil para la carac-
tenzación Y la_ identificacion de ciertas especies dentro
de estos do~ ~eneros. Las endosporas pueden ser esféri-
c~s, subesfencas u ovales; pueden diferir en su localiza-
ción dentro de la célula (es decir, central terminal o sub-
terminal) y pueden hinchar o no a la célula. Las endos-
poras generalmente no se tiñen con los métodos habitua-
les de tinción como la coloración de Gram y aparecen co-
mo cuerpos refractarios, no teñidos en los extendidos.
Bajo los estímulos de ciertas condiciones ambientales
como el agotamiento de nutrientes (glucosa, nitrógeno o
\ fosfato) o la exposición a temperaturas o potenciales re-
) dox subóptimos, el material nuclear se divide en dos nu-
cleoides, y uno se separa del otro por un septo membra-
noso. El septo crece y el centro de la espora termina ro-
deado por una doble membrana. Entre las dos membra-
nas, una capa cortical se deposita sobre ellas. Esta corte-
za consta fundamentalmente de material peptidoglicano.
La capa cortical se endurece y acumula iones calcio de-
bido a la actividad quelante de una molécula singular lla-
mada ácido dipicolínico. El centro queda protegido por
la alta concentración de iones calcio que entrecruzan
fuertemente el material peptidoglicano y toda el agua
contenida en la espora es expulsada. Varias capas de la
cubierta de la espora (una sustancia de tipo queratina
que es rica en enlaces disulfuro) se depositan y!ª espm:a
es liberada en el momento en que muere y se hsa la ce-
lula madre vegetativa. Las endosporas pueden permane-
cer viables durante períodos prolongados. Cuando la es-
pora es colocada en condiciones a~bientales favorables
en presencia de algún estímu_lo parti~ular (p. eJ. , la pre-
sencia de un aminoácido parti~ular, h_idrato de ?arbono o
agua) se produce su germinación. BaJo este estimulo, las
. on acti·vadas degradan la corteza de la espora y
enzimas s ' . • ·
liberan el material peptidoghcan~, lo~ 10nes calc10 Y
.d d' . ¡- ico Comienza la smtesis del RNA, segm-
áci O 1P1~otmi·s de proteínas y finalmente, la síntesis de
d a por 1a sm es ' , . rápido.
DNA . El resultado es una nueva celu 1a vegetativa.
BACTERIOLOGfA BÁSICA 17
ESTRUCTURAS DE LA SUPERFICIE BACTERIANA
CÁPSULAS
Algunas bacterias poseen una cápsula por fuera de la
capa más externa de la pared celular. La cápsula puede ser
gruesa o delgada y puede estar estrecha o laxamente aso-
ciada con la cara externa de la pared celular. El material
capa "borrosa". El material capsular habitualmente es
de naturaleza polisacárida; pueden ser polímeros de un
único monosacárido (glucosa, dextrano, levano) o hetero-
polisacáridos que contienen tanto hexosas como pento-
sas, más ribitol, glicerol u otros alcoholes azúcar. Los fos-
fatos con frecuencia también están presentes. En algunas
especies de bacterias, como algunas especies de Bacillus,
la cápsula bacteriana es de naturaleza polipeptídica. La
cápsula es sintetizada a nivel de la membrana celular; sus
componentes son sintetizados y exportados fuera de la cé-
lula por un sistema transportador para lípidos isoprenoi-
des, en el cual los componentes se unen a un material cap-
sular "iniciador" ya presente en la superficie celular. En
algunos casos, como -en el de la cápsula de glucano de
Streptococcus mutans, la cápsula es sintetizada por enzi-
mas extracelulares llamadas glucosiltransferasas que
son secretadas fuera de la célula. La acción de estas enzi-
mas en una dieta de sacarosa crea una matriz de glucano
ramificada e insoluble que luego interactúa específica-
mente con receptores de la superficie celular para crear
una cápsula de glucano. La cápsula de glucano tiene im-
portancia práctica como un factor de virulencia porque
este material forma la matriz de la placa dental. La adhe-
rencia de las bacterias a esta matriz y la posterior forma-
ción de ácidos a partir de la sacarosa presente en la dieta
conduce a la iniciación de caries dentales.
La cápsula bacteriana tiene varias funciones. Protege a
las células de la desecación y de materiales tóxicos del
medio ambiente (p. ej ., metales pesados y radicales li-
bres) y promueve la concentración de nutrientes en la su-
perficieaela-bacteria debido a su naturaleza polianióni-
ca. La cápsula también tiene participación en la adheren-
cia de las bacterias a las células y mucosas superficiales.
Esta adherencia es necesaria para que muchos microor-
ganismos establezcan infecciones en los huéspedes ade-
cuados (se trata más adelante). Además, la cápsula tam-
bién ofrece resistencia a la acción bactericida del com-
plemento y de los anticuerpos séricos. El material capsu-
lar habitualmente es antigénico y la detección serológica
de las formas capsulares es la base de la prueba de Que-
llung, que puede ser utilizada para identificar o estable-
cer subtipos de varias de las más importantes bacterias
patógenas para el hombre e incluyen serotipos de Strep-
tococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae de tipo b,
Klebsiella pneumoniae y Neisseria meningitidis. El ma-
terial capsular en muchos microorganismos es sintetiza-
do en abundancia y derramado en los líquidos circundan-
tes tanto in vivo como in vitro. Este material puede ser
de~ectado en varios líquidos corporales (p. ej ., suero, lí-
quido cefalorraquídeo y orina) durante la infección por
ciertas bacterias encapsuladas (p. ej ., neumococo, me-
1 ningococo y H. influenzae de tipo b) y puede ser especí-
ficamente detectado e identificado mediante pruebas de
electroforesis o aglutinación para proveer un diagnóstico
 18 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

gitud variable. Está compuesto de subfibrillas paralelas

FLAGELOS
Los flagelos bacterianos son largos apéndices filamen-
tosos que surgen a nivel de la membrana citoplasmática
Y. que se extienden a través de la pared celular al medio
circundante. Son responsables de la movilidad celular.
Los flagelos generalmente se encuentran en las bacterias
grarnnegativas con forma de bastón aunque algunas espe-
cies con forma de bastón grampositivas móviles (p. ej .,
especies de Listeria) y cocos (algunas especies de Ente-
rococcus, especies de Vagococcus) también pueden pre-
sentarlos. Los flagelos se diferencian por su número y
por su disposición en la célula. Las bacterias con un fla-
gelo único en posición polar se llaman monotricas;
aquellas con dos o más flagelos que se originan en un po-
lo o punto de la célula son señaladas como lofotricas;
aquellas con un solo flagelo en dos puntos o polos dife-
rentes de la célula se llaman anfitricas y aquellas con
dos o más flagelos (un penacho) en dos puntos o polos de
la célula se llaman anfilotricas. Los microorganismos
que poseen flagelos sobre toda su superficie se denomi-
nan peritricos.
En las bacterias gramnegativas, los flagelos tienen una
estructura compleja que consiste en tres partes: el fila-
mento, el gancho y el cuerpo basal (fig. 1-12). El fila-
mento flagelar tiene 13 a 17 nm de diámetro y es de Ion-
Filamento
de la proteína flagelina (PM= 30.000-40.000 daltons),
que interactúan para formar un cilindro hueco. El fila-
mento es semirrígido y forma una hélice orientada hacia
la izquierda tal como existe en la célula. La flagelina tie-
ne la capacidad de autoensamblarse. Los monómeros de
la proteína son sintetizados y pasados a través de la luz
del cilindro. En el extremo de crecimiento de la hélice
flagelar, el monómero sufre un cambio conformacional y
se adiciona al extremo distal del flagelo. El gancho está
constituido por otra proteína diferente que actúa como
una "manga" de la cual emerge el flagelo. El gancho per-
mite la transmisión de un movimiento de rotación desde
el cuerpo basal hacia el filamento. El cuerpo basal está
compuesto de anillos complejos conectados por una es-
tructura con forma de bastón. Los anillos M, S, P, y L
están fijados en la membrana, el espacio periplasmático,
el peptidoglicano y en el lipopolisacárido de la membra-
na externa, respectivamente. La estructura anular externa
en las bacterias gramnegativas comprende al menos
1O proteínas. La estructura en anillo unida a la membra-
na rota como parte de una reacción dependiente de ener-
gía, y hace que la hélice rígida flagelar se convierta en un
propulsor. La energía para esta reacción se obtiene me-
diante el pasaje de protones desde afuera hacia el cito-
plasma a través del cuerpo basal. Los anillos externos
(anillos L y P) evidentemente funcionan como soportes,
minimizando la fricción y la liberación de materiales ce-
lulares en los puntos de inserción flagelar. En las bacte-

E}
rias grampositivas, la estructura flagelar es menos com-
pleja y está compuesta por dos anillos. Una estructura en
anillo fija el flagelo a la membrana plasmática, la segun-
e e da estructura en anillo se encuentra incluida·en la capa de
U') r--
C') peptidoglicano.
Varias especies de microorganismos flagelados pue-
den modificar el tipo de antígeno flagelar que producen;
este proceso se denomina variación de fase. La varia-
ción de fase ocurre debido a la expresión diferencial de
genes que codifican para varias proteínas flagelinas es-
tructuradas. Este fenómeno fue observado por primera
vez en bacterias entéricas grarnnegativas como especies
d~ Salmonell?, pero también se produce en otras espe-
cies. Los ~ntlgenos _flagelares en bacilps gramnegativos
se denomman antlgenos H, de la palabra alemana
"~auch" que significa "respirar". La tipificación seroló-
g1ca completa de Salmonellae involucra la identificación
E de los antígenos S (antígeno somático), H (antígenos fla-
e gelares) y K (antígenos capsulares) .
a,
ñi
(/) E
et! e
.D r-- FIMBRIAS (PILI)
o E C\I
o. e
cii Bastón
::,
C\I Las fimbrias o pili son _apéndices más pequeños que se
ü enc_uentran en la superficie de muchas bacterias grarnne-
Anillo S gatlv~s. A pesar de que los términos "pili" y "fimbria"
AnilloM han sido usados en forma indistinta, fimbria se utiliza ac-
t~a~ente para desc'.ibir cualquier apéndice no flagelar
similar ª un pelo, mientras que pili se utiliza para nom-
brar a aq~~llas fim?rias de las bacterias gramnegativas
c~ya func1on especifica es la de transferir DNA de una
10 nm celula aalotra
J' ) durante
L fi bel .proceso de conJ·ug ac1on
. , (p. eJ.,
. p1-
.
1 sexu es . as im nas tienen de 3 a 10 d d', -
22,5 nm
tro de 15 a 20 µm d 1 , nm e iame
' , . e argo Y estan compuestas. de una
protema
t b denommada
f d fimbrilina • L as pro temas
, forman
Fig. 1-12. Ultraestructura de un flagelo de una bacteria gramnega-
u os pro un os que parecen tener origen en la membra-
tiva.

na celular pero que ca
recen de
tructuras con forma d un cuerpo basal y las es-
Es os apen ices están e· gancho p ropias
t , d. ·
de los flagelos .
, involucrad
pares espec1ficos para el . os en la formación de
co durante la coniug •, intercambio de material genéti-
., , ac1on y tarnb· , .
adh es1on para bacte • -e 1en sirven de sitios de
, no1aoos La fi b .
tuan corno oroanelas 1 ° · s 1m nas también ac-
. "' 1
ceuaresp .,
superfi1c1es mucosas· 1 fi _ara 1a adhes10n celular a
función son citadas fr as irnbnas que sirven para esta
mayoría de las adhesi~cue~temente como adhesinas. La
tina a residuos terminal:~ dercen un_a unión del tipo lec-
des de manosa. Por . e carboh1dratos, como unida-
entéricas a superfic• eJemplo, la adherencia de bacterias
de tipo l O comune;es ::mcosas: q~e_es mediada por pili
bación de las bact : p ede ser mh1b1da por una preincu-
enas con mano L
la porción terminal d . sa. a manosa se une a
cia· de esta mane ¡e 1ª ~~hesi~a Y bloquea la adheren-
, ra, os p1h de tipo I d · entonces en la célula, pero sólo una cadena participa en
nosa-sensibles L dh . se enomman ma-
· as ª esmas que no son afectadas por la
manosa se d enomina .
- •d d n manosa-res1stentes Distintas es-
pec1 6 c1 a es en estas umones · .
de tipo lectma . · son parcial-
mente r~sdpodnsables p~r el tropismo tisular observado en
una vane a de especies bacterianas.
. El papel_de las fimbrias como factores de virulencia ha
sido estudiado . extensame nte en Ne1ssena • . gonorrhoeae.
Las cep~s virulentas de N. gonorrhoeae poseen fimbrias
superficiales Y son capaces de unirse con avidez a célu-
las mucosas en_ el tracto genital. La pérdida de fimbrias
m~rced a r~petldos subcultivos in vitro vuelven a estos
nucroo'.gams~os incapaces de originar una infección
urogemtal debido a la falta de adherencia a la mucosa.
Además! los gonococos poseen un gran núniero de genes
que codifican para proteínas fimbriales antigénicas dis-
tmt_as estructuralmente. Cuando se encuentran presentes
anticuerpos contra un tipo de proteína fimbria!, el mi-
croorganismo es capaz de "apagar" la producción de la
vieja proteína y "encender" la producción de una nueva
proteína fimbria!. Debido a la capacidad de una única ce-
pa de gonococo de producir múltiples antígenos fimbria-
les antigénicamente diferentes, la utilización de fimbrias
como antígeno candidato para una vacuna antigonocóci-
ca ha sido considerablemente infructuosa.
INTERCAMBIO GENÉTICO EN LAS BACTERIAS
La replicación bacteriana ocurre por un proceso de fi-
sión binaria, un proceso asexual que no involucra eventos
de recombinación y tiene como resultado la generación de
dos células hijas idénticas a la célula parental. A pesar de
esto, varios grupos de bacterias tienen la capacidad de lle-
var a cabo un intercambio genético y recombinación con
otros microorganismos. El intercambio genético entre
bacterias sucede por uno de tres mecanismos: transforma-
ción transducción y conjugación (fig. 1-13).
L¿ transformación involucra la incorporación de
DNA libre del medio que rodea al microorganismo. Las
células que son capaces de t_omar e incorporar a sus ge-
nomas DNA libre se denomman competentes. La com-
petencia generalmente es un estado transitorio que suce-
de hacia el final de la fase exponencial de crecimiento.
En las bacterias grampositivas competentes, trozos pe-
queños de DNA de cadena do~le se unen a la célula por
un receptor celular de superficie que es expresado duran-
te el período competente. A medida que el DNA entra en
8ACTERIOLOGfA BÁSICA 19
la célula, una cadena es hidrolizada por una nucleasa uni-
da a la superficie. Los acontecimientos de recombinación
entre el DNA de cadena simple y la región homóloga del
cromosoma bacteriano dan como resultado la integración
del DNA transformado al genoma bacteriano. Si no exis-
ten regiones con homología hacia el DNA transformador,
la cadena de DNA no se integra, los genes de esa cadena
de DNA no se expresan y el DNA de cadena simple es
degradado por endonucleasas de restricción endógenas.
Las bacterias gramnegativas competentes también po-
seen receptores para DNA en la superficie celular, pero el
proceso de unión del DNA ocurre simultáneamente con
el reconocimiento de una secuencia de nucleótidos de
!O a 14 pares de bases, que permite que sólo el DNA de
especies muy relacionadas pueda unirse y entrar en las
células competentes. El DNA de cadena doble ingresa
los eventos de recombinación que determinan la incorpo-
ración del DNA transformador en el genoma del recep-
tor. Por medio de un tratamiento con CaC1 2 u otras solu-
ciones salinas, células que normalmente no expresan
competencia para la transformación genética pueden ha-
cerse permeables al DNA extracelular. La incorporación
de DNA desnudo por bacterias "artificialmente compe-
tentes" se denomina transfección.
El intercambio de información genética por medio de
bacteriófagos se denomina transducción. Los bacterió-
fagos (o simplemente "fagos") son virus que infectan
bacterias. Algunos bacteriófagos son líticos, esto es, lue-
go de infectar a la célula bacteriana los genes regulato-
rios del bacteriófago "toman control" de la maquinaria
de biosíntesis celular, lo cual lleva a la expresión de los
genes estructurales del fago y a la producción de nuevas
partículas fágicas que son liberadas debido a la lisis y
muerte del huésped bacteriano. Con los bacteriófagos
temperados, el material genético es incorporado al DNA
del huésped como "profago" y se replica junto con el
cromosoma bacteriano. Estos bacteriófagos también son
llamados bacteriófagos lisogénicos y de la célula bacte-
riana infectada con este fago se dice que se encuentra li-
sogenizada. En la inducción por exposición a ciertos
químicos (p. ej., mitomicina C) o a la radiación ultravio-
leta, los bacteriófagos lisogénicos pueden ser inducidos a
iniciar la producción de nuevos fagos (es decir, el fago se
vuelve "lítico"). La escisión del DNA del bacteriófago
del genoma de la célula bacteriana trae aparejado el he-
ého de que algunos bacteriófagos no sólo contengan los
genes específicos del fago sino también genes de la célu-
la huésped que se encontraban localizados en las adya-
cencias del sitio de integración del fago en el cromosoma
bacteriano.
La transferencia de información genética durante la
transducción puede ser generalizada o especializada. El
término transducción generalizada hace referencia al
empaquetamiento accidental y aleatorio del DNA de la
célula huésped en el interior de la cápside o "cabeza" de
la partícula fágica. La liberación de partículas fágicas
maduras durante la lisis celular y la posterior infección
de otra célula bacteriana determina la introducción en el
interior del "receptor" de "DNA donante" proveniente
del huésped bacteriano original. La recombinación del
DNA transducido con una región homóloga del cromo-
soma de la célula receptora resulta en la integración y ex-
presión posterior de los genes transducidos. La transduc-
20 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
C. Conjugación
A. Transformación B. Transducción

+
El bacteriófago
infecta
-~®
¿j)
Fragmentos de Bacteria Bacteria

l
DNA cromosómico Bacteria El fago contiene donante (F+) receptora (F-)
de la bacteria Receptor algo de DNA
donante
donante competente

Capacitación l
bacteriano
Contacto a
través de
pili sexual
l
de DNA
+

!i Bacteria
receptora
1
DNA de la donante transferido
durante la replicación

l
Las células]
Reoom•oación \ se separan
El fago que
contiene DNA

li
bacteriano
infecta otra
célula,
inyecta DNA
de "donante"

Célula bacteriana
transformada
R=m•ooc;o, l Bacteria
receptora

j
j
Recombinación

Receptor
transducido
íJ
Receptor
recombinante
(F+)

Fig. 1-13. Mecanismos de transferencia de genes en las bacterias. Los microorganismos pueden intercambiar material genético por cual-
quiera de tres procesos: transformación (A), transducción vía bacteriófagos (B) y conjugación (C).

ción generalizada sucede con una frecuencia de 1 fago
transductor por cada 105 a 108 partículas de fago genera-
das por inducción desde un estado lisogénico, y alrede-
dor del 1% al 2% de la longitud total del genoma de la
célula huésped puede ser transferida por este mecanismo.
Se denomina transducción especializada al empaqueta-
miento de genes específicos del huésped dentro del fago
transductor. Este tipo de transducción ocurre con los fa-
gos temperados que se insertan en sitios específicos del
cromosoma, como el bacteriófago lambda. Sólo aque-
Ilos genes del huésped que _flanquean ~I genoma del fago
• do ti· enen la oportunidad de ser mcorporados en el
integra d bacteriófago luego de 1a m · ducc1on
·' des de e1
I
genom~. e , . Un fago transductor especializado se
estado 1sogerudc0 ·105 a I Q6 nuevas partículas fágicas pro-
produce por ca a . .,
ducidas luego de la mducc1on. .
La conjugación es el único mecanismo de intercam-
bio genético entre bacterias que requiere contacto célula-
célula. Las bacterias gramnegativas capaces de participar
en la conjugación poseen un plásmido llamado F que co-
difica para los pelos sexuales. Estos pelos especializados
funcionan como vehículos para establecer contacto con
otra célula bacteriana como si fueran "tubos" a través de
los cuales el DNA pasa durante el proceso de conjuga-
ción. Las células que poseen el plásmido F se denominan
P, las células que no lo tienen son llamadas F-. Una vez
que se ha es~ablecido el contacto entre una célula P y
una F· a traves de un pelo sexual, el plásmido circular F
comienz_a a s_er replicado. Durante este proceso, una de
las cadena~ simples del plásmido DNA pasa a través del
pelo a 1~ celula recept~ra. La cadena simple que es pasa-
da coffilenza a ser replicada a medida que entra en la cé-
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 21

lula receptora y el resultado fi REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO

contienen plásmidos conJ· _mal son dos células que
ugat1vos c 1 ( . y EL METABOLISMO BACTERIANOS
ambos ~e vuelv~n células F+). omp etos es dem,
En ciertos microorganismos el , . .
en el genoma de Ja ce'lul h , ' plasm1do F se mtegra CARBONO
a uesped e ·· d ·
ción específico dond n un s1t10 e mtegra- Las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos
e se encuentra
cia homóloga de nucleótidos El e prese~te _una secuen- de acuerdo con sus requerimientos de carbon?: las bacte-
conexión a través del F. st ªb_lec1m1ento de una
pe IO Y la con ·' · · rias litotróficas o autotróficas y las ba~ten~s or;ano-
resulta en una trans~ . d Jugac1on s1gmente tróficas O heterotróficas. Las bacterias _li~otroficas
· erencia e algunos genes del plásmi-
do F Juntamente con material
. . de la ce'lul a huespe
, d que se pueden usar el dióxido de car?ººº ~orno la ,~mea fuent~
f f -t en
tr d
yacente al sitio de integración del plásmido
. ~s ce u ~Is qlue poseen un plásmido F integrado SP de-
de carbono y sintetizar a partir de_este lo~ . esqueletos
carbonados para todos sus metabolitos ?rgan!c?s. Para su
nomman• ce .u as Hfr (hi gh frequency recombmations . T crecimiento sólo requieren agua, sales mo;gamcas_y C~2
[recombmac10nes
'I 1 de alta frecuenci'a]) • El .
cruzamiento y su energía deriva tanto d~ }ª luz (bacteria~ fotohtot~o-
entre ce u as Hfr y F-. determina una transe,erencia · de par- ficas) como de la oxidac10n de una o mas sustancias
te de,1genoma del F Junto con algunos genes del huésped. inorgánicas (bacterias quimiolitotróficas). Las bacte-
La celula receptora
. p- generaJmente perm anece como F- rias organotróficas son incapaces de ul!hzar C02 como
luego d~ la conJugación porque sólo parte del plásmido F única fuente de carbono y lo requieren en una forma or-
de la celula dadora Hrf es transferida a la receptora du- gánica, como la glucosa. Para estas ~~cterias h~terotrófi-
rante el proceso conjugativo. De este modo, estas células cas, una porción del compuesto orgamco que s1~e c_omo
receptoras no po_seen el complemento completo de genes fuente de energía también es utilizada para 1~ smtes1s ?e
que s?n n~;=esanos para sintetizar el pelo sexual. La re- compuestos orgánicos requeridos por el. m1croorgams-
combmac10n entre el material genético de una célula da- mo. Una gran variedad de otras sustancias pued~n ser
dora y las regiones homólogas de un receptor p- permite también utilizadas como fuentes de carbono exclusivas o
que el DNA donante sea expresado en la célula recepto- parciales por diferentes especies de bacteri~s. Entre las
ra. La célu!a dador_a permanece Hfr porque el cromoso- bacterias más versátiles se encuentran especies de Pseu-
ma de la celula ~uesped (que contiene el plásmido Fin- domonas, de las cuaJes algunas pueden utilizar más de
tep-~do) se replica ?urante la transferencia de DNA ge- 100 compuestos orgánicos diferentes como única fuente
nom1co de cadena simple de la célula Hfr a la p- a través de carbono y energía. Las relaciones entre fuentes de
de los pelos sexuaJes. energía, fuentes de carbono y dadores de electrones para
Las bacterias grampositivas también son capaces de la generación de energía se resumen en el cuadro 1-2.
tra~sferir material genético mediante un proceso conju-
gativo, pero esta transferencia no es realizada vía un pe- DIÓXIDO DE CARBONO
lo sino por una coagregación de los microorganismos en
respuesta a la producción de feromonas por parte de la Algunas bacterias son capaces de utilizar el C02 at-
bacteria dadora. Bajo la estimulación de estas feromonas, mosférico como fuente principaJ de carbono para reac-
la bacteria potencialmente receptora sintetiza una molé- ciones biosintéticas. La energía para catalizar esa utiliza-
cula receptora que es específica para una adhesina conju- ción puede provenir de la energía lumínica (bacterias fo-
gativa presente en la célula dadora. La agregación deter- tolitotróficas) o de la oxidación de moléculas inorgánicas
mina el establecimiento de conexiones célula-célula ne- (bacterias quimiolitotróficas). Los microorganismos que
cesarias para que ocurra la movilización del plásmido. requieren una fuente de carbono orgánica también re-

CUADRO 1-2. FUENTES DE ENERGÍA Y CARBONO DE LAS BACTERIAS

1ipos/ejemp/os • Fuentes de energía Fuente(s) de carbono Dadores de electrones

Fotolitotrofos Luz co, Compuestos inorgánicos (H 2S, S)

Bacterias sulfurosas verdes
Bacterias sulfurosas púrpuras

Luz Compuestos orgánicos Compuestos orgánicos

Fotorganot,vfos
(yCO 2)
Bacterias no sulfurosas
púrpuras

Quimiolitotrofos Reacciones de co, Compuestos inorgánicos (H 2,S,H 2S,

Bacterias generadoras de óxidorreducción S, Fe, NH 3)
hidrógeno, sulfurosas y
desnitrificadoras
Reacciones de Compuestos orgánicos Compuestos orgánicos (glucosa y
Quimioorganotrofos
óxidorreducción otros carbohidratos)
 22 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
quieren algo de CO para algunas vías de síntesis de ma-
cromolécu\as comi la biosíntesis de ácidos grasos. El
dióxido de c~bono para estas reacciones generalm~nt_e
es obtenido durante la degradación de sustrat?s orga~I-
cos que ocurre al mismo tiempo que las reacciones b10-
sintéticas.
OXIGENO
El requerimiento de oxígeno de una ?acteria particul~r
refleja el mecanismo utilizado-para satisfacer_ s~s necesi-
dades energéticas. En función de _s~s .reque~1m1entos de
oxígeno las bacterias se pueden d1v1dir en cmco ~r~pos.
Los anaerobios obligados crecen sólo en cond1c10nes
intensamente reductoras y para los cuales el oxígeno_es
tóxico. Los anaerobios aerotolerantes son bactenas
anaerobias que no mueren por la exposición al oxígeno.
Los anaerobios facultativos son capaces de crecer en
condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Los aerobios obli-
gados presentan un, requerimiento absoluto de oxígeno
para tener capacidad de crecimiento. Los microorganis-
mos microaerófilos crecen mejor en condiciones de ba-
ja tensión de oxígeno y tensiones altas de oxígeno pue-
den ser inhibitorias. En los aerobios obligados y los fa-
cultativos, la asimilación de glucosa tiene como resulta-
do final la generación de un radical libre superóxido
(0 2"). El superóxjdo es reducido a oxígeno gaseoso (0 2)
y peróxido de hidrógeno (Hi0 2) por la enzima superóxi-
do dismutasa. A continuación, el H20 2 tóxico generado
por esta reacción es convertido en agua y 0 2 por la enzi-
ma catalasa, que se encuentra en baeterias aerobias y fa-
cultativas, o por varias peroxidasas que se encuentran en
muchos anaerobios aerotolerantes.
NITRÓGENO
Los átomos de nitrógeno de biomoléculas importantes
(aminoácidos, purinas, pirimidinas) provienen de iones
amonio (NH4•). La generación de iones amonio comien-
za con la reducción del N2 atmosférico a NH/ (ion amo-
nio o amoníaco, NH3). El NH/ es entonces asimilado en
macromoléculas más complejas a través de compuestos
clave como el glutamato y la glutamina. Ciertas espe-
cies d<; bacterias (especies de Rhizabium, especies de
Azatobacter) y las algas verde-azuladas son capaces de
"fijar" N2 atmosférico en una forma orgánica utilizable
más rápidamente. Debido a la fuerza de los triples enla-
ces del N2, la fijación de nitrógeno requiere energía celu-
lar en la forma de adenosintrifosfato (ATP) y de un re-
ductor poderoso. pi proceso es catalizaqo por un comple-
jo multienzimático denominado complejo de l¡i nitroge-
nasa. E¡1 la mayoría de los microorganismos fijadores de
nitrógeno, la ferredoxina reducida es la fuente de electro-
nes:
N2 + 6e· + l 2 ATP + l 2 H,O 2 NH,+ + 12 ADP + 12 Pi· + 4 W
La capacidad para fijar nitróg¡;no es lograda principal-
mente por las bacterias que h¡¡.bitan el suelo mencionadas
antes. Sin embargo, algunas especies bacterianas que se
encuentran involucradas en enfermedades humanas, co-
mo algunas especies de Clpstridi~n y. K~ebsiella pnei!-
moniae, también son capaces de fiJ¡µ- mtrpgeno atmosfe-
rico.
Los iones amonio también pueden ser generados por_Ia
reducción de nitrato. Esto es realizado por dos mecams-
mos fisiológicos distintos. La reducc_ión asimilati~a de
nitratos es un proceso en el cual el mtrato es red_uc1do a
nitrito e hidroxilamina, que luego son convert1d~s en
amoníaco para su asimilación. La red~cción de_mtrato
no asimilativa tiene lugar cuando el mtrato func10na co-
mo un aceptar de electrones alternativo al oxígeno (res-
piración anaeróbica), donde los productos usuales son N2
0
NO . La asimilación de nitrato está ampliamente distri-
buida2 entre los microorganismos y requiere tanto de ni-
trito como de nitrato reductasas, mientras que la reduc-
ción no asimilativa de nitrato se observa sólo en bacterias
anaerobias y en bacterias anaerobias facultativas que cre-
cen con bajas tensiones de oxígeno (p. ej., en un caldo).
El amoníaco generado por estos mecanismos es incorpo-
rado en moléculas inorgánicas por la acción de las enzi-
mas glutamato deshidrogenasa, glutamina sintetasa y
ácido glutámico sintetasa (fig. 1-14). Los productos fi-
nales de estas reacciones son el ácido glutámico y la glu-
tamina, que luego serán piezas fundamentales utilizadas
en otras reacciones biosintéticas como la síntesis de va-
rios aminoácidos, purinas, pirimidinas y otros compues-
tos de nitrógeno necesarios (véase fig. 1-14).
FACTORES DE CRECIMIENTO
Estas sustancias promueven el crecimiento de los mi-
croorganismos y son provistas in vivo por varios líquidos
corporales y tisulares e in vitro en la forma de extractos
de levadura, sangre o productos derivados de la sangre.
Estos factores incluyen el complejo de la vitamina B, mi-
nerales, algunos aminoácidos, purinas y pirimidinas. El
complejo de la vitamina B tiene un papel catalítico den-
tro de la célula, y actúa tanto como componente de coen-
zimas o como grupo protésico de las enzimas. Los ¡ni-
croorganismos que no precisan de una fuente exógena d.e
un factor de crecimiento dado porque son capaces de sin-
tetizarlo ellos mismos se denominan prototróficos. Los
microorganismos auxotróficos precisan que se adicione
un factor de crecimiento al medio de cultivo para que el
crecimiento tenga lugar. Pequeñas cantidades de un nú-
mero de iones inorgánicos también son requeridos por
todas las bacterias. Además de nitrógeno, azufre y fósfo-
ro, que están presentes como constituyentes de compues-
tos biológicos importantes, el potasio, el calcio y el mag-
nesio frecuentemente se encuentran asociados con cier-
tos polímeros aniónicos. Los cationes magnesio divalen-
tes estabilizan los ribosomas, las membranas celulares la
pared celular y los ácidos nucleicos y también son ne~e-
sarios p~a la activid~~ de muchas enzimas ..El potasio es
necesar10 par~!ª act1v1da~ de una cantidad de enzimas y
s~ _concen~~c10~ en las celulas de las bacterias grampo-
s1t1vas esta mflu1da por el contenido de ácido teicoico de
la P~:d celul_ar. L~ mayoría de los microorganismos
tamb1en necesitan cm_c, _hierro, m<1nganeso, cobre y co-
balto. Algunos requenrmentos físicos para el crecimien-
to son _la tempe_ratura óptima de crecimiento, el pH y el
potencial de ox1dorreducción.
CINÉTICA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Durant~ el cre~imiento en un medio de cultivo líquido
las bactenas exhiben una curva de crecimiento uniforme'.
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 23

o
11
C-OH
1
C=O
1
H-C-H
1 u-cetoglutarato
H-C-H
1
C=O
1
OH Aminoácidos
GLUTAMATO NADPH 2 NH 3
DESHIDROGENASA
NADP....--- 1 -----.Hp
1
Transaminasas

o 1
11
C-OH
1
H-C-NH
1 2
o
11
H-C-H C-OH
1 1
H-C-H H-C-NH
1 1 2
Nf-1:i C=O H-C-H
1 1
OH H-C-H
Glutamato 1
C=O
Glutamina 1
sintetasa OH
ATP Glutamato

ADP+P7

o
11
e
1 NADP o
H-C-NH 11
1 2
NADPH 2
C-QH
1 .
H-9-H
C=O
H-C-H 1
1 H-C-H
C=O 1
1 H-C-H
NH 2 1
C=O
Glutamina 1
OH
u-cetoglutarato

Fig. 1-14. Metabolismo y asimilación de nitrógeno po_r medio d~ las enzimas glutamina sintetasa, glutamato deshidrogenasa y glutamato
sintetasa. Este sistema enzimático determina la formación de aminoácidos y otros compuestos.

cuando éste se expresa corno el logaritmo del número de sión c~lular. Esta tasa es influida por la temperatura, el ti-
bacterias a ¡0 largo del tiempo .. E? la figura . 1-15 se po de fuente de carbono utilizada, las concentraciones li-
muestra una curva típica de crec1n:1ento b~ct;n_ano. La rnitantes de varios nutrientes esenciales, los tipos de nu-
fase de retraso es un período de aJus_te fi~tolog1co y de trientes disponibles y la tensión de oxígeno o el potencial
" engranaJe . ,, durante el cual la. célula srntetJza redox. Durante la fase de declinación del crecimiento
. b , . nuevas en-
.
. f
z1rnas, co ac or
t es e interrnediartos meta o11cos esenc1a-
. · D
el crecimiento eventualmente cesa debido al agotamien~
lece el reservono de nutnentes. u- to de vario~ nutrientes del medio. Durante la fase esta-
1es y d on d e se e Stab . . · ¡ cionaria, el número de células viables ha llegado a un
ento del crec1m1ento comienza e
rante 1a fase d e aum .,
. . lar a medida que las tasas de reacc1on máximo y el número de los nuevos microorganismos que
crec1m1
. , ento
. ce 1uienzan a aproximarse
• a ¡as de¡ estado es- se producen es igual al número de células que mueren
e_nZt maucas com ,. d recimiento logarítmico debido a la ausencia de nutrientes. Durante la fase de
. . D ·ante la ,ase e c . . .
tac1 onan o. ui , . áximas de crecimiento y la dtv1- mu!!rt!!, las células comienzan alisarse y morir.
se observan Ias tasas m
 24 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

Fig. 1-15. Cinética del

crecimiento bacteriano .
....1

<(
a:w

w
o
oa:
w 4
:::!!:
,:::,
z
....1
2
11
(!)
g - + Fase de incremento del crecimiento
oLl-------.l10--------:::20';;-------~30:;-------;;
Fase de retraso TIEMPO (HORAS)

METABOLISMO BACTERIANO GENERAL sultado de la conversión del ácido 1,3-difosfoglicérico en

Y GENERACIÓN DE ENERGÍA
FERMENTACIÓN
El metabolismo bacteriano es un equilibrio dinámico
entre biosíntesis (reacciones anabólicas) y degradación
(reacciones catabólicas). Las reacciones catabólicas,
además de proveer las unidades más pequeñas para los
procesos biosintéticos posteriores, provee la energía para
"manejar" las reacciones biosintéticas. En este proceso,
la energía proveniente de la hidrólisis de uniones quími-
cas es capturada por las uniones fosfato de alta energía
del adenosintrifosfato (ATP). Estas uniones suministran
la energía para la activación y la continuación de otros
eventos bioquímicos. La pared celular bacteriana, las
proteínas, los ácidos nucleicos y otras macromoléculas
estructurales y regulatorias son sintetizadas con la utili-
zación de esta energía. El uso de carbohidratos por las
bacterias y las condiciones en las cuales sucede esta uti-
lización son la clave para la caracterización amplia de las
bacterias. En general, muchas pruebas empleadas en el
laboratorio de microbiología clínica involucran la detec-
ción de productos finales del metabolismo bacteriano en
medios de cultivo líquido agotados, tanto por medio de
indicadores de pH presentes en el medio como por cro-
matografía gas-líquido. La capacidad de un microorga-
nismo dado para producir ácido a partir de una variedad
de carbohidratos (p. ej ., maltosa, sacarosa, manitol, ma-
nosa, etc.) refleja la capacidad enzimática de estos mi-
croorganismos para convertir inicialmente estos carbohi-
dratos en glucosa, que es el punto de partida tanto para
el catabolismo aeróbico de los carbohidratos como el
anaeróbico.
La utilización de glucosa en condiciones anaeróbicas
se denomina fermentación. La fermentación ocurre vía
glucólisis, donde el ácido pirúvico o el piruvato son los
productos finales. En la fig~ra 1-16 se muestr~ el cami_no
glucolítico de glucosa a p1ruvato. _Est~ ~~no precisa
dos moléculas de ATP para fosfonlar m1c1almen(e a la
osa-6-fosfato y Juego a la fructosa-6-fos-
g 1ucosa en gluc 1 1 -1·1s1s
· e1
&
1ato en fru c osa 1,6 -di·&osfato
t 11 · Durante a. g uco
e boratono de rrucrobiología clínica. Las vías metabólicas
tos de este carrnno. orno re-
ATP se genera en d o S Pun
ácido 3-fosfoglicérico, la energía derivada de la oxida-
ción de un grupo aldehído es conservada como un enla-
ce fosfato de alta energía del ATP. La conversión de fos-
foenolpiruvato en piruvato determina la generación de
otra molécula de ATP. De este modo, se producen cuatro
moléculas de ATP por cada molécula de glucosa durante
la glucólisis por un proceso denominado fosforilación a
nivel del sustrato, lo cual determina una ganancia neta
de dos moléculas de ATP. Además de ATP, también se ge-
nera poder reductor debido a la producción de NADH2 a
partir del cofactor NAD (nicotinamida adenina dinucleó-
tido).
La glucólisis no es el único camino para el metabolis-
mo de los carbohidratos en la mayoría de los microorga-
nismos. Otros, como el de las pentosas fosfato y el de ·
Entner-Doudoroff, comienzan con una glucosa que es
convertida en ácido 6-fosfoglucónico. En el camino de
las pentosas, esta hexosa (6 carbonos) es convertida en ri-
bulosa-5-fosfato (5 carbonos) y C0 2 • A partir de este
punto, enzimas conocidas como transcetolasas y tran-
saldolasas convierten este precursor en varios azúcares
de 3, 4 y 5 carbonos. Estos carbohidratos servirán a su
vez como unidades básicas para la biosíntesis de precur-
sores de ácidos nucleicos. El camino de Entner-Doudo-
roff es utilizado por bacterias aerobias que carecen de ca-
pacidad enzimática para convertir fructosa-6-fosfato en
fructosa-1,6-difosfato por la vía glucolítica. En este ca-
mino, ~l_ácido 6-fosfoglucónico es deshidratado para ge-
nerar ac1do 2-ceto-3-desoxi-6-fosfoglucónico, el cual es
clivado para dar gliceraldehído-3-fosfato y piruvato. En
esp~cies de Neisseria y Pseudomonas, el piruvato es con-
vertido luego en etanol y C0 2 (véanse caps. 4 y 5).
UTILIZACIÓN DE PIRUVATO
El piruvato puede entrar en una variedad de caminos
para dar como resultado distintos productos finales . Es~
tos produc~os ~-nales h~n sido utilizados a menudo para
la cara~tenzac1_on de rrucroorganismos aislados en el la-
que se muestran en las figuras 1_17 y 1_18 incluyen:

Fig. 1-16. Vía glucolítica.
CH 20H
0
OH
HO Glucosa
C
H
ATP
ADP
G/ucosa-6-fosfato
Dihidroxia- 3-fosfog/iceraldehído
cetofosfato
Vía Nº 1: Fermentación homoláctica (homofermenta-
tiva). En esta ruta, la fermentación más simple, el úni-
co producto de la fermentación de la glucosa es el áci-
do láctico. No se forma gas. La fermentación horno-
láctica de la glucosa es característica de los estrepto-
cocos, los enterococos, los pediococos y los Iactoba-
cilos.
Vía Nº 2: Fermentación heteroláctica. El piruvato es
metabolizado a acetaldehído y etanol con liberación
de CO,. Esta vía metabólica se observa en especies de
Leucoñostoc, algunos.Jactobacilos y levaduras.
Vía Nº 3: Fermentación ácido mixta. En esta ruta me-
tabólica, el piruvato es metaboli~ado a di,st!ntos p_ro-
ductos (ácido acético, etanol, ácido succ1mco, ácido
fórmico). La naturaleza y la canti,dad de los distint~s
ácidos dependen de las caract_enst1cas de ~~da mi-
croorganismo. Todas las b~ct_edna~?e l_a fam 1ha Ente-
robacteriaceae producen ac1 o 1orm1co, e1 cua1 es
convertido en C02 Y 8 2· ., .
Vía Nº 4 : Fermentación butanod10l~ca. (En e? ta ru_ta, el
• J precursor de la acetoma acell 1met1 1car-
piruvato es e •d , d 'd
binol) que, en presencia d~ ,h1 droge;o, re uc1 .ª a
2 J-butanodiol. Esta re~cc10n e1r\ucc,o~ se rev1~r-
t; lentamente en condic10nes a ca mas; a acetoma
BACTERIOLOGIA BÁSICA 25
COOH
1
2 co Ácido pirúvico
1
CH 3
V--
2ATP
t-- 2ADP
COOH
1
2 COP03H2 Ácido fosfoenolpirúvico
11
CH 2
r--2Hp
Ácido 2-fosfoglicérico
Ácido 3-fosfoglicérico
Ácido 1,3-difosfoglicérico
s,intetizada puede detectarse por adición de a-naftol.
Esta es la base para el ensayo de Voges-Proskauer,
donde el a-naftol se utiliza en presencia de álcali pa-
ra detectar a la acetoína (prueba de VP). Esta nita es
I
característica del grupo Klebsiella-Enterobacter-Se-
rratia-Hafnia perteneciente a la familia Enterobacte-
riaceae. La conversión de parte del piruvato en
2,3-butanodiol disminuye la cantidad de ácido respec-
to del presente en la ruta ácido mixto y es responsable
de la reacción de rojo de metilo (RM) utilizada para
separar E. coli y microorganismos relacionados
(MR+NP-'-) del grupo Klebsiella-Enterobacter-Se-
rratia-Hafnia (MR-NP+).
Vía Nº 5: Fermentación ácido butírica. La formación
de ácido butírico es característica de los clostridios.
Dos moléculas de piruvato se condensan para formar
ácido acetoacético, el que luego es reducido a ácido
butírico. En algunas especies de Clostridium, canti-
dades variables de ácido butírico pueden ser reducidas
aun más a butano), acetona, isopropanol y etanol.
La cromatografía gas-líquido de los derivados obteni-
dos a partir de filtrados de medio de cultivo utilizado
por especies de Clostridium y Fusobacterium pueden
contener una variedad de productos finales que son
 26 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

CH,CH,COOH ½ Hexosa
Ácido propiónico

l
~1 -
~co,

HOOCCH,CH,COOH
Ca-0 H2 + CO 2

Ácido succínico
L::J-2[H]
j+2[H]
~pH

j+2[H] HCOOH

HOOCCCH,COOH co, CH 3CCOOH

11 11 (C<>AIJ;~ <ó<m<co
o o 3 COOH
ido acético
Ácido oxalacético 6
Ácido pirúvico
0
~ \__ 11

CH 3CS(CoA)
+4[H]
3
CH 3 CH 2OH
Etanol
+2[H] Acetil CoA

CO2 HCOOH CH 3 CCH 2COOH

CH 3-C-CH-CHa 11
CH,CHO CH 3 CHCOOH
11 1 o
11 1
OH O OH

l
Acetaldehído Ácido láctico

+2[H]

CH,CHOH
l
Acetoína

+2[H]
l
Ácido acetoacético

+n[H]

Etanol CH 3 CHCHCHa Ácido butírico

/ '-- Butanol
OH OH
Acetona
lsopropanol
J
+CO2
Butanodiol

Fig. 1-17. Destino del piruvato formado durante la fermentación anaeróbica.

útiles para la identificación de estas bacterias anaero-
bias a nivel de género y especie. , trones a lo largo de la cadena produce ATP. El oxígeno es
Vía Nº 6: Fermentación ácido propiónica. Esta es una
reacción cíclica donde se produce oxalato a partir de
CO2 y piruvato, y luego es reducido a ácido succíni-
co (succinato). La descarboxilación del succinato de-
termina la formación de ácido propiónico (propio-
nato). Esta reacción puede observarse entre especies
de Propionibacterium, que son bacilos grampositivos
anaerobios, no formadores de esporas.
La utilización de glucosa en condiciones aeróbicas se
denomina respiración (véase fig. 1-18). El piruvato pro-
ducido durante la fermentación entra en el ciclo de
Krebs, donde es degradado a CO 2 y H2O con generación
de ATP. La descarboxilación oxidativa del piruvato gene-
ra un intermediario de alta energía denominado acetil-
coenzima A, que se condensa con una molécula de oxa-
loacetato para generar citrato Y coenzima A libre. Se su-
cede luego una serie de reacciones oxidativas que rege-
neran el oxaloacetato y producen poder reductor en for-
ma de NAD reducido (NADH) o flavina adenina dinu-
cleótido (FADH) reducido. Estos compuestos de alta
energía entran luego en la cadena de transporte de elec-
trones donde los electrones transportados por estas mo-
lécula~ son transferidos a una serie de enzimas citocró-
micas. La energía generada por la transferencia de elec-
el aceptor final de electrones de la cadena transportadora
de electrones, cuyo producto final es agua. La oxidación
completa de la glucosa por la glucólisis anaeróbica y el
ciclo de Krebs produce una ganancia neta de 38 molécu-
las de ATP por mol de glucosa en comparación con las
2 únicas moléculas de ATP que se obtienen en la vía glu-
colítica (fermentativa) por cada mol de glucosa. Además
de la generación de ATP durante el metabolismo aeróbi-
co, el ciclo de Krebs también provee a la célula de pre-
cursores o compuestos intermediarios utilizados en la
biosíntesis de muchos otros c01;nponentes celulares, co-
mo las purinas, las pirimidinas, los aminoácidos y los lí-
pidos. El ciclo también ejerce la función catabólica de .
proveer una estructura para la degradación oxidativa de
las mismas macromoléculas.
PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA
BACTERIANAS
DEFINICIONES Y CONCEPTOS
Se co~sidera patogenicidad a la capacidad de un rni-
croorgamsmo de producir enfermedad. Los rnicroorga-
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 27

11202, CoASH II o
, JcH3CCOOH Piruvato

C02,H 200 o
11
CH 3C-SCoA Acetil coenzima A
Ácido
oxalacético COOH
1
CoASH
H20 C=O
1
11202
CH 2 COOH
1 1 Citrato

\~o
Ácido "-... COOH
COOH7 CH 2
málico 1 1
HC_OH Ho-C-COOH
1 1
CH 2 CH 2
1 1
/COOH COOH
H20 /
COOH
Ácido ?OOH 1
fumárico CH
CH
11 11
Neto: C-COOH
CH
1 1
CH 2

t
COOH 1

l?ººH
COOH Ácido cis-aconítico

COOH Hp
H20 CH 2 1
11
HC-OH
1
112Ü2 ?H2 HC-COOH
COOH 1
CH 2
Ácido
succínico 6ooH Ácido isocítrico
2 COOH
C0 ~ ? 0 0 H ,
C=O 6=o ~11202
1 ,
1
11202 CH HC-COOH O
1 2 ..___ ------- 1 H2
CH 2 CH 2
1 co2 6ooH
COOH
Ácido a-cetoglutárico Ácido oxalsuccínico

Fig. 1-18. Ciclo de Krebs de los ácidos tricarboxílicos.

nismos capaces de causar enfermedades en circunstan-
cias apropiadas se denominan patógenos. La virulencia
es el grado de patogenicidad dentro de un grupo o espe-
cies de microorganismos. La virulencia generalmente no
es atribuible a un solo factor sino que depende de muchos
parámetros relacionados con el microorganismo, e) hués-
ped y la interacción eritre _ambos. En g_eneral, la_virulen-
cia implica dos características de u~ m1croorg~n_1s~o pa-
tógenp : su infecciosidad (la capac1?~~ para m1~1ar una
infección) y la severidad de la cond1c1on pro~uc1da. Ce-
pas altamente virulentas, moderadamen_te virulentas y
avirulentas pueden encontrarse en espec1e_s o grupos ~e
microorganismos que en general son considerados pato-
genos . . .
La infección de un huésped por u~ ,m1croorgamsmo es
una etapa necesaria para la g_e,nerac1?n de una enferme-
dad . A pesar de el!º• l~_infecc1on no, siempre ca~sa enfer-
olomzac1on de un huesped por m1croorga-
d d La C
::mª0¡ de la flora normal es, en un sentido amplio, una
infección. Los microorganismos de la flora normal se es-
tablecen dentro del huésped y sobre él tempranamente y
persisten a lo largo de toda la vida de ese huésped. Cuan-
do se genera una disminución en los mecanismos de de-
fensa del huésped, los microorganismos endógenos pue-
den causar patologías y enfermedades. Aunque ciertos
microorganismos siempre se encuentran asociados con
una patología (p. ej., Neisseria gonorrhoeae), otros
(p. ej., Neisseria meningitidis) aparentemente causan en-
fermedades sólo :n
ciertas circunstancias.
REQUERIMIENTOS PARA LA PATOGENICIDAD
El primer paso para el establecimiento de un proceso
infeccioso está dado por la capacidad de un microorga-
nismo para introducirse en un huésped e iniciar una in-
fección. El contacto inicial depende de la capacidad de
un microorganismo para adherirse y sobrevivir en las su-
perficies mucosas del huésped. Algunos se unirán a su-

28 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
perficies epiteliales sin invadir tejidos más profundos. En
estos casos, una(s) toxina(s) elaborada(s) por el microor-
ganismo generalmente es la responsable de la patología.
Bordetella pertussis y Vibrio cholerae son ejemplos de
este tipo de microorganismos. Algunos microorganismos
¡
se adhieren a las células epiteliales de las mucosas y lue-
go atraviesan esta barrera. La multiplicación ulterior de
los microorganismos en tejidos subepiteliales causa des-
trucción tisular. Otros más invasores pueden adherirse,
1
1 atravesar la superficie epitelial, multiplicarse y extender-
se hacia tejidos más profundos. Estos microorganismos
eventualmente pueden acceder al torrente sanguíneo y
causar infección generalizada o diseminada. Algunas es-
pecies bacterianas, como las micobacterias y las bruce-
las, se adhieren, invaden, se multiplican y se adaptan pa-
ra continuar su existencia dentro del huésped, en general
dentro de las células del sistema reticuloendotelial.
Muchos microorganismos presentan alta especificidad
respecto del tipo de tejido que infectan. Por ejemplo,
Neisseria meningitidis pi.Jede encontrarse como un habi-
tante normal de las fauces pero puede invadir las menin-
ges y el torrente sanguíneo. Streptococcus pneumoniae
también puede habitar las fauces y la nasofaringe, pero
invade preferencialmente el tracto respiratorio cuando
causa enfermedad. La especificidad de tejido puede estar
relacionada con la presencia de receptores específicos
para la adhesión bacteriana o de nutrientes (p. ej., algu-
nos aminoácidos, iones o carbohidratos). Un ejemplo
clásico de esta dependencia nutricional se puede obser-
var en Brucella abonus, la causa de los abortos contagio-
sos entre el ganado. Este microorganismo tiene un reque-
rimiento específico del alcohol azúcar eritritol para su
crecimiento, azúcar que se encuentra presente en altas
concentraciones en los tejidos uterinos y placentarios bo-
vinos. Por lo tanto, est~ microorganismo se establecerá
en el tracto genital bovino debido a esa preferencia nutri-
cional.
FACTORES DE VIRULENCIA DE LOS MICROORGANISMOS
ADHESINAS
Para infectar a un huésped, los microorganismos pri-
mero deben adherirse a la superficie de las mucosas. La
ª?herencia_bacteriana generalmente es un proceso espe-
cifico que mvolucra estructuras de la superficie bacteria-
na, conocidas como adhesinas, y receptores comple-
mentarios en la superficie de las células susceptibles. Las
adhesinas bacterianas incluyen fimbrias, componentes de
la cápsula bacteriana, ácidos lipoteicoicos que se proyec-
tan por fuera del peptidoglicano de la pared celular de las
bacterias grampositivas u otros antígenos de superficie.
Ejemplos específicos de adhesinas bien caracterizadas en
microorganismos patógenos incluyen .a las fimbrias ad-
herentes de Neisseria gonorrhoeae, las fimbrias manosa-
resistentes y manosa-sensibles de E. coli uropatógena y
enteropatógena y los ácidos lipoteicoicos de los estrepto-
cocos P-hemolíticos del grupo A.
AGRESINAS
Para sobrevivir y multiplicarse dentro de un huésped,
muchos microorganismos producen una variedad de sus-
tancias que les permiten evadir los mecanismos de defen-
l
sa del huésped. Estas sustancias, denominadas agresi-
nas, incluyen cápsulas y sustancias visco~as ex1!acelula-
res, proteínas y carbohidratos de superficie, enzimas, to-
xinas y otras moléculas pequeñas. Las estructuras caps_u-
lares de algunas bacterias permiten a los rnicroorgams-
mos escapar de la fagocitosis al evitar la interacción en-
tre la superficie celular bacteriana y la célula fagocítica o
bien por ocultamiento de componentes de la superficie
celular bacteriana que de otro modo podrían interactuar
1
con las células fagocíticas y llevar a su ingestión. Anti-
cuerpos dirigidos específicamente contra el material cap-
sular llevan a la opsonización de los microorganismos.
Luego de la opsonización, las bacterias encapsuladas son
rápidamente ingeridas y destruidas por las células fago-
cíticas. Entre los microorganismos que presentan cápsu-
las de polisacárido que se comportan como agresinas se
encuentran Streptococcus pneumoniae, Neisseria menin-
gitidis, Haemophilus influenzae de tipo b, Klebsiella
pneumoniae y estreptococos ~-hemolíticos del grupo B.
Algunas bacterias poseen sobre su superficie proteínas
o enzimas que desempeñan un papel en la adherencia y
que también contribuyen a la virulencia microbiana en
otras formas. Por ejemplo, la proteína M de estreptoco-
cos ~-hemolíticos del grupo A tiene múltiples efectos
sobre el sistema inmune del huésped, que incluye dismi-
nución de la función del complemento y de los efectos lí-
ticos de los polirnorfonucleares. La proteína A es una
proteína de la pared celular de Staphylococcus aureus y
es capaz de unirse a las moléculas de inmunoglobulina
(lgG) por su porción Fe. Dado que la fagocitosis media-
da por anticuerpos (es decir, por opsonización) es depen-
diente de un receptor para Fe, la proteína A puede inter-
ferir con este proceso. La presencia de proteína A tam-
bién puede inhibir la activación del complemento desen-
cadenada por estafilococos por enmascaramiento de las
moléculas del peptidoglic,ano que se sabe que tienen ac-
tividad activadora del complemento. Algunas bacterias
pueden producir una proteasa que es capaz de hidrolizar
e inactivar a las inmunoglobulinas secretoras (lo A). Esta
inmunoglobulin~ actúa localmente para preve~ la adhe-
rencia bacterian~; por lo tanto, la hidrólisis de IgA por
proteasas bactenanas favorece la colonización de las mu-
cosas.
Al~un~s agre~inas actúan luego de que ha ocurrido la
fagoc1t~s1s por mterferencia con la fusión del fagosoma
con el ,hsosoma y con la actividad del sistema de mielo-
peroxidasa. L8$ micobacterias y las brucelas se pueden
adaptar a una existencia intrac.elular dentro de.las células
de) huésped medi_8:Ilte la e_laboración de sust~cias que
evitan_ la destrucc1on de lll!Croorganismos. En las mico-
b~ctenas, esto se debe a la presencia.de sulfolípidos aso-
ciados con la pared que se incorporan a la cara más inter-
~a de los fagosomas y evitan la fusión del fagosoma y el
hsosoma. Otros micr,oorganisi:nos, como Listeria mo-
nocytogenes y Staphylococcus, aureus, secretan, enzimas
como c~~asa y ~uperóxido dismutasa que inhiben·la
des~cc1on del ~croorganismo vía el sistemª rnielope-
rox1dasa de las celul~~ fagocíticas. La residencia dentro
de la_s, células_fagoc1t1cas mediante estos mecanismos
tambten ~ontribuye a la virulencia al proteger a los mi~
croorgarusmos de la destrucción específica por anticuer-
~os y comJ?lement?. Una existencia intracelular también
llene gran
• mfluencia
. en las- terapéut1·cas • Las m,ecc1ones
. & •
por m1croorgamsmos como especies de Brucella y Fran-

cisella tularensis. deb en ser tratadas con antibióticos ca-
paces de actuar mtrac 1 1 . tores R (plásmidos que contie~e? ge~es que codifican
· , 'd e u armente (es decir tetraciclinas
ammog1ucos1 os) par t .' ' para la resistencia a agentes antnmcrobianos) pue~e~ _s~r
" t "d ,,
pro eg1 os .
ª a ectar a estos microorganismos
Muchas. bacterias pro ducen enzimas . o toxinas o po-
seen constituy:ntes celulares que tienen efectos tó~icos o
necrosantes
, d directos en las ce'lul as m. fl amatorias
. de1
huespe_ .Y en otros componentes del sistema inmune. Las
leucoc1dmas producidas ., s
por tap hy1ococcus aureus pro-
vocan desgranula~mn, e?ema y lisis de células polimor-
fonuc_leares. Los hpopohsacáridos de las bacterias gram-
negati~as pueden demorar o disminuir la respuesta infla-
matona aguda, lo cual permite que el microorganismo se
establez~a dentro del huésped con relativa facilidad. Al-
gunos nucroorgan\smos tienen propiedades de superficie
que los hacen resistentes a los efectos bactericidas del
s~ero _hu~~o normal. Esta propiedad puede facilitar la
d1semmac1?n ?: la bacteria a través del torrente sanguí-
neo .Y, los_ h~fa~1cos y conducir a la irrupción de una in-
fecc1on s1stenuca o al establecimiento de focos infecta-
dos en sitios distantes del de infección inicial. Algunos
de estos componentes confieren resistencia a los efectos
antibacterianos de las proteínas lisosómicas como lisozi-
ma, lactoferrina y proteínas catiónicas.
~as_ propiedades invasoras de algunas bacterias son
atnbu1das a la elaboración de enzimas que actúan extra-
celularmente. Muchas bacterias patógenas grampositi-
vas, co~~ Staphylococcus aureus y los estreptococos
P-h~moht1cos del grupo A producen hialuronidasa, una
enzima que promueve la diseminación de microorganis-
mos a través del tejido conectivo mediante la despolime-
rización del ácido hialurónico, la sustancia responsable
de la adherencia entre células. Los estreptococos del gru-
po A y los estafilococos también pueden elaborar enzi-
mas que hidrolizan las coágulos de fibrina (estreptoqui-
nasa y estafiloquinasa) y facilitan la diseminación de mi-
croorganismos en los tejidos. Clostridium histolyticum,
Clostridium perfringens y Clostridium septicum produ-
cen colagenasas que destruyen la matriz de colágeno de
la matriz muscular y del tejido conectivo y facilitan la pe-
netración de microorganismos dentro de estos tejidos pa-
ra causar fascitis necrosante y gangrena gaseosa.
La mayoría de las bacterias patógenas producen side-
róforos, pequeñas moléculas secretadas por el microor-
ganismo, que capturan el hierro del huésped durante la
infección. El hierro se requiere para la virulencia en va-
rias bacterias. La producción de sideróforos se considera
un factor de virulencia ya que algunos de ellos aparente-
men,te protegen a lo_s microorganismos de l~s efectos le-
tales del suero humano normal. Son producidos por una
oran variedad de microorganismos e incluyen Enterobac-
reriaceae (enterobactinas), especies de Neisseria (go-
nobactinas y meningobactinas), especies de Micobac-
terium (micobactinas) y especies de Pseudomonas (pio-
quelinas). Además, la producc!ón de vari?s productos
bacterianos extracelulares, mcluidas las toxmas, es regu-
lada parcialmente por la con~~ntración de hierro del en-
torno. Por ejemplo, la expres10n del gen estructural de la
toxina diftérica del fago P en células lisogenizadas de
Corynebacterium diphtheriae depende de los niveles de
hierro.
Aunque algunos plásmidos en sí mismos no son facto-
res de virulencia, los genes que codifican para muchos
produ ctos bacterianos responsables de virulencia fre-
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 29
cuentemente residen en plásmidos bacterianos. Lo~ fac-
considerados factores de virulencia porque la adquis1c10_n
de resistencia a agentes antimicrobianos ayu?a al ~reci-
miento continuo y a la diseminación de las mfe~c1?nes
microbianas a pesar de las intervenciones ~erapeut1cas.
Algunas bacterias también contie?:n P!~snudos que co-
difican para pili sexual y la ~ovd1zac10!1 de cro~oso-
mas. Estos dos factores permiten a los m1croorgamsmos
transferir el material genético (ya sea de plásmidos, cro-
mosómico o ambos) a otros microorganismos. Los plás-
midos también pueden llevar genes que codifican para
antígenos de colonización, resistencia a s~~ro, transpo~e
y quelación del hierro, toxinas y ~rodu_cc!on de hem~h-
sinas, y otras funciones de supervivencia mtracelular m-
definidas. Shigella, Salmonella, Yersinia y cepas de
E. coli "tipo Shigella" contienen plásmidos que se sabe
que contribuyen a su virulencia.
EXOTOXINASY ENDOTOXINAS
Las toxinas de origen microbiano se pueden dividir en
dos grupos: las endotoxinas y las exotoxinas. Las exo-
toxinas bacterianas son las toxinas biológicas más poten-
tes conocidas. Las exotox.inas son producidas fundamen-
talmente por bacterias grampositivas, aunque algunas
gramnegativas también son capaces de elaborarlas. Las
exotoxinas son, en general, de naturaleza proteica y ter-
molábiles. Dado que son proteicas, muchas pueden ser
inactivadas o destruidas por enzimas proteolíticas. Algu-
nas exotoxinas sólo se activan después de una hidrólisis
parcial ("nicking") ~or enzimas proteo!íticas (véase más
adelante). La actividad tóxica de muchas exotoxinas pue-
de ser destruida por tratamiento con formaldehído (desa-
rrollo del toxoide) y neutralizada por anticuerpos especí-
ficos. La explotación de estas propiedades conduce al de-
sarrollo de los toxoides diftérico y tetánico que son utili-
zados ,para la inmunización activa contra la difteria y el
tétanos, respectivamente. En el caso del tétanos, el botu-
lismo, la difteria y el cólera, los signos y síntomas de es-
tas enfermedades se deben enteramente a los efectos de
las toxinas elaboradas por estas bacterias.
El tétanos se debe a los efectos sistémicos de la teta-
nospasmina, una toxina producida por Clostridium teta-
ni. La tetanospamina es liberada con la lisis de las célu-
las después del crecimiento de la bacteria en condiciones
anaeróbicas (p. ej., en heridas punzantes profundas). La
toxina es producida inicialmente como un péptido simple
(PM = 160.000 daltons). Al ser liberado de la célula, el
péptido es "cortado" por enzimas proteolíticas para for-
mar dos cadenas polipeptídicas conectadas por puentes
disulfuro. En condiciones reductoras, los dos péptidos se
separan en una cadena pesada (P) (PM = l07.000) y una
liviana (a) (PM = 53.000). El sitio de unión al receptor
de la molécula intacta de toxina reside en la cadena p. La
cadena a se intemaliza y se mueve desde los nervios pe-
riféricos hacia el sistema nervioso central (CNS) por re-
trotransporte axonal. Esta toxina actúa por bloqueo de la
inhibición presináptica del CNS y causa parálisis espás-
tica, tétanos y convulsiones generalizadas. La toxina es
elaborada en las heridas punzantes, durante el crecimien-
to anaeróbico de Clostridium tetani. Cuando la toxina te-
tánica llega al CNS (médula espinal y cerebelo) se fijará-
 30 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
pidamente a su receptor, un gangliósido que contien~ áci-
do esteárico, esfingosina, glucosa, galactosa, _N-ac~t1(glu-
cosamina y ácido N-acetilneuramínic? (ácido s1áhco).
Los efectos espasmogénicos de la toxma s~ deben a su
acción sobre los reflejos presinápticos que mvolucran a
las intemeuronas en la médula espinal. La toxina bloquea
la inhibición postsináptica normal de la ~eurona e~pinal
motora que sigue a impulsos aferentes evitando la (ib:r~-
ción de los inhibidores de neurotrasmisores (es decrr, ac1-
do gammaaminobutírico, glicina). La sensibilidad resul-
tante de los impulsos excitatorios, no co~n:olado~ ~or
mecanismos inhibitorios, produce una paráhs1s espastJca
generalizada característica del _tétanos. . ., .
El botulismo es consecuencia de la mgest10n de t9x1-
nas formadas por Clostridium botulinum, que crecé en
los alimentos, y los principales vehículos son frutas y ve-
getales enlatados en forma inapropiada (generalmente
conservas caseras), condimentos ·y productos derivados
del pescado. La contaminación de heridas está asociada
con una infección no invasora y con formación de toxi-
nas (botulismo de las heridas). Clostridium botulinum
también puede colonizar el tracto intestinal de los niños
y producir toxinas en ese sitio (botulismo infantil). La to-
xina se acumula en células de Clostridium botulinum du-
rante la germinación de la espora y del crecimiento acti-
vo vegetativo, pero es liberada junto con la lisis de las cé-
lulas. Los siete tipos serológicos de C. botulinum son los
tipos A, B, C-a, D, E, F y G y cada uno produce una to-
xina inmunológicamente específica de tipo. Las toxinas
de los tipos A, B, E. y F afectan al hombre. Estas toxinas
son agregados de dbs o más clases de proteínas. La toxi-
na botulínica es producida como una proteína progenito-
ra con un peso molecular de 150.000 daltons. Estas toxi-
nas son producidas como moléculas inertes que se acti-
van después de sufrir proteólisis, pero el clivaje proteolí-·
tico es interno en las moléculas del péptido y las toxinas
no cambian su peso molecular después de la activación.
Después de la absorción del tracto gastrointestinal, la to-
xina alcanza las neuronas susceptibles (en la unión neu-
romuscular y en las sinapsis autónomas periféricas) vía
el torrente sanguíneo. Allí se une a las terminales presi-
nápticas, donde bloquea la liberación de acetilcolina de
las terminaciones nerviosas motoras colinérgicas. Los
síntomas incluyen debilidad, mareos, náuseas, visión bo-
rrosa, alteraciones del habla, dilatación de las pupilas, re-
tención urinaria, parálisis general fláccida de los múscu-
los esqueléticos y parálisis respiratoria.
La difteria es otro ejemplo de enfermedad causada pri-
mariamente por la acción de una toxina. Es interesante se-
ñalar que sólo aquellas cepas de Corynebacterium dipht-
heriae que contienen bacteriófagos lisogénicos (el corine-
fago P) son capaces de producir la toxina diftérica. Los
·genes estructurales para la toxina (llamados genes tox)
son parte del genoma del bacteriófago. La molécul¡¡. de la
toxina es formada por C. diphtheriae en asociación con la
membrana celular y es secretada de la célula como un
péptido único con un peso molecular de alrededor de
63.000 daltons. Luego de una proteólisis .suave, el pépti-
do es clivado en dos grandes cadenas, designadas A y B,
que están conectadas po~ p~e?tes disulfµr~. El pépti~o
contiene la actividad enz1mat1ca d~ la molecula que mh1-
be las proteínas de síntesis; el pépt1do B es responsable de
la unión de la molécula de toxina a su recep~or blanco. En
la unión con la célula blanco, los puentes d1sulfuro se re-
ducen y el péptido A (PM = 24.000 daltons) entra en la
célula. El péptido A inhibe la síntesis de proteínas me-
diante la adenorribosilación del factor de el~ngación 2
(EF-2), una enzima que es requerida para la tran~locac!~n
del polipeptidil-tRNA desde el sitio aceptor hacia el sltl_o
dador en el ribosoma de un eucariota. El grupo adenom-
bosil (ADPR) es transferido de nicótinaoúda adenina
dinucleótido (NAD) al EF-2 por la subunidad A de la to-
xina, que resulta en un EF-2 inactivo.
péptido de la toxina
NAD• + EF-2 A complejo ADPR:EF-2
+ nicotinamida + H•
El tratamiento de la toxina intacta con formol da como
resultado un toxoide que no puede ser dividido e,n las
subunidades A y B. Por lo tanto, el toxoide carece de la
capacidad para generar los efectos intracelulares tóxicos,
aunque retiene su antigenicidad: La inmunidad con~a la
difteria generalmente está mediada por la presencia de
anticuerpos contra la toxina.
Todos los signos y síntomas del cólera, enfermedad
causada por Vibrio cholerae resultan de la rápida ¡Det,dida
de líquidos del intestino. El incremento-de _la secrec_ión
de electrólitos es causado por una enterotoxma proteica.
La enterotoxina (PM = 84.000 daltons) consta de una
subunidad de unión (s.ubunidad B) q1,1e está compuesta
por cinco monómeros idénticos (PM = 11.500 daltons
cada uno) y de una subunida,r activa, la subunidad A (PM ·
= 27.000 daltons). El modo.de acción de la toxina colé-
rica se describe en el capítulo·6.
Las endotoxinas ·son · producidas sólo por bacterias·
gramnegativas y son principalmente lipopolisacáridos
(LPS). El LPS, como se describió antes, es un compo-
nente estructural de la membrana externa de las bacterias
gramnegativas, representa el determinante antigénico -so-
mático (0). Las endotoxinas son estables al calor, no son
detoxificadas por tratamiento con formaldehído y s-on só-
lo parcialmente neutralizadas por anticuerpos específi- .
cos. Comparadas con muchas de las exotoxin,as, las en-
dotoxinas tienen una toxicidad relativame_nte baja. ~un-
que las endotoxinas pueden escapar a los Iíquidos-circ.un-
dantes (como invaginaciones en la mémbrana externa.de
las bacterias grarnnegátivas), la célula completa gener.al-
mente retiene la mayor porcióo de la actividad tóxica.
Las actividades biológicas y tóxicas de las endotoxinas
son amplias. Nanogramos de una endotoxina causan fie-
bre en el hombre y la liberación de pirógenos endógenos.
Dosis mayores causan hipertensión, disminuc.ión del nú-
mero de polimorfonucleares y plaquetas por el aumento
de la i;narginación de estas células en los-pequeños vasos
sanguíneos, hemorragia y a veces coagulación intrav.as-
cular diseminada, debido a la activación de los mecanis-
mos de la coagulación. Las endotoxinas también son mi- '
togénicas para los linfocitos B y estimulan la liberación
de varias citoquinas de los macrófagos. . _ "'.. ·
AVANCES TECNOLÓGICOS
EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
~a mayor parte de :ste libro trata de microorganismos
patogenos Y de los metodos para su identificación. Aun-

que l_as estrategia~ _convencionales para la identificación
~P- eJ., f~r~entac1on ?~ azúcares, detección química de
mtermed1anos m~tabo!tcos, etc.) aún son válidas y útiles,
ahora hay otras disponibles. Con la introducción de prue-
bas _"convencionales modificadas" y pruebas rápidas con
enzimas con sustratos cromógenos a fines de la década
d~ 1960, el desarrollo de sistemas de preparados comer-
ciales que usan estas pruebas para la identificación de
Enterokacteriaceae (p. ej., la tira original de API) y la in-
troducción de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
para su instrumentación (el viejo sistema AutoBac de
Pfizer), los "métodos rápidos" y "los informes rápidos"
s_e han transformado verdaderamente en un objetivo fac-
tible para los laboratorios de microbiología clínica. Estos
métodos no sólo han disminuido el tiempo de espera de
1
t-:.. r · los resultados para los pacientes sino que han incremen-
tado la relevancia clínica de la información provista por
l cada laboratorio. Un bacilo gramnegativo recuperado de
i aminopeptidasa. Los sustratos para las glucosidasas habi-
un cultivo de sangre a las 9 AM puede ahora ser identifi-
cado, junto con su susceptibilidad a los antibióticos, alre-
dedor de la 1 PM del mismo día, en lugar de las 24 a
48 horas necesarias con los métodos convencionales. Si-
guiendo esta pequeña incursión en las prácticas pasadas,
las·nuevas tecmologías para uso en los laboratorios de mi-
crobiología clínica han literalmente estallado. La próxi-
ma sección de este capítulo se refiere a los avances tec-
nológicos en t~nos generales. Métodos rápidos y es-
pecíficos y aplicaciones de nuevas tecnologías se descri-
·ben en aquellos capítulos qué tratan microorganismos es-
pecíficos y las enfennedades asociadas con ellos.
~ÉTODOS RÁPIDOS oÉ' .ioENTIFIC:ACIÓN/DETECCIÓN
BACTERIA"fA
En contraste con el uso de procedimientos convencio-
nales dependientes de crecimiento para la identificación
bacteriana, el uso de pruebas con sustratos cromógenos
de enzimas permite al laboratorio identificar con certe~a
y rápidamente muchas especies de microorganismos.
Los sustratos cromógenos de enzimas detectan enzimas
preformadas en las bacterias y penniten la identificación
de microorganismos específicos en comparación con el
crecimiento en medios selectivos o diferenciales, de las
características de las colonias y la mÓrfología celular en
un extendido teñido con coloración de Oram. Estas nue-
vas pruebas podrían emplearse, junto con las tradiciona-
les, como las de la catalasa y la oxidasa, para proveer
identificación presuntiva y certera de microorganismos
clínicamente significativos. La cromatografía gaseosa y
varias rnodificaciones de esta técnica pueden ser utiliza-
. das para detectar productos bacterianos específicos di-
rectamente en especímenes clínicos ó' para proveer infor-
mación secundaria para los niveles de género y especie
en una identificación bacteriana.
PRUEBAS_CQJII SUSTRATOS CROMÓGENOS
D E.E;NZIMAS .
Los análogos de sustratos de enzimas para la identifi-
cación bacteriana no son un concepto nuevo en los siste-
mas de identificación de bacterias. La prueba "clásica"
;para esta tecnología es la prueba del ONPG para la de-
.tección de p-galactosidasa, en la cual un compuesto in-
coloro, el o-nitrofenil-P-o-galactopiranósido es hidroli-
BACTERIOLOGfA BÁSICA 31
zado y la porción o-nitrofenol coloreada de amarillo es
liberada. La síntesis de muchos otros compuestos incolo-
ros que liberan productos coloreados de la hidrólisis, tan-
to en forma directa como luego de la adición de un reac-
tivo de desarrollo, ha revolucionado la identificación rá-
pida de especies bacterianas merced a la detección de ca-
racterísticas enzimáticas fenotípicas. Otros sustratos cro-
mógenos pueden generar productos finales coloreados
cuando son reducidos u oxidados por enzimas bacteria-
nas. Las "pruebas clásicas" de esta categoría incluyen las
de la citocromo oxidasa y de la reducción de nitratos. En
el cuadro 1-3 se presenta una lista de categorías genera-
les de enzimas bacterianas, los sustratos empleados para
su detección y las reacciones enzimáticas que dan como
resultado un punto final observable.
Los sustratos enzimáticos más utilizados para la iden-
tificación bacteriana son los de las enzimas glucosidasa y
tualmente son varios tipos de monosacáridos y disacári-
dos unidos a ortonitrofenol o paranitrofenol. En la hidró-
lisis por glucosidasas específicas para un grupo de carbo-
hidratos o para un carbohidrato en particular, el -residuo
nitrofenol de color amarillo es liberado. Los sustratos pa-
ra las aminopeptidasas generalmente son derivados de
aminoácidos como la p-nitroanilida o la ~-naftilamida. La
hidrólisis de la p-nitroanilida libera p-nitroanilina, un
compuesto amarillo que es detectado directamente. La
~-naftilamina que es liberada por hidrólisis enzimática de
análogos de aminoácidos naftilaminados es detectada por
el agregado de un colorante diazo incoloro acoplante co-
mo el p-dimetilaminocinamaldehído, que determina la
formación de un producto final de color rojo o rosado.
Con el uso de estos sustratos se han desarrollado prue-
bas rápidas que se emplean en muchos laboratorios para
la identificación de bacterias específicas. Una de estas
pruebas es la de la pirrolidonilarilamidasa (PYR). Una
vez que el carácter hemolítico de un aislado estreptocó-
cico ha sido determinado, esta prueba se utiliza para
identificar tanto los estreptococos del grupo A como a es-
pecies de Enterococcus (véase cap. 12). Los estreptoco-
cos P-hemolíticos PYR positivos son estreptococos del
grupo A, mientras que los estreptococos no hemolíticos o
a-hemolíticos PYR positivos son enterococos. 288 •292 La
identificación específica de especies patógenas de Neis-
seria también prrede ser realizada con pruebas que utili-
zan sustratos cromógenos. Si un diplococo grarnnegati-
vo, oxidasa positivo, se recupera de un agar Thayer-Mar-
tin modificado (MTM) y produce sólo prolilarninopepti-
dasa, el microorganismo ·puede ser identificado como
Neisseria gonorrhoeae. De igual modo, la demostración
de una actividad ~-galactosidasa en un microorganismo
con la misma morfología y que también crece en un me-
dio MTM descarta a un gonococo y permite la identifica-
ción de Neisseria lactámica (véase cap. 10). 109-116
Las pruebas que emplean sustratos cromógenos y
pruebas "convencionales" modificadas han sido combi-
nadas en sistemas comerciales que permit~n la identifica-
ción de una variedad de especies bacterianas. Estos siste-
mas son de uso corriente en laboratorios clínicos de todo
el mundo. Este estado de la tecnología se encuentra diri•
gido a proveer identificaciones bacterianas rápid~s, es-
tandarizadas y reproducibles. Por ejemplo, el sistema
RapID NH (Innovative Diagnostic Systems, Atlanta,
GA), la tarjeta Vitek NHI (bio Merieux-Vitek, Inc., Ha-
z;
32 DlAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

CUADRO 1-3. ENZl~IJ\S BAC' 1ERIANAS Y i\lODOS DE ACCIÓN SOBRE VARIOS SUSTRATOS CROMÓGENOS
L k ...... ..... .u..-., w . . : . c ~ ~ ~ - i . - . W ! c - -~~u=---
Clase de enzima Modos de acción
Enzimas específicas
9xidorreductasas Citocromo oxidasa La tetrametil-p-fenilendiamina re_acciona directamente
con el citocromo c para produclí un compuesto de color
azul (véase cap. 16). . .
Nitrato reductasa El nitrato es reducido primero a nltnto. Luego se usan
dos reactivos: ácido sulfanílico que reacciona con el ni-
trito para formar una sal de diazonio; a-naftilamina que
actúa como un colorante diazo acoplado que da color
rojo (véase cap. 53).

Deshidrogenasas Reasuzurina Muchos colorantes carecen de color cuando se encuen-

Tetrazolio tran en estado reducido; sin embargo, con la pérdida de
iones hidrógeno (oxidación) desarrollan complejos co-
loreados. Estos compuestos se reducen por enzimas li-
gadas a flavinas de sistemas de transporte bacteriano.

Hidrolasas de aminoácidos Triptofanasa La hidrólisis del triptófano rinde indo!, el cual puede ser
detectado por observación del color rojo que se desarro-
lla al agregar p-dimetilarninobenzaldehído

Glucosidasas Análogos de carbohidratos cromógenos: Las moléculas con residuos ortonitrofenil se unen a va-
Ortonitrofenil-~-o-galactopiranosidasa rios carbohidratos a través de unión éster: la hidrólisis
(ONPG) conduce a la liberación del compuesto ortonitrofenol
coloreado de amarillo.

Aminopeptidasas Análogos cromógenos de aminoácidos Hidrólisis del aminoácido p-nitroanilida libera un ami-
unidos a p-nitroanilina o ~-naftilamina noácido libre y el cromóforq amarillo p-nitroanilina; se
requiere un colorante diazo acoplado para detectar
~-naftilamida.

zelwood, MO) y el panel HNID (Dade/Microscan, West
Sacramento, CA) proveen la identificación de especies
de Neisseria, Haemophilus y una variedad de otros baci-
los gramnegativos exigentes para el cultivo en 4 horas
(véanse caps. 7, 8 y 10). 114•115 Se puede realizar una iden-
tificación confiable de bacterias anaerobias clínicamente
significativas con el RapID ANA II (lnnovative Diagnos-
tic Systems), el sistema An-IDENT (bio Merieux-Vitek,
Inc., Hazelwood, MO) y la tarjeta de identificación de
anaerobios (ANl) Vitek. 41 •208 •227 Esta tecnología también
ha sido aplicada a la identificación de levaduras y hongos
símil levaduras clínicamente significativos. 134·199 Todos
estos sistemas usan una amplia batería de sustratos enzi-
máticos para las glucosidasas y las aminopeptidasas para
obtener un "perfil" enzimático característico. La compa-
ración, en una base de datos computarizada, de los perfi-
les obtenidos a partir de las reacciones de aislados indi-
viduales de un gran número de cepas permite realizar una
identificación específica en 4 horas. Algunos sistemas
comerciales, como el Rapid Strep (bio Merieux-Vitek,
lnc. Hazelwood, MO) y el ID32 Strep (bio Merieux, La
Bal~e les Grottes, France) también incluyen pruebas
convencionales modificadas (p. ej., hidrólisis de esculi-
oducción de ácidos a partir de carbohidratos) en el
na, pr .1. d •d •ti • , 11 sJ
anel de sustratos ut11za os p~a 1a 1 entl 1c~c10n. -
P d" si·ón adicional sobre sistemas comerciales para
Una . 1scu.fi •
"ón bactenana · 1uye en cap1tu
se me ' 1os pos te-
l~ 1dentl icacial aciones de estas pruebas rápidas que uti-
~ores. Las ev u ornó enos y de los sistemas comerciales
Jizan sustratosdcr ~on métodos confiables y precisos
han demostra o que
para la identificación de los microorganismos para los
cuales estas pruebas se desarrollaron.
PRUEBAS CON SUSTRATOS FLUORÓGENOS
DE ENZIMAS
Una aplicación relacionada con las pruebas rápidas
que emplean sustratos cromógenos es la utilización de
sustratos fluorógenos de enzimas para la detección de en-
zimas bacterianas y la identificación de microorganis-
mos. Estos sustratos son utilizados en el sistema automa-
tizado MicroScan autoSCAN "Walkaway" (W/A) Rapid
Bacteria! ldentification System (Dade/Baxter, West Sa-
cramento, CA), que provee una identificación bacteriana
en 2 horas sobre la base de la liberacign.,de productos
fluorescentes a partir de la hidrólisis de una variedad de
sustratos fluorógenos. 200•252 Estos sustratos.:.:éstán com-
puestos de unidades de carbohidratos o. aminoácidos_uni-
dos a través de enlaces glucosídicos o peptídicos a com-
puestos como la 4-metilumbeliferona (p. ej., 4-metilum-
beliferil-~-o-galactopiranósido, 4-metilumbeliferil-~-D-
glucurónido, etc.) y \a 4-metilcumarin!l (p. ej ., L,alanina-
4-metilcumarina, ácido 4-metilcumarina-L-glµthiico,
etc.), los cuales merced a la hidrólisis por enzimas·baéte-
rianas liberan productos finales fluorescentes. Debido a
que estas enzimas se encuentran preformadas en el inó-
culo bacteriano y los instrumentos de detección de, estas
pruebas son altamente sensibles para niveles bajos de
fluorescencia, no se precisa una incubación prolongada
de bacterias desconocidas para producir un punto final

J

detectable, lo cual se consigue tan p
horas después de la inoculación. ronto como a las 2
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
CROMATOGRÁFICOS
La cromatografía se basa sobre la premisa de que los
compuestos P?s~en diferentes solubilidades cuando son
expm~s~os a d1stmtos materiales o fases no miscibles. El
pnnci~1? de la cromatografía es lograr un equilibrio de
ª?sorcion entre fases, una móvil y la otra estaciona-
na. Las fases_ movll Y estacionaria existen virtualmente
en todos los lip~~ de cromatografía. La cromatografía en
ca~a del~ad~ ~t1hza un~ ~ase líquida móvil y una fase es-
tac1onana sohda; las d1stmtas solubilidades de los mate-
riales de una mezcla entre las dos fases permite separar
l?s ~omponentes de la _mezcla. En la cromatografía gas-
hqmda (~L~:),_ un gas m~rte que actúa como transporta-
dor (p. _eJ., mtrogeno, heho o argón) es la fase móvil y en
ella se myecta la muestra para el análisis. La fase estacio-
naria consiste en una matriz sólida (p. ej., sílica o celita)
cubierta por un líquido inerte y fácilmente volatilizable
como el carbowax o la metilsilicona. Estos materiales cu-
bren la superficie interna de un tubo capilar enrollado de
vidrio (la "columna~') que está encerrada en la unidad de
calentamiento. La muestra en análisis es volatilizada por
calor en la zona de inyección en la columna, donde se
mezcla inmediatamente con el flujo del gas transporta-
dor. Los compuestos presentes en la muestra se distribu-
yen entre las fases inerte y móvil de la columna en fun-
ción de sus afinidades relativas por la fase cubierta de la
columna. Los compuestos con baja afinidad son los que
pasan más rápido a través de la columna y se detectan
primero; aquellos con mayor afinidad se mueven a través
de la columna más lentamente y emergen últimos. El
tiempo que transcurre entre la inyección de un material
dado en la columna y su aparición en el sistema de detec-
ción se denomina tiempo de retención. Este tiempo de
retención, en condiciones definidas de temperatura, tipo
de gas transportador y empaquetamiento de la columna, . Los microorganismos crecidos en condiciones estandari-
es constante; por lo tanto, compuestos desconocidos pue-
den ser identificados por comparación con muestras co-
nocidas, preparadas de un modo similar y corridas a tra-
vés de la misma columna.
Los componentes básicos de un sistema de GLC inclu-
yen un horno que contiene la columna empaquetada a tra-
vés de la cual pasa un flujo regulado del gas transporta-
dor, una zona pasible de calentamiento donde la muestra
en análisis se inyecta y se volatiliza inmediatamente y un
sistema de detección para medir los componentes desco-
nocidos a medida que emergen por el extremo distal de la
columna. El detector puede ser tanto un detector de con-
ductividad térmica (un alambre caliente), un ionizador de
llama o un detector de captura electrónica. Los detectores
de conductividad térmica pueden ser utilizados para el
análisis de la mayoría de los productos finales del meta-
1
' bolismo bacteriano. Los detectores de ionización de llama
son más sensibles y versátiles pero requieren la presencia
de hidrógeno y aire en el sistema para alimentar la fuente
de la llama. Los detectores de captura electrónica son ex-
tremadamente sensibles y son usados más a menudo en
establecimientos de investigación o en laboratorios de re-
ferencia, donde, en una de sus aplicaciones, los líquidos
corporales se examinan directamente a fin de detectar la
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 33
presencia de vestigios cuantitativos de ~etabolitos bacte-
rianos. Las señales de detección se amplifican Ytrasladan
a un sistema de registro gráfico, donde los traza~os se rea-
lizan en un papel calibrado que se mueve. Los tJ.empos de
retención de los materiales se comparan en el analizador
con los tiempos de retención ~e co~trol~s prep~ados de
un modo similar, lo cual pernute la 1dentificac1on de me-
tabolitos desconocidos. La altura de los "picos" en el tra-
zado es directamente proporcional a la cantidad de un me-
tabolito dado en una muestra.
La cromatografía gas-líquida ha encontrado su mayor
aplicación en la bacteriología anaeróbica. 107·137 Estas bac-
terias producen una variedad de ácidos grasos de cadena
corta, alcoholes y aminas que se pueden extraer del me-
dio de cultivo por solventes orgánicos o acuosos. Por
ejemplo, los ácidos grasos de cadena corta volátiles, co-
mo los ácidos acético, propiónico, isobutírico y butírico,
pueden ser extraídos del medio de cultivo con una mez-
cla de éter y ácido. Los ácidos no volátiles, como el suc-
cinato y el fumarato, deben ser convertidos primero en
metilésteres por tratamiento con metano! antes de ser ex-
traídos. Este último paso se realiza con la elevación del
pH a alrededor de 11,0 y la extracción del caldo con clo-
roformo. Sobre la base de la reacción de la coloración de
Gram y de los tipos de ácidos grasos volátiles y no volá-
tiles que se producen durante el crecimiento en caldo, se
puede efectuar una identificación a nivel de género para
la mayoría de las bacterias anaerobias obligadas. w7
Los métodos cromatográficos como el GLC también
pueden ser utilizados para ayudar a la identificación de
una gran variedad de otras especies bacterianas como
también de levaduras.36,80,89,102.118,119, 120,123,140,146,l48,163,114-
177·248·267·274 Cuando los microorganismos crecen en con-
diciones rígidamente estandarizadas, la composición quí-
mica de varios de sus productos permanece constante. La
cromatografía líquida de alta resolución (high perfor-
mance liquid chromatography, HPLC) puede ser utiliza-
da para analizar ácidos grasos de cadena larga, compo-
nentes de la membrana y la pared celular bacterianas.
zadas son cosechados y saponificados con hidróxido pa-
ra liberar los ácidos grasos de cadena larga de las células
intactas. Estos ácidos grasos son metilados para volver-
los volátiles, extraídos con un solvente orgánico (hexano:
metil tert-butil éter [1:1]) e inyectados en una columna
que contiene una fase líquida de fenilmetil silicona entre-
cruzada adsorbida sobre sílica fundida y con hidrógeno
como gas transportador. La detección de los derivados
metilesterificados de los ácidos grasos se realiza con un
ionizador de llama. El detector emplea una mezcla _de
oxígeno ardiente e hidrógeno para encender a los com-
puestos orgánicos; las partículas ionizadas de la muestra
pasan luego entre dos alambres con carga opuesta, que
genera una fluctuación en la corriente que es medida y
trasladada a un registro permanente.
Abe) y col., 1fueron los primeros en sugerir que los mi-
croorganismos podían ser clasificados por un análisis de
cromatografía gaseosa de los componentes de las paredes
y las membranas celulares. Estos conceptos primigenios
han encontrado su aplicación actual en el sistema de
identificación microbiano (MIS o MIDI) (Microbial ID
Inc., Newark, DE), un sistema de identificación de ácidos
grasos bacterianos automatizado y ·sofisticado, comer-
cialmente disponible. En este sistema, los derivados me-
 · 34 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
tilesterificados de ácidos grasos extraídos de la pared ce-
lular bacteriana son analizados en un cromatógrafo ga-
seoso Hewlett-Packard 3890A (Avondale, PA) equipado
con un ionizador de llama, un tomador de muestras auto-
mático, un integrador y una computadora. La identifica-
ción de los microorganismos se basa solamente sobre la
Comparación por computadora del perfil de los derivados
metilesterificados de los ácidos grasos del microorganis-
mo desconocido con los perfiles de una biblioteca prede-
terminada de aislados conocidos con un software que re-
conoce patrones matriciales de covarianza. Osterhout y
col. 188 determinaron que el sistema Microbial ID identifi-
có correctamente 478 de 532 aislados clínicos (90%) y
cepas de bacterias gramnegativas . no fermentadoras de
referencia. La mayoría de aquellas cepas en las que la
identificación por GLC no coincidía con los criterios bio-
químicos pertenecían a los géneros Acinetobacter; Mora-
xella y Alcaligenes o eran Pséudomonas pickettii. Se ·en-
contraron otras discrepancias cuando las-cepas de refe-
rencia no estaban caracterizadas adecuadamente p cuan-
do no era posible diferenciar entre cepas con estrecha re-
lación quimiotaxonómica. Stoakes y col. compararon el
sistema MIS con los métodos convencionales de identifi-
cación de estafilococos y encontraron una coincidencia
completa con las identificaciones de referencia para un
87,8% de los 470 aislados estudiados. 244
Distintos procedimientos cromatográficos, en·particu-
lar la cromatografía en capa delgada, HPLC y cromato-
grafía capilar gaseosa han sido extremadamente útiles
para la identificación de especies de Mycobacterium y
géneros relacionados. 26·34•3553·89·147·254•257 Para estos mi-
croorganismos en particular, las técnicas cromatográficas
detectan · principalmente ésteres de ácido micólico 'que
forman parte de su pared celular. Estos métodos se utili-
zan en varios laboratorios de referencia y estatales a lo
largo de·todo Estados Unidos y para esta finalidad se en-
cuentra disponible en el comercio un sistema de base de
datos computarizado/análisis (el MIS mencionado an-
tes). La GLC también ha probado ser útil para la identi-
ficación de microorganismos exigentes ·que son bioquí-
micamente inertes en los sistemas de identificación con-
vencionales, como por ejemplo especies de Bartonella,
Bruce/la, Streptobacillus moniliformes, Francisella tula-
rensis y otros bacilos gramnegativos exigen-
tes.21 ·48·118·221·276·277 Futuras mejoras en este sistema indu-
dablemente aumentarán la precisión de las identificacio-
nes y expandirán la posibilidad de utilizar la GLC para la
identificación de otros géneros bacterianos.
La cromatografía gas-líquido se ha utilizado también
para la detección directa de agentes y productos bacteria-
nos y fúngicos en muestras clínicas. Brooks y col. han
detectado varios productos específicos de microorganis-
mos (p. ej., unidades de ácido, alcohol, aminas e hidro-
xiácidos) en extractos de distintos tipos de líquidos bio-
lógicos utilizando GLC de captura electrónica pulsada
por frecuencia. 27-3o En muestras de deposiciones diarrei-
cas se pudo detectar Clostridium difficile por la presencia
de ácido isocaproico y distintas especies de Shigella pre-
sentaron perfiles de ácid<:s grasos _específicos de espe~ie.
Deposiciones que con~eman rota;1!us f~eron ~~act_enza-
ueñas cantidades de ac1dos 1sobutmco, 1sova-
d as po r Peq
, · ale'ri·co Brooks y col. tamb" 1en demostraron que
1enco y v · 1 · ·· b · anticuerpos con antígenos comunes o estrechamente re-
· · les responsables de a menmg1t1s actenana
los prmc1pa·¡ . ifluenzae de tipo . b , 1ve1ssena
., · · menmg1
· 'd'1-
(Haemop h I us m
tis de los serogrupos B y C, Klebsiella pneumonia~ y
Streptococcus pneumoniae) podían ser detectados Y drr~-
l
1
renciados con la aplicación de GLC a los ex~ractos de li-
quido cefalorraquídeo (LCR). 29 DeRepentigny Y co~.
también utilizaron métodos de GLC para detectar arab1-
nitol y mananos en sueros para el diagnóstico de Candi-
da invasiva en pacientes con cáncer. 57·58 ~unque est?s
técnicas requieren un equipami~nto s?fist!~ado Y e~tan
muy limitadas a laboratorios de mvest1gac1on, la aphc~-
ción de GLC y de espectrometría de masas r~pre~~mta sm
duda un potencial casi ilimitado para su aphcac10n futu-
ra en los laboratorios de microbiología clínica.
MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Las aplicaciones de los s_us~ratos cron:ióge~os Y. }ª
GLC han sido generalmente hrmtadas a la 1dent1ficac10n
rápida de microorganismos que están creciendo en cal-
dos o medios agarizados, respectivamente. A pesar de
ello el desarrollo de métodos para la detección directa de
antígenos microbianos con anticuerpos como reactivos
de diagnóstico es una tecnología relativamente nueva que
se apoya en la inmunología básica y clásica y q~e ha g~-
nado amplia aceptación como método para el diagnósti-
co rápido de ciertas enfermedades infecciosas. Asimis-
mo, los procedimientos inmunológicos modernos han
modificado los métodos actuales utilizados para la detec-
ción de anticuerpos en el diagnóstico serológico de infec-
ciones o en la determinación del estado inmunológic<;>.
Luego de una breve reseña de conceptos inmunológicos
básicos, se tratará la aplicación de esos conceptos a la de-
tección directa de antígenos y anticuerpos.
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS: DEFINICIONES BÁSICAS_
Un antígeno es una sustancia que provoca la forma-
ción de anticuerpos en un animal que es inmunizado o in-
fectado por ese antígeno. Un antígeno es generalmente
"inmunógeno", es decir, tiene la capacidad de estimular
la formación de anticuerpos y puede combinarse especí-
ficamente con los anticuerpos formados contra él. No to-
das las partes de un antígeno son igualmente inmunóge-
nas, y aquellas partes de la molécula que interactúan y
que son reconocidas con más frecuencia por los anticuer-
pos se denominan determinantes antigénicos inmuno-
dominantes o epítopes. Las caractérísticas particulares
de cada antígeno dependen del tipo y la secuencia de
aminoácidos en las proteínas y de su estructura secunda-
ria, terciaria y cuaternaria y de la composición química y
estructural de los polisacáridos, las glucoproteínas y los
ácidos nucleicos. La estructura de estas biomoléculas es-
tá determinada genéticamente.
Algunos tipos de moléculas tienen determinantes anti-
génicos comunes y serán reconocidos por anticuerpos di-
rigidos contra ellos. Por ejemplo, las porciones Cl cle las
cadenas livianas de distintas clases de inmunogl0bulinas
contienen determinantes antigénicos comunes .<que per-
miten que sean reconocidas por los mismos anticueq,os.
Estas combinaciones antígeno-anticuerpo son denomina-
das de "reactividad cruzada"•. Las reacciones cruzadas de
lacionados puede ser de importancia clínica en algunas

enfermedades. Por ejemplo, se cree que el daño cardíaco
que ocurre durante el desarrollo de una enfermedad reu-
mática cardíaca estaría relacionado con la reactividad
cruzada entre antígenos de la superficie celular de los es-
treptococos ~-hemolíticos del grupo A con antígenos
presentes en el sarcolema del músculo cardíaco (véase
c_ap._1_2). 22 Estos anticuerpos se forman luego de una fa-
nng1tJ.s estreptocócica y luego se unen al tejido cardíaco.
Esto ~ctiva la cascada del complemento, que resulta en
un dano del músculo cardíaco. Reacciones similares que
ocm:.en e~ la ~embrana basal del glomérulo renal y en
el teJ1do smovial que se encuentra en los espacios articu-
lares serían las responsables, respectivamente, de la glo-
merulonefritis posestreptocócica y de la artritis. 22
Los anticuerpos o inmunoglobulinas (lg) pueden ser
divididos en 5 clases de acuerdo con su estructura: IgG,
lgM, lgA, lgD e lgE (fig. 1-19). Las moléculas de lgG
están compuestas de dos cadenas livianas y dos pesadas
y poseen dos sitios para la unión de antígenos específi-
cos. Las moléculas de IgM están compuestas de cinco
monómeros que son semejantes a las moléculas de IgG;
es decir, cada monómero está compuesto de dos cadenas
pesadas y cadenas livianas de polipéptidos y poseen dos
sitios para combinarse con el antígeno (sitios Fab). Las
moléculas de IgM se forman tempranamente durante la
respuesta inmune y a niveles muy bajos y son seguidas
por la aparición de cantidades mucho mayores de IgG di-
rigida hacia el mismo antígeno. La IgA se encuentra en
múltiples formas (desde uno a cuatro monómeros) y re-
presenta menos del 10% de la Ig sérica. A pesar de esto,
es el principal anticuerpo que se encuentra en la superfi-
cie de las mucosas y en secreciones extracelulares, como
el calostro, la mucina de los tractos respiratorio y genital,
las lágrimas y la saliva. La lgD tiene una estructura simi-
1.µ- a la IgG pero se encuentra en el suero en cantidades
extremadamente pequeñas. La IgE está presente sólo en
cantidades vestigiales en el suero, pero este anticuerpo
tiene un papel importante en las reacciones alérgicas, in-
l g ~ ~ Anti~uerpo más
comun del suero
PM = 150.000
Cadena J
Anticuerpo
de superficie
de la mucosa
Componente
secretorio
Anticuerpo unido
del linfocito
PM = 150.000
Fig. 1-19. Clases de inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos pertenecen a cinco clases estructurales y funcionales designadas IgG,
IgM, IgA, IgD e IgE. La un idad de estructura básica de los miembros de cada clase consiste en dos pares de polipéptidos (dos de cadena
pesada y dos de cadena liviana) unidos por enlaces disulfuro y cada unidad contiene dos sitios de combinación del antígeno. Algunos tipos
de lg tienen otro componente estructural (cadena J en la lgM, componente secretorio en la IgA).
BACTERIOLOGIA BÁSICA 35
cluido el shock anafiláctico severo. La génesis de la res-
puesta inmune humoral y celular y las interacciones que
_resultan en la producción de anticuerpos específicos es-
tán más allá del alcance de este texto; este material se
puede encontrar en otros libros de texto dedicados a la
inmunología y la inmunogenética.
En la microbiología clínica, las moléculas de IgG, par-
ticularmente, pueden ser utilizadas para detectar antíge-
nos bacterianos específicos. Estas moléculas de IgG pue-
den ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos
policlonales generalmente son purificados de animales
inmunizados con el antígeno de interés. En consecuen-
cia, los anticuerpos producidos contra un antígeno com-
plejo reaccionan con una variedad de determinantes anti-
génicos o epítopes distintos. Los anticuerpos monoclona-
les son anticuerpos producidos contra epítopes específi-
cos de un antígeno; por lo tanto, estos anticuerpos son al-
tamente específicos. Debido a que los anticuerpos mono-
clonales han revolucionado los métodos de detección an-
tigénica de un modo tan profundo, se hará un breve co-
mentario sobre la manufactura y la producción de estas
moléculas. No obstante, en primer lugar se discutirá
acerca del tipo de reacciones para las cuales se utilizan
estos anticuerpos en el laboratorio clínico.
TIPOS DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO
REACCIONES DE PRECIPITINA
La reacción básica entre antígeno y anticuerpo es la
reacción de precipitina. Esta reacción se encuentra en
sistemas de pruebas que permiten la difusión libre de an-
tígeno y anticuerpo enfrentados uno con el otro. En el
punto crítico de interfase, donde las concentraciones son
óptimas, se forma un precipitado visible compuesto por
combinaciones de antígeno y anticuerpo. En un sistema
de <iifusión simple, el anticuerpo se incorpora en el agar
donde se permite la difusión del antígeno. En un método
Anticuerpo temprano
1 PM = 900.000
~ Anticuerpo mayor
lg E reagínico
~PM = 190.000
36 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
en tubo, el antígeno se coloca sobre un agar que contie-
ne el antisuero y en la zona de equivalencia se forman
una o más líneas de precipitina. En la inmunodifusión ra-
dial, el anticuerpo se encuentra contenido en el agar que
se distribuye sobre un portaobjeto de vidrio. El material
con el antígeno se ubica luego en pocillos circulares cor-
tados en el agar. Durante la incubación, el antígeno se di-
funde en el agar y se forma un anillo de precipitación. El
diámetro del anillo es directamente proporcional a la
cantidad de antígeno presente en el material y se pueden
obtener resultados semicuantitativos sobre la concentra-
ción del antígeno en comparación con el diámetro de la
reacción de precipitina con el del material que contiene
cantidades conocidas de antígeno. El procedimiento con-
vencional de inmunodifusión más usadó es la difusión
doble. En esta técnica, ambos, antígeno y anticuerpo se
colocan en pocillos adyacentes entre sí y los materiales
se difunden uno hacia el otro. Una línea de precipitación
se forma entre las líneas cuando se llega a la concentra-
ción de equivalencia. La düusión doble requiere 48 horas
para que se logren resultados interpretables. La contrain-
munoelectroforesis (CIE) usa la tecnología de la inmuno-
difusión doble, pero también usa una corriente eléctrica
que corre a través de la agarosa que aumenta la velocidad
de migración de antígeno y anticuerpo en el agar. Estos
métodos se pueden usar para la detección de anticuerpos
y antígenos en los líquidos corporales.
Una precaución que se debe tener al trabajar con siste-
mas de precipitina es la posibilidad de falsos negativos,
reacciones causadas por los fenómenos de prozona y de
postzona. Si el anticuerpo está en exceso (es decir, en
concentraciones muy superiores del antígeno disponi-
ble), se produce un falso negativo (prozona), reacción
que ocurre porque el entramado molecular que hace visi-
ble el precipitado no se forma. Por el contrario, las reac-
ciones de -postzona ocurren cuando el antígeno está en
exceso y los anticuerpos se saturan con antígeno de mo-
do tal que el entramado característico de las reacciones
de precipitina no se producen. En los casos en los que se
pueden anticipar altas concentraciones de antígeno o de
anticuerpo, los fenómenos de falsos negativos de. prozo-
na y postzona, respectivamente, se pueden evitar con
pruebas repetidas con diluciones seriadas de la muestra.
Aunque todos los métodos descritos antes (es decir, in-
munodifusión en tubo, difusión radial, difusión doble)
han sido utilizados para la detección de antígenos bacte-
rianos en líquidos corporales (p. ej., LCR, líquido pleu-
ral, etc.), la CIE fue el único método que tuvo aceptación
en la práctica clínica debido a la relativa rapidez de la
técnica (30-60 minutos en comparación con 24-48 horas
por difusión doble). Sin embargo, aun este método ha·si-
do suplantado por los procedimientos más rápidos de
aglutinación con partículas de látex o de coaglutinación
con estafilococos que se describen más adelante. Los mé-
todos convencionales de difusión doble aún se usan en el
diagnóstico serológico de infecciones fúngicas como as-
pergilosis, blast_omicosis, hist?plasmos!s y_ ~occidioido-
micosis (es decir, pruebas de mmunod1fus10n para hon-
gos). En estas pruebas, los antígenos de estos_microorga-
nismos se hacen reaccio?~ con sueros ~e pac1en~es y con
sueros de controles pos1,t1vos que contienen anticrn:rpos
en una prUeba de difusion doble. El1 desarrollo de, ¡
!meas
··
.
de prec1p1 ma ·t· s de ·
1dentidad entre
. .e suero contro· dpos1t1-
vo y con e1 suero del Paciente md1ca la presencia e es-
. , •cos La presencia o la ausencia
tos anticuerpos an~fu~gi un~difusión tienen significado
de ciertas bandas ,\1;::(véase cap. 19).
diagnóstico y pronos '
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
. d lutinación pueden ser definidas
Las reacc10ne~ , e agecífica inmunoquímica de Partí-
como la agr~gaci~tr~~1tos partículas sintéticas de látex)
culas ~bactenas, ; antígen~ 0 el anticuerpo que pueden
1
recubiertas con d tectar tanto anticuerpos como antíge-
ser usadas para e ctivamente. Los antígenos o los anti-
nos solubleri· respela superficie de la partícula mediante
cuerpos s~ IJ~n a intramoleculares o por uniones cova-
fuerzasLelectnl ct~snación de las partículas soporte ocurre
lentes a ag u 1 • , .
·
como un m 1ca. d' dor de las interacciones antlgeno-anti-
cue o sobre la superficie de estos s~portes.
..,,rp
1anto Ios anti' genos como los anticuerpos. •, se pueden ,
detectar me di .ante reacciones de ag 1utmac1on, segun el
• l 1 d t ·, d
reactivo . um'do al soporte. Por eJemp . o,. , a de ecc1on
, e
·
anticuerpos anti'rrubéola por ag 1utmac1on
, e1 , 1atex, se
11eva a cabo Con la mezcla de part1culas. dde .atex a dlas
1
cuales se ha adosado el antígeno mmuno ommante el
· d la rubéola con anticuerpos. ,presentes
VlfUS e ( d .en ¡el suero .
muestra y se observa la aglutinac~~n es ecir'. , os ~ll-
3
cuerpos específicos para rubéola). La detecc1on _direc-
ta de antígenos de estreptococos del grupo A en hisopa-
dos de fauces se lleva a cabo con la extrac~ión del hiso-
pado con pH bajo (ácido nítrico) o con enzimas y se,ha-
ce reaccionar el líquido extraído con las cuentas de latex
cubiertas con anticuerpos contra el antígeno antiestrepto-
coco del grupo A. 210 En cualquiera de los casos, los en-
tramados interconectados se forman entre los soportes y
la muestra en análisis para causar una aglutinación se-
cundaria fácilmente visible.
Las reacciones de aglutinación son más sensibles que
las reacciones de precipitina por la naturaleza directa de
las interacciones entre antígeno/soporte/anticuerpo. La
sensibilidad y la factibilidad de que estas reacciones ocu-
rran en diluciones altas permiten realizar medidas semi-
cuantitativas de antígenos y anticuerpos en muchos ca-
sos. En el caso de los anticuerpos, los resultados semi-
cuantitativos pueden derivar de la determinación de la di-
lución más alta de suero que produce una reacción de
aglutinación visible. En esta situación, esas reacciones
están ligadas a determinaciones de punto final por el pro-
cedimiento macroscópico de floculación usado en la
prueba cuantitativa rápida en tarjeta de la reagina del
plasma (RPR) (véase cap. 18). Los cambios en los títulos
por aglutinación en las muestras agudas y convalecientes
permiten un diagnóstico serológico retrospectivo de ma-
nera similar a la fijación del complemento y a la prueba
de inhibición de la hemaglutinación. En la determinación
semicuantitativa de concentraciones de antígeno, un títu-
lo por punto final de la muestra del paciente (p. ej., LCR)
se puede comparar con el título por aglutinación por pun-
to final obtenido con una preparación diluida seriada-
mente de una concentración conocida de antígeno.
Las comparaciones de títulos en muestras secuenciales
p~eden tene~ una aplicación directa en el cuidado del pa-
ciente. Por eJemplo, una disminución en el título de antí-
geno polisacárido capsular en el LCR está directamente
relacionado con la respuesta terapéutica en pacientes con
meningitis producida por Cryptococcus neoformans.63 A

la inversa, un aumento en el título O un título persistente-
me~te el~vado en un_pa~iente que ha sido tratado para es-
ta infecci?n es un mdicador excelente de una recaída
postratamiento.
. Las P~ícula~ de látex son las más comunes entre va-
nas partículas mertes (bentonita, colodión- eritrocitos
tratados con ácido tánico y carbón son otras)'que pueden
ser e~ple~das para absorber diferentes grupos de antíge-
no~: mclmdos proteínas, hidratos de carbono y DNA. La
umon _covalente de las proteínas a las partículas de látex
e~ posible Y_ ~rovee una unión estable que favorece la má-
xima_ reacci~n entre antígeno y anticuerpo, con depen-
dencia del sistema que se use. Las partículas sirven como
un corazón de poliestireno que es recubierto con una ca-
pa de otro polímero que puede unirse a las proteínas.
La c?aglutinación también es empleada ampliamente,
en particular en la detección de antígenos de varios gru-
pos de estreptococos, Neisseria meningitidis y Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus injluenzae, Streptococcus
pneumoniae y otros (reactivos disponibles de Karo-Bio
Diagnosticos AB, Huddinge, Suecia). Ciertas cepas de
Staphylococcus aureus (la cepa Cowan, ATCC 12498)
tienen un alto contenido de proteína A de superficie. La
proteína A en las paredes de S. aureus se une con la por-
ción Fe de una molécula de inmunoglobulina, y deja la
porción Fab libre para recibir el antígeno. La aglutina-
ción· visible de las células de estafilococos sirve como
una prueba positiva de unión antígeno-anticuerpo.
Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos y
los estafilococos sirven de base para varios sistemas co-
merciales para la detección ·directa de bacterias u otros
antígenos microbianos en líquidos corporales. Una apli-
cación importante ha sido la detección de antígenos cap-
sulados solubles de varios agentes de meningitis agudas
y crónicas, como Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, estreptococos del
grupo B, Escherichia coli .y Cryptococcus neoformans.
Las pruebas comerciales para la detección de antígenos
bacterianos ' incluyen los sistemas Directigen (Sistemas
Microbiológicos Becton Di~kinson, Cockeysville, MD),
Bactigen (Laboratorios Waifipole, Cranbury, NJ) y Well-
cogen (Wellcome Diagnostics, Dartford, Inglaterra) (to-
dos sistemas de aglutinación en partículas de látex) y el
ensayo de coaglutinación Phadebact (KaroBio Diagnos-
tics, Huddinge, Suecia). Las pruebas se pueden comple-
tar en 15 Ininutos con sensibilidades de alrededor del
90% o más y con especificidades del 97 al 99%. Tilton y
col. han examinado el LCR de 157 pacientes sospecha-
dos de padecer meningitis (34 tenían un diagnóstico po-
sitivo). 256 De éstos, la prueba de coaglutinación
Phadebact detectó el 76%. El ensayo directo de látex de-
tectó el 82% y el Bactigen de látex el 93%. Se concluyó
de este estudio que la aglutinación del látex era más sen-
sible que la coaglutinación y que' la CIE_ Sippel y col.
exaininaron muestras de 162 pacientes con meningitis
bacterianas. 237 Encontraron que la prueba Directigen de-
tectaba antígeno de H. influenzae de tipo b en el 83% de
83 pacientes con meningitis causada por este agente, an-
tígeno capsular de Streptoccoccus pneumoniae en el 77%,
de 39 pacientes con meningitis neumocócica y antígeno
capsular de Neisseria meningitidis en el 93% de 40 pa-
cientes con meningitis meningocócica. Ingram y col. en-
contraron que la prueba Wellcogen proveía un diagnósti-
co específico de meningitis en aquellos con H. injluenzae
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 37
de tipo b, el 100% de aquellos con meningitis debida a N.
meningitidis serogrupos A y Y, el 36% de aquellos con N.
meningitidis serogrupo C y el 69% de pacientes con me-
ningitis debida a S. pneumoniae. 112
Los ensayos de aglutinación del látex también pueden
ser aplicados al diagnóstico rápido. Ajello y col. encon-
traron que las pruebas comerciales de aglutinación del lá-
tex son valiosas para la detección directa de antígenos en
el suero y la orina de pacientes con neumonía bacteria-
na.4 En un estudio de 44 pacientes con neumonía bacte-
riana (23 por Streptococcus pneumoniae, 13 por Hae-
mophilus influenzae de tipo b, y 11 por otras especies), el
antígeno fue detectado en más del 90% de los casos de
neumonía provocada por hemófilos, tanto con los siste-
mas de aglutinación del látex Directigen como con el
Bactigen. Sin embargo, la sensibilidad para detectar ca-
sos de neumonía neumocócica fue sólo del 72% para el
Directigen y del 38% para el Bactigen.
INMUNOENSAYOS EN FASE SÓLIDA
Los inmunoensayos en fase sólida, una extensión de
los principios básicos descritos antes, se refieren a la
unión tanto de antígeno como de anticuerpo a una varie-
dad de materiales sólidos, como pocillos de poliestireno
o cuentas de plástico. Por ejemplo, sistemas de fase sóli-
da desarrollados para la detección de anticuerpos en una
muestra descémocida tienen el antígeno unido a la fase
sólida (fig. 1-20). La reacción inicial ocurre cuando las
muestras que han de ser exaininadas son incubadas por
un tiempo preestablecido con la fase sólida. Los anti-
cuerpos específicos se unen al antígeno inmovilizado.
Después de que la mezcla de reacción se lava para elimi-
nar cualquier elemento extraño, se agrega una inmuno-
globulina conjugada con un marcador y se incuba en el
tubo de reacción. En los procedünientos de radioinmu-
noensayo (RIA), la señal es un isótopo radiactivo (p. ej.,
32
P o 1251); en el método de enzimoinmunoensayo (EIA),
la señal es una enzima. En los sistemas de EIA disponi-
bles comercialmente para detectar anticuerpos humanos,
el conjugado a menudo es una inmunoglobulina antihu-
mana obtenida en cabra marcada con fosfatasa alcalina o
peroxidasa de rabanito. Si la reacción inicial antígeno-
anticuerpo ocurre, la inmunoglobulina (con la señal ra-
diactiva o con la enzima) se une al anticuerpo. El paso fi-
nal de estos ensayos es la detección de actividad radiac-
tiva o enzimática. Esto se realiza mediante un contador
de centelleo que detecta emisiones beta o gamma o por
el agregado de un sustrato de la enzima que generalmen-
te da un producto final coloreado que puede ser detecta-
do visualmente o mediante un espectrofotómetro. Una
reacción positiva indica que el anticuerpo estaba presen-
te en la muestra original y la intensidad de la reacción es
proporcional a la concentración de ant,icuerpo en la
muestra. En la figura 1-20 se muestra una representación
diagramática de un EIA para la detección de anticuerpos
contra el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo l.
La mayoría de los RIA usan sistemas de ensayos de ti-
po competitivo. En el ensayo cuantitativo para ~~ticuer-
pos, primero se estandariza el sistema de fase sóh_~a con
un antígeno unido no marcado y una concentrac_10n. es-
tándar de anticuerpo marcada con un agent~ rad1acuvo.
La muestra desconocida que contiene el anticuerpo que
se busca detectar (el cual no está marcado) se agrega al
 38 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
La cantidad de anticuerpo ~arcado
sistema de ensay 0 ; proporcional a la cantidad de
desplazado del antig~no ::sente en la muestra de prueba.
anticuerpo no !11ar~a ~iicuerpo en la muestra desconoci-
La concentración e ª mparación de las lecturas obte-
Antígeno ·na con 1a co .
HIV da se determi
nidas con I~s d:tº~ a atrón. Las curvas se obtienen
~u;acfu de inhibición de la unión del
por determinaci nd e ando es mezclado con diluciones
. rpo marca o cu . .
Pocillo de anticue 'd d conocidas de anticuerpo sm mar-
microplaca seriadas de cantl ª ~s 'lar cuando )os antígenos son de-
car. El enfoque es ;~:o con la diferencia de que un an-
1 Agregado de t
la muestra tectados por edS e m tiiiz~do para cuantificar la cantidad
tígeno marca o es u

l
, J'bre en la muestra.
de antig~n~ ~unoensayo ha adquirido uso amp!io en ,la
~I _radiot d crinología clínicas y en la tox1colog1a,
Anticuerpos anti-HIV quuruca hy ª en ºtrado aplicaciones sistemáticas signifi-
pero .
no a encon d' •
. robiología clínica. Los proce 1m1entos
,6,6~Antígeno HIV catlvas en 1a ffi!C h ·
de RIA en uso 1·ocluyen ensayos . para orrnonas )estero1-
. aldosterona cortisona, progesterona y bor-
deas (p. eJ., ' · h " ¡· I ·
Lavar 'di'cas (corticotropma, orrnona 10 1cu oesl!-
monas pep t1 1 d ·, d
Agregar esina). Las pruebas para a etecc10n e
mu1ante, vasoPr ., h · · B (HB A

l
el conjugado
marcadores de la l·nfeccion por epat1t1s
, . s g,
HBsAc, HBCAc, HBeAg, HBeAC) au_n se re~1za por
2 Anti-lg conj_ugado RIA en algunos laboratorios r,ero han sido ampliamente

i
con enzima
reemplazadas por la tecnol~g~a. de los EIA. _A pesar de
A tiene gran sens1b11idad y espec1fic1dad, los
que e1 RI asociados con la ehffilnac1on
· · · ' de 1os desec hos
probl em as
Anticuerpos anti-HIV
. di , 1·d h
~ A n t í g e n o HIV radiactivos y la inestabilidad de ciertos ra onuc 1 os an
// 7/ limitado la expansión de las técnic_as de RIA. .
Lavar Los enzimoinrnunoensayos crecieron a partrr d~ ,ne- !ª
Agregar el cesidad de sortear las desventajas del uso de rad101soto-
cromógeno pos en los laboratorios clínicos. Las técnicas de EIA fue-
ron desarrolladas inicialmente en Europa, donde el uso de

l
- -~~~
3
Aoti-lg rooj,gad<>
Cromógeno conenzima
~ticuerpos anti-HIV
M#Antígeno HIV
/ ~/
00 • 00000
• oooo e oo
Fig. 1-20. Principios del enzimoinmunoensayo (EIA). Esta figura
muestra el procedimiento del EIA para la detección de anticuerpos
contra HIV-1. Antígenos parcialmente purificados de HIV-1 son
adsorbidos sobre el pocillo de una microplaca. En el paso 1, se
agrega el suero y se incuba. Los anticuerpos anti-HIV-1, si están
presentes, se unen al antígeno. Luego_de un paso de lavado, se
agrega una inmunoglobulina antihumana que está conjugada con
una enzima (paso 2). Después de un segundo lavado, se agrega un
sustrato cromógeno de la enzima. Las adsorl;,ancias de los pocillos
individuales se leen espectrofotométr!camente_y los resulta~os de
la prueba se interpretan por comparación con controles pos11Ivos y
negativos desarrollados en la misma prueba.
compuestos radiactivos es limitado y estrictamente con-
trolado. Las técnicas de EIA no sólo superan las precau-
ciones que se requieren para el manejo de sustancias ra-
diactivas, sino que evitan ciertos problemas técnicos inhe-
rentes al vencimiento de los reactivos o al rápido decai-
miento de los radionúclidos. Los equipos comerciales dis-
ponibles de EIA para la detección de anticuerpos en sue-
ro se han tomado ampliamente disponibles en los últimos
cinco años y han suplantado, en muchos casos, a procedi-
mientos más laboriosos y que insumen más tiempo como
son la fijación del complemento y los ensayos de inhibi-
ción de la hemaglutinación en serología viral.55,161,168.206.269
De hecho, los métodos EIA son los recomendados para
los ensayos serológicos modernos, como las pruebas de
relevamiento de anticuerpos contra los virus de la inmu-
nodeficiencia humana (HIV)-1 y (HIV)-2. 49,88
Los procedimientos serológicos que se basan sobre la
tecnología del EIA también han sido modificados para
a~mentar su utilidad como pruebas de diagnóstico espe-
c~ficas o confirmatorias. Un ejemplo de esas modifica-
c10nes son los procedimientos de Western blot para la de-
tección de anticuerpos contra el HIV-1 (fig. 1-21). 49,88 En
los procedim_ientos de Western blot para HIV-1, el HIV-
1_que es crecido en_ cultivo de tejidos es parcialmente pu-
n~cado de los cull!vos celulares y solubilizado por trata-
m1~nto_ con _detergente. Mediante electroforesis en gel de
pohacnlallllda, las proteínas del HIV-1 se fraccionan de
acuerdo_ con su peso molecular y las de bajo peso mole-
cular llllgran J:1ás lejos que las de alto peso molecular y
las ~lucoprotemas. Luego, se dispone una hoja de papel
de mtrocelulosa sobre el gel y las proteínas del HIV-1 se
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 39

transfieren . electroforéticamente al papel de nitrocelulo- KD

sa. Esta hoJa luego se corta en tiras para ser utilizadas co- 160

-~-
~o la "fas~ sólida" del ensayo. Los sueros que son reac- 120
tivo~ repet!d~s veces en EIA de relevamiento para HIV-1 66
-:::: 55
se diluyen e mcuban con las tiras de nitrocelulosa. Si es- - 51
tán presentes, los anticuerpos contra el HIV-1 se unirán a 41
1
los antígenos virales específicos presentes en la tira. Lue-
go de !~varias, las tiras se incuban con anticuerpos de ca-
b~a ant1humano~ que se encuentran conjugados con pero-
- --- 31
24

x1dasa de rabamto o fosfatasa alcalina. Luego de otro pa- - 17

so de lavado, el sustrato de la enzima se agrega a la tira. Gel de

poliacrilamida plano
En este momento aparecerán en la tira bandas coloreadas
en aqu_ellas áreas donde ha ocurrido una reacción antíge- Transferencia
(blotting)
no-_a,ntlcuerpo. La,posición de estas bandas y la compa-
rac10n con el patron de bandas que se obtiene con mues-
tras de controles positivos permite valorar la reactividad
2 t
Tiras de
de una muestra con antígenos virales específicos y reali- membrana de
zar una interpretación. 49,ss nitrocelulosa
Las técnicas de enzimoinmunoensayo también han si-
do adaptadas para la detección de antígenos bacterianos,
fúngicos y parasitarios en distintos tipos de muestras clí- Agregar
muestra
nicas. Los antígenos bacterianos que pueden ser detecta- Incubar
dos por métodos EIA incluyen a los antígenos capsulares
de S. pneumoniae, H. influenzae de tipo b y N. meningi-
tidis y al antígeno de la pared celular de los estreptoco-
cos del grupo A. 162. 290 La reciente disponibilidad de ensa-
3 1
yos donde la enzima está unida a inmunoabsorbentes
(ELISA, enzime-linked immunosorbent assay) para de-
tectar directamente en deposiciones antígenos específi-
cos de Giardia lamblia y Criptosporidium ha llevado a la Lavar
Agregar conjugado (o-[)
tecnología del ELISA a un área de diagnóstico que ha
visto relativamente pocas innovaciones desde la intro-
ducción de las técnicas de conservación de muestras y de
tinción.2·128.295 A pesar de que la serología fúngica se rea- 4
l
liza principalmente por fijación del complemento e in-
munodifusión, la investigación en esta área es promisoria
en lo que se refiere al desarrollo de métodos de EIA co- o-f-<
mo pruebas auxiliares para el diagnóstico de infecciones Lavar o-[-{
Agregar conjugado ([()
fúngicas sistémicas como las producidas por Coccidioi-
des immitis. 126 t
La detección directa de antígenos virales y de clami-
dias en muestras de pacientes generalmente es un área
excitante en virología. Actualmente, los métodos de de-
tección antigénica por EIA han hallado sus más amplias 5
aplicaciones en la detección de antígenos de superficie
de la hepatitis B en sueros, rotavirus en muestras de ma- p 31
teria fecal y virus sincitial respiratorio en secreciones del p 24
tracto respiratorio. 99 En estos casos, en general grandes p 17
cantidades de antígeno se encuentran presentes durante
la fase aguda de la enfermedad. Sin embargo, la sensibi- Fig.1-21. Técnica de Western blot para la detección de anticuerpos
anti-HlV-1. En el paso l, el virus crecido en cultivo de tejido es so-
lidad de estos ensayos puede estar comprometida por la lubilizado, parcialmente purificado y sujeto a electroforesis en ge-
captura del antígeno en la muestra (p. ej ., deposic iones les planos de poliacrilamida. Esto separa las proteínas virales y las
mucosas o secreciones pegajosas del tracto respiratorio) glucoproteínas por sus pesos moleculares. En el paso 2, los antíge-
y por la afinidad de los antígenos producidos in vivo (en nos en el gel son transferidos electroforéticamente a una hoja de ni-
el paciente) y de los anticuerpos producidos in vitro (an- trocelulosa, que se cm1a en tiras. Las tiras luego son incubadas (pa-
ticuerpos monoclonales o policlonales producidos en so 3) con la muestra en ensayo (suero). Después de lavar el mate-
rial no unido, se agrega un conjugado marcado con enzima (paso
animales y unidos a una fase sólida). En la figura 1-22 se 4). Este material se une a los anticuerpos de la muestra de suero que
presenta el diagrama de un ensayo de captura antigénica se han unido a la tira. Luego de otro paso de lavado, se agrega el
para la detección de Chlamydia trachomatis. sustrato cromógeno de la enzima, y las bandas coloreadas aparecen
Además de las reacciones de EIA para la detección de en la tira en los sitios de reactividad inicial del anticuerpo. En este
anticuerpos contra el HIV-1, se han obtenido licencias diagrama, la reactividad se muestra hacia gp41, p24 y p31, que con-
para la reacción de EIA de captura para el antígeno p24 firma que la muestra de suero contiene anticuerpos anti-H!V-1. (Fi-
gura cortesía de Sandler SG, en De Vita VI Jr, Hellman S, Rosen-
del HfV-1 con fines diagnósticos y actualmente son re- berg SA [eds]: AIDS Etiology, Diagnosis, Treatment, and Preven-
queridas (junto con anticuerpos anti-HIV) para el ensayo tion, 2nd. ed., p 128. Filadelphia: JB Lippincott Co., 1988.)
 4 o DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

aciente a la terapia viral y puede tener i~portancia diag-

1 pó · en la identificación de neonatos mfectados, que
n saca . 1 HIV l •
serán positivos para anticuerpos contra e . · de~1do
a que son obtenidos por vía transplacentana. En e_sta ms-
• • tancia, los antígenos virales que forman compleJos con
•• Ac,
• los anticuerpos en muestras d~ sueros de neonatos po-
drían no estar libres para reacc10nar en un ensayo com-
petitivo de captura antigénica. Nuevas generaciones de
ensayos para detectar antígeno p24 ~el my-1 s_ueros
que se están usando en protocolos d~ mv~stigac10n_ mclu-
yen un paso de pretratamie_nto q~e d1soc1a c?mpleJos an-
2 tígeno-anticuerpo, con la hb~rac1ón del ant1g~no p24 de
modo que éste puede reaccionar con ·el anticuerpo de
• captura en el ensayo de fase sólida. IOJ
•• • ••
•
••••
MÉTODOS DE INMUNOFLUORESCENCIA _
Ac, La inmunofluorescencia brinda una alternativa al EIA
como método para la detección y la localización de antí-
genos que pennitan el di~gn~stico d~ enfermedades b~c-
Enzima-Ac
terianas, fúngicas, paras1tanas y vrrales. E_sta técmca
3 también puede ser utili~ada para detectar an~cuerp_os en
diagnósticos retrospectivos de enfenne_dades 1nfecc1osas.
Para la detección de antígenos, un anticuerpo específico it,
es conjugado con un compuesto fluorescente (habitual-
mente isotiocianato de fluoresceína) que genera un mar-
cador sensible sin alterar su reactividad inmunológica. El
antisuero conjugado se adiciona a células o tejidos que se
encuentran sobre un portaobjeto y se fija a los antígenos
para fonnar un complejo inmune estable. Los materiales
no reaccionantes se eliminan por lavado y luego el pre-

¡
Sustrato _ _ _ _.,. Color
visible
Enzima-Ac
4 contra un fondo oscuro según el fluorocromo y los filtros
Fig. 1-22. Técnica de enzimoinmunoensayo de captura para
Chlamydia trachomatis. En esta técnica, el anticuerpo dirigido
contra el antígeno que se busca detectar está unido a la fase sólida.
Muestras de lavado endocervical se agregan en cada pocillo (paso
1). Las clamidias presentes en la muestra urogenital son captura-
das por el anticuerpo en fase sólida. Luego de un paso de lavado se
agregan los anticuerpos anticlamidia que están conjugadÓs a una
enzima (paso 2) y reaccionan con el antígeno unido al anticuerpo
en fase sólida. Después de otro paso de lavado, se agrega el sustra-
to de la enzima (paso 3) y se detecta un color visible.
de unidades de sangre antes de una transfusión. 129 La de-
tección del antígeno p24 del HIV-1 en suero puede ser
clínicamente útil en ciertas situaciones.5 El antígeno p24
del HIV-1 puede ser detectado en una infección tempra-
na antes de la producción de anticuerpos y desaparece
con l a seroconversión. 149•272 •273 El antígeno reaparece ·en
con la progresión clínica de la enfermedad. La
el su erodel antígeno p24 tiene uti·1·d
prueba d l' . d .
1 a c mica _Y , e_ mves-
. ., moni"toreo de la respuesta antigemca del
tigac10n en e1
parado-se seca y se observa con un microscopio de fluo-
rescencia. Los antígenos unidos específicamente a un an-
ticuerpo fluorescente pueden ser detectados como obje-
tos brillantes de color verde manzana o amarillo naranja
que se utilicen. Las técnicas .de inmunofluorescencia
pueden ser directas o indirectas. Las pruebas de inmuno-
fluorescencia directa se utilizan generalmente para la de-
tección de antígeno, mientras que los métodos indirectos
se pueden usar tanto para la detección de antígenos como
de anticuerpos (serología).
Las técnicas de inmunofluorescencia directa (véase
fig. 1-23) involucran una aplicación directa del conjuga-
do mar.cado al material que ha de ser examinado, segui-
do de un-período de incubación de 15 a30 minutos en un
ambiente húmedo a 35° a 37°C para permitir que ocurra
la reacción antígeno-anticuerpo. Luego de un paso de la-
vado para remover-el conjugado no unido, la preparación
se seca al aire y se -monta para su observación en un mi-
croscopio equipado con una fuente apropiada de luz fluo-
rescente y filtros barrera. En el procedimiento indirecto
(fig. 1-24), el material en estudio se cubre primero con
un exceso de inmunosuero no marcado dirigido contra el
antígeno y se deja que reaccione de 30 a 45 minutos a
35° a 37°C. La muestra se lava con una solución salina de
buffer fosfato y luego se hace reaccionar con antisuero
marcado con fluoresceína contra las inmunoglobulinas
utilizadas en la reacción inicial (p. ej., antisuero de cabra
antihumano conjugado con fluoresceína). Luego de eli-
minar los materiales extraños, la presencia de fluorescen-
cia microscópica indica ,la presencia de antígeno. El mé-
todo directo es simple y rápido de realizar con pocas
reacciones inespedficas; sin embargo, es menos sensi-

1
Á
 BACTERIOLOGIA BÁSICA 41

o
1

D Determinante Determinante
1 antigénico
antigénico

1 + +
1
l Anticuerpos
)-o~ } Anticuerpos
conjugados con
antideterminantes
no marcados
)-o~ fluoresceína } (p. ej. preparados
1 en conejo)

l Lavado
+ Lavado

-t3 si~
07
'\ 1

_;sD~- I'
fl
Fig. 1-23. Diagrama esquemático de un ensayo de inmunofluores- +
cencia directa (DFA). En el método de DFA, el antígeno (p. ej.,
muestras respiratorias para virus sincitial respiratorio, muestras "'\_______,., "'\_______,., } Anticuerpos anticonejo

r urogenitales para clamidias) se ubica en el pocillo de un portaob- .f""""""V, .f""""""V , (preparados en cabra)
"'\_______,., / "'\_______,., / conjugados con
jeto para FA y reacciona directamente con un anticuerpo monoclo- J""""""V, J""""""V, fluoresceína
nal conjugado con fluoresceína dirigido contra el antígeno. Des-
pués de la incubación y el lavado, el portaobjeto es examinado pa-
ra detectar la fluorescencia característica.
+ Lavado

ble. El método indirecto es más sensible y produce una

fluorescencia de mayor brillo; sin embargo, es menos es-
pecífico y puede dar lugar a mayor reactividad cruzada. 31
Los ensayos de inmunofluorescencia directa (DFA)
están limitados a la detección de antígeno, mientras que
los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) pue-
den ser utilizados para detectar tanto antígenos como an-
ticuerpos (fig. 1-25). Este último es la base de las prue-
bas de IFA para la detección, principalmente, de anti-
cuerpos contra agentes virales (p. ej., citomegalovirus
[CMV], sarampión, etc.). En los procedimientos de IFA,
los portaobjetos con pocillos para pruebas de FA con cul-
tivos fijados de células infectadas por virus son cubiertos
con diluciones seriadas de suero de paciente. ' Luego de
incubar y lavar, se agrega un anticuerpo de cabra o cone-
jo marcado con fluoresceína y dirigido contra la inmuno-
globulina humana (conjugado) a cada una de las áreas de
los portaobjetos que contienen antígenos virales. Luego
del lavado, los portaobjetos son inspeccionados con un
microscopio de fluorescencia y se determina un punto fi-
nal (la mayor dilución del suero que produce tnmuno-
fluorescencia positiva). Los cambios en los títulos se
pueden determinar por inspección de portaobjetos que se
han hecho reaccionar en paralelo con diluciones seriadas
de sueros de fases aguda y convaleciente. Los ensayos in-
directos también se pueden realizar con conjugados mar-
cados con enzima (p. ej., peroxidasa de rabanito) en lu-
gar de reactivos marcados con un fluorocromo. Estos en-
sayos con conjugados enzimáticos se pueden leer sin ne-
cesidad de un microscopio de fluorescencia.
La inmunofluorescencia y los ensayos inmunoenzimá-
ticos tienen sus propias ventajas y desventajas. El uso de
métodos de EIA para la detección de antígenos es venta-
Fig. 1-24. Diagrama esquemático del ensayo de inmunofluores-
cencia indirecta (IFA) para la detección de antígeno. En este méto-
do, las muestras (p. ej., esputo para Legionella) se hacen reaccio-
nar con un exceso de anticuerpos no marcados dirigidos contra el
antígeno. Después de un paso de lavado, anticuerpos conjugados
con fluoresceína dirigidos contra las especies en las que se produ-
jeron los anticuerpos usados en la primera reacción (p. ej., anti-
cuerpos anticonejo preparados en cabra conjugados con fluoresceí-
na) se esparcen sobre el portaobjeto para FA. Después de lavar, el
portaobjeto es examinado para fluorescencia específica. Con Le-
gionella, por ejemplo, para el primer paso del procedimiento se
pueden usar anticuerpos no marcados de conejo contra un gran nú-
mero de serotipos mientras que se requiere una única Ig de cabra
anticonejo conjugada con fluoresceína para el segundo paso. Si mi-
croorganismos legionella fueran a ser detectados con el método
DFA, se requerirían conjugados marcados con fluoresceína dife-
rentes para cada serotipo.
joso en laboratorios que trabajan con grandes volúmenes
de muestras, donde muchas muestras se examinan diaria-
mente para una sola determinación (p. ej., Chlamydia
124 247
trachomatis o virus sincitial respiratorio). • Si bien
las técnicas de inmunofluorescencia implican una labor
más intensiva, la capacidad para observar los elementos
42 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

Antígeno ANTICUERPOS MONOCLONALES

CMV
Paso 1 Portaobjeto
P???i Una c~n~ecuencta
.
fIo [tu al de los principios y las técni-
os intentos de purificar los an-
cas serologicos/ª? h terogeneidad de los antisueros.
+ tígenos para re ucu ª t en moléculas de antígeno con un
Anticuerpo anti-CMV Difíciln:iente_ ~~entos O incluso miles de deter-
solo epitope,_ , . pueden existir sobre una superficie
minantes ant1gemcos • C
celular o dentro de la mezcla de. otras sustancias.. al uan-
+
Reacc1"ón ant1geno-ant1cuerpo
•. ,,l,,l,,l,,l
CCCO
do esta mezc 1a de a
.
est1mu1a un nume , ro
ntígenos
igual de
se myectan
clones• e
en un
d 1· " ·t A
m1oc1
amm
os.
'fi
se
pe-
1 1 sar de que cada Clon Produce un anticuerpo h espec1' 1co, el
una mezcla altamente eterogenea de
resu 1tado fima1 eS ºfi 'd d fi ºd
Paso2 + moléculas de anticuerpo, ~uya es~e~1. 1c1 a y a iru ad
genera1men te es de sconocida y d1f1cil· de controlar1 de
p- ~f
\/

Anticuerpo antihuman,o 'Q-q d t

marcado con fluoresce1na /-- (' --{
Floorasceod! especifica '11Y1
,,l ,,l ,,l ,,l
ccco 1
1
Anticuerpo antígeno
Fig. 1-25. Método indirecto de anticuerpos fluorescentes (IFA) pa-
ra la detección de anticuerpos. En este método, el antígeno (p. ej.,
cultivos de células infectadas por citomegalovirus [CMV]) se fijan
sobre un portaobjeto para FA y se hace reaccionar con el suero del
paciente. Si hay anticuerpos anti-CMV presentes, se unen al antíge-
no sobre el portaobjeto. Después de un paso de lavado, se esparcen
sobre el portaobjeto anticuerpos anti-humanos conjugados con
fluoresceína preparados en cabra. Esto resulta en el marcado de las
células infectadas por CMV en el portaobjeto e indica la presencia
de anticuerpos anti-CMV en la muestra·de suero inicial. Los títulos
pueden ser determinados con la realización del ensayo con dilucio-
nes seriadas (2 veces) al medio del suero y la lectura la máxima di-
lución de suero que dé el grado de fluorescencia preestablecido.
celulares acompañantes en ciertas pruebas de detección
directa del antígeno a fin de determinar si la muestra es
adecuada es una ventaja distintiva de la DFA sobre los
métodos de EIA de captura antigénica. Por ejemplo, da-
do que Chlamydia trachomatis infecta preferentemente
células epiteliales cilíndricas de la región del cuello ute-
rino, la presencia de células epiteliales escamosas y una
preponderancia de neutrófilos segmentados, eritrocitos o
un exceso de mucus indican que la muestra no es adecua-
da para fines diagnósticos. Las muestras adecuadas exhi-
ben una preponderancia de células epiteliales cilíndricas
o cúbicas intactas. Esta evaluación se puede realizar con
un ensayo de inmunofluorescencia directa e incorporarla
en un informe de laboratorio que permita al médico so-
pesar la evidencia clínica de ~na infección ~or clamidias
con la posibilidad de que un mforme negativo pueda re-
flejar una toma de muestra realizada en ~orma inadecua-
da. Esta determinación no se puede reah~ar con u~ EIA
de cap tura anti.génica para C. trachomat1s. Ademas. •del
d e t Cho matis se pueden conseguir reactivos
caso e · ra '
. , por inmunofl uorescencia· dº
irecta de d.1s-
~ara la de_teccwn ·smos incluidos Giardia lamblia,
untos m1croorgam ' p mocystis carinii. I 2s.2s3,295
Crvptosporidium parvum Y neu
tan a a an. da C uando
. estos sueros pohclona
.
pleados en sistemas de pruebas bacte~anas, pue
es son
dhb em-
a er
reactividad cruzada, tanto po~que existen de_termman_tes
antigénicos compartidos por diferentes especies o por~~e
existen mutaciones que pueden resultar en la ev?lu~ion
de epítopes suficientemente cercanos en ~specific1dad
para producir reacciones detectables. Los mtentos para
producir antígenos pur?s a partir ~e técnicas de adsor-
ción han sido sólo parcialmente exitosos. , .
A medida que la ciencia de l~s en~a~?s serologicos
evolucionó se vislumbró que la disporubihdad de un an-
ticuerpo q~e poseyera alta hom~g~neida? molec~l~ _Y
especificidad limitada contra un_urnco ~pitope antigem-
co sin reacciones cruzadas, podría soluc10nar muchos de
lo; problemas que se encontraban al utilizar anticuerpos
policlonales. Anticuerpos monoclonales alt~ente espe-
cíficos, el producto de un clon único de células linfoides,
emergieron gradualmente como un subproducto de las
investigaciones de fusiones celulares y la tecnología de
hibridomas dirigidas por Kohler y Milstein. 138 Debido a
su descubrimiento, ahora es posible aislar líneas clona-
das a partir de un único linfocito que produzca un solo ti-
po de moléculas de anticuerpo. El maym logro no fue el
hecho de que se pudiera aislar una sola línea de células
productoras de anticuerpos monoclonales, sino más bien
que estos linfocitos de ratón pudieran fusionarse con cé-
lulas de rnieloma de ratón para producir células hfbridas
con dos propiedades inherentes importantes: 1) la. capa-
cidad de producir anticuerpos monoespecíficos (adquiri-
da de los linfocitos parentales) y 2) la capacidad para cre-
cer indefinidamente en cultivo, un don de inmortalidad
que les otorgaron las células de mieloma. De este mo,do,
los anticuerpos monoclonales individ1,1ales ahora se pue-
den producir en forma continua y casi infinita.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
La producción de anticuerpos monoclonales deriva de
siete pasos determinados.
l. Selección del antígeno (no necesariamente puro);
2. Inmunización del animal;
3. Fusión de linfocitos esplénicos y células de m~eloma;
4. Formación de hibridomas productores de anticuerpos;
5. Clonación de aquellos hibridomas que se ha deseado
seleccionar;
6. Relevamiento de anticuerpos: utilización de técnicas
de selección, y
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 43
R ECUADRO 1-4 P ROCE
' DI ~IIENTOS PA RA LA PRODUCC IÓN DE ANTICUE RPOS MONOCLONALES

Selección de antígenos
capaces de sintetizar DNA debido a su incapacidad de produ-
Los anticuerpos mono 1 1 cir HRPT, y serán eliminadas por la aminopterina en el medio
. c ona es pueden ser producidos contra selectivo HAT. También se debe recordar que los linfocitos
cu alquier sustancia ca d .
. . . paz e ser reconocida como un antígeno esplénicos no fusionados no sobreviven más que unos pocos
r e1 sistema mmune de c 1 .
. po ·
. . ..
· zación de antí e u~ quier animal maculado. La utih- días en medios de cultivo; por lo tanto, las células híbridas
. g nos puros es ideal. De hecho ciertos antígenos linfocito-mieloma son las únicas -capaces de sobrevivir en el
como drogas purifi d , . ' '
. (p . . . ca as qunrucamente usadas para ensayos medio HAT.
l , · ej., digoxma) pueden ser homogéneas. Aun así, nunca se
puede asegurar que un determinante antigénico puede consistir
Clonado de las células de hibridoma
en sólo un epítope. El hecho de que antígenos impuros puedan
ser u_sa~os para la producción de anticuerpos monoclonales es Las células únicas productoras del anticuerpo deseado se de-
la prmc1 ¡ ·
, Pª ven~a s~bre los métodos convencionales emplea- ben aislar y hacer crecer como un clon. Se pueden emplear
{ dos para producir anucuerpos policlonales. dos técnicas: 1) dilución límite y 2) crecimiento en un medio
agarizado. En la técnica de la dilución límite o técnica de di-
'Inmunización del animal lución al doble, la suspensión de híbridos (después del creci-
miento máximo) es diluida y distribuida en una serie de poci-
,,Los objetivos primarios del procedimiento de inmunización llos estériles en una microplaca de cultivo. Las diluciones son
~º? preparar al sistema inmune de un animal para reconocer calculadas de modo que en cada pocillo haya en promedio
, á~1damente todos los antígenos inoculados, estimular al má- una única célula que pueda ser reemplazada por un único clon
xuno clones de linfocitos B y hacer que las células esplénicas productor de anticuerpos. En el método alternativo, con un
i e ~ividan a una tasa de velocidad alta. En la producción de gel de agarosa suplementado con suero, aminoácidos y anti-
anacuerpos monoclonales la cepa de ratón BALB/cj es la más bióticos, las células híbridas en división forman pequeños
'.· utilizada. El antígeno es inoculado subcutánea o intraperito- grupos con formas esféricas. Estas esferas pueden ser selec-
•<nea).mente junto con el adyuvante de Freund. Los inóculos se cionadas con una pipeta Pasteur y transferidas a los pocillos
repiten con intervalos semanales y se da un inóculo final de de una microplaca para su cultivo y para el ensayo para deter-
!refuerzo por vía intravenosa alrededor de 3 días antes de que minar si el anticuerpo deseado se está produciendo.
'fas células del bazo sean recuperadas asépticamente.

1
' Fusión de linfocitos esplénicos con células de mieloma
t ''
:El bazo del animal es colocado en un medio de cultivo esté-
~ril con antibióticos. El tejido esplénico es disgregado y las
células son liberadas para formar una suspensión. Este mate-
rial e~ pasado a través de una malla para obtener células ais-
~a!fas .•Se agrega Ficoll a la suspensión y se centrifuga para
• remover los glóbulos rojos. Se adiciona polietilenglicol
.¡.(PEO) a la suspensión para reducir la tensión superficial in-
tercelular; esto hace que las células se aproximen una a la
otra y permite la fusión de las membranas. A la mezcla de fu-
sión se agrega dimetilsulfóxido (DMSO) para maximizar el
contacto célula-célula. Finahnente, las células son recogidas
en un precipitado por centrifugación suave de la mezcla du-
rante 5 minutos. Así, al final de estos pasos, la preparación
consiste de células de mieloma no fusionadas, linfocitos no
fusionados y unas pocas células híbridas linfocito-mieloma
(se debe tener en cuenta que los linfocitos esplénicos y las
células de mieloma se fusionan con una frecuencia de sólo
1/105 o 106 células).
Selección de las células lubridas linfocito-mieloma
Las células de mieloma no fusionadas rápidamente sobrecre-
cen a los híbridos y deben ser eliminadas de alguna manera.
Las células de mieloma usadas para la fusión se hacen crecer
en presencia de 8-azoguanina, una droga que hace que las cé-
lulas dejen de producir de manera permanente la hipoxantina-
fosforil-transferasa (HRPT), una enzima necesaria para que el
crecimiento continúe. Si estas células HRPT negativas sqn
suspendidas en un medio que contenga hipoxantina, aminop-
terina y timidina (medio HAT), sólo las células de hibridoma
crecerán exitosamente. Las células de hibridoma heredan
HRPT de los linfocitos esplénicos con lo's ch al.~$ se fJ sionan
y sobrevivirán. Las células de mieloma no fusionadas ~on in-
Relevamiento para anticuerpos buscados
En el paso de fusión del procedimiento para la producción de
anticuerpos monoclonales, muchos linfocitos distintos de
aquellos que producen los anticuerpos buscados pueden ha-
berse fusionado. De hecho, menos del 5% de las células híbri-
das seleccionadas producen verdaderámente los anticuerpos
específicos buscados. Por lo tanto, se requieren ensayos de lí-
neas celulares seleccionadas para determinar si el anticuerpo
deseado se está produciendo. El RIA, el EIA, las técnicas de
precipitación y las técnicas de transferencia pueden ser usa-
das en esta fase del procedimiento.
Producción en masa de anticuerpos monoclonales
Una vez que el clon deseado de células híbridas ha sido selec-
cionado, el paso siguiente es la producción de grandes canti-
dades de anticuerpos monoclonales. La cavidad peritoneal de
un ratón, preferentemente de la misma cepa que se ha utili-
zado para la inmunización inicial, puede ser usada para hacer
crecer el clon de células híbridas seleccionado. Primero, la
cavidad peritoneal es inyectada con un irritante orgánico, co-
mo el pristano, para producir una peritonitis química. Luego,
la línea de células híbridas seleccionada es inyectada en la ca-
vidad peritoneal. En unos días, se desarrolla un tumor cono-
cido como hibridoma. Este tumor produce grandes cantidades
de anticuerpos monoclonales que pueden ser cosechados por
aspiración del líquido ascítico de la cavidad peritoneal del ra-
tón. Un ratón portador de un tumor sobrevivirá de 4 a 6 sema-
nas, durante las cuales se pueden cosechar grandes cantidades
del anticuerpo. Los hibridomas también pueden crecer en cul-
tivo de tejido donde se pueden producir anticuerpos altamen-
te purificados sin la contaminación potencial del suero, inter-
ferencia inespecífica de proteínas ascíticas o reacción_cruz_a-
da de anticuerpos histoincompatibles derivados de los teJI-
dos dt;I ratón.
44 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
7. Producción en masa de los anticuerpos monoclonales
que se desean.
En el recuadro 1-4 se incluyen los detalles de estos
procedimientos.
APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS
MONOCLONALES
Los anticuerpos monoclonales se han producido contra
muchos antíge~os de relevancia clínica. 186 Las aplicacio-
nes son demasiado numerosas para citarlas en detalle y
lo~ mi~robiólogos_ deben permanecer en contacto con pu-
bhcac1ones actualizadas para determinar qué nuevo desa-
rrollo puede ser de utilidad en sus laboratorios. En la lite-
ratura médica se han comunicado anticuerpos monoclo-
nal~s producid?s contra e~ítopes específicos de una gran
variedad de Vlflls, bactenas, parásitos y hongos.2,139,204
Los anticuerpos monoclonales conjugados ahora se em-
plean en muchos sistemas comerciales tanto en el ensayo
de inmunofluorescencia como en el EIA. 124·247Además de
la detección de antígenos estructurales bacterianos los
anticuerpos monoclonales también son empleados ~ada
vez con más frecuencia en la identificación de toxinas en-
téricas, incluidas las producidas por especies de Shigella,
de Campylobacter, cepas de Escherichia coli uropatóge-
na y toxigénica y especies de Vibrio, entre otras.56,67 Este
enfoque introduce una nueva forma de examinar la rela-
ción entre microorganismos y enfermedades infecciosas.
En lugar -del enfoque convencional sobre la detección e
identificación de microorganismos, estos reactivos permi-
ten la detección específica de los factores de virulencia
bacteriana c_:omunes a varias especies bacterianas que cau-
san un complejo de síntomas. Por ejemplo, es más impor-
tante saber que una toxina entérica es la causa de la dia-
rrea hiperosmótica que recibir la información de que un
paciente está infectado por especies de Shigella, Escheri-
chia coli, especies de Vibrio y otras.
EN~
DNA nativo (blanco)
Fig. l-Z6. Hi bridación con sondas. (Redibujado de Persing y col.: Diagnostic Medica! Molecularbiology : Principies & Applications.
Washington, OC, ASM, 1993, P· 4).
MÉTODOS MOLECULAR~S
EN MICROBIOLOGÍA CLINICA
SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
, . rales una sonda de ácido nucleico es
En termmos gene ' á "d 1.
cía de cadena simple de c1 o nuc e1co que
una sech~ben_d específicamente con su cadena comple-
puede . I n d'ar te el apareanuento
· de bases. Una sonda
mentar1a me ian RNA L
uede ser construida tanto con DNA como2c0on 1 ,' 'das
P d er pequeñas (con apenas nuc eotI os
sondas ~ued)enO slargas (varios cientos de nucleótidos de
de 1ong1tu . . , . , d ¡ ¡ ' d
longitud). El principIO bas1~0 d~!ras e a te_cno ogia e
sondas de DNA es la hibndac1on, a cua mv?1ucra 1a
I 1
desnaturalización del dsDNA en dos cadenas simples y
la detección del ssDNA con una sond~ d~ ssJ?!'l'A marca-
da y complementaria (fig. 1-26). La h1bndac10_~ con s~~-
das puede ser utilizada para demos~ar 1a re1acion genetI-
ca (p. ej., secuencias de bases homologas) en el DNA_ de
diferentes microorganismos y, de. es~a manera, ha s1d_o
ampliamente utilizada en empr~~dlilllent~s por con~ti:u~
esquemas taxonómicos filogeneticos mediante el análrs1s
por sondas de las secuencias altamente conservadas de
16S rRNA. En el laboratorio de diagnóstico, las sondas
de DNA han sido empleadas para la confirmación de los
resultados obtenidos por cultivo como una alternativa a
los métodos convencionales, que requieren mucho tiem-
po o son muy laboriosos. Las sondas de DNA también
son utilizadas para la detección de microorganismos exi-
gentes directamente en muestras clínicas; estos métodos
directos con sondas son mucho menos sensibles cuando
se emplean sin amplificación del DNA (se trata más ade-
lante) porque el número de microorganismos específicos
presentes en muestras clínicas puede caer por debajo de
la sensibilidad del ensayo con sondas. En ausencia de
procedimientos de amplificación previo a la prueba con
sondas, existen sondas comerciales que detectan apenas
104 a 106 copias de una secuencia de ácido nucleico es-
pecífica, mientras que la amplificación utilizada junto
Adicionar sonda
de DNA marcada
ENZIMA
ENZIMA
DNA desnaturalizado Sonda de DNA hibridada
(cadena simple) al DNA blanco

con la técnica de_sondas permite detectar tan poco como
10 ?.menos copias de una secuencia específica de nu-
cleot1d?s. C~ando las sondas son utilizadas para confir-
mar la 1dent1?ad de un microorganismo cultivado, el nú-
mero de c?p1as blanco excede el umbral de sensibilidad
de la té_cruca. De todos modos, en los ensayos que em-
plean d1rectamente muestras clínicas, este umbral puede
ser alcanzado o no.
. Las_ so~~as t:ueron desarrolladas originalmente para
mvest1gac1on e mvolucran el uso de una sofisticada tec-
nología de DNA recombinante, que incluye el uso de en-
donucleasas de restricción, plásmidos o vectores virales
de clonación y procedimientos concatenados de detec-
ción de secuencias, marcado de sondas y producción de
258
la sonda. Como resultado de la investigación básica en
esta área, secuencias únicas de nucleótidos de bacterias
virus, hongos y parásitos ahora pueden ser determinada~
con el uso de secuenciadores bioquímicos automáticos.
El análisis computarizado de estas secuencias de nucleó-
tidos permite el reconocimiento de secuencias de oligo-
nucleótidos (es decir, secuencias de 50-70 pares deba-
ses) que son únicas de un microorganismo dado. Una
"secuencia sintética" de nucleótidos puede ser "fabrica-
da" (nuevamente utilizando síntesis automática de ácidos
nucleicos), marcada y usada como sonda de hibridación
para la detección de secuencias únicas en un microorga-
nismo crecido en cultivo o directamente en una muestra
clínica. Los detalles del "viejo método" de construcción
de sondas de ácidos nucleicos (es decir, inactivación por
inserción, "nick translation", etc.) pueden encontrarse en
el capítulo 21 de la edición previa de este texto.
La detección de la reactividad de una sonda con mi-
croorganismos desconocidos o muestras se puede llevar
a cabo con una variedad de técnicas. Filtros de papel de
nitrocelulosa pueden unir muy fuertemente el ssDNA
desnaturalizado y no son capaces de unir el dsDNA nati-
vo. Una muestra desnaturalizada por calor o por álcali se
puede pasar a través de un filtro de nitrocelulosa y el
ssDNA se unirá fuertemente al filtro mediante el esque-
leto fonñado por la cadena desoxirribosa-fosfato-desoxi-
rribosa. Este filtro se incuba luego con una sonda marca-
da en condiciones óptimas de hibridación, seguida de la-
vados y exposición a una nucleasa específica de DNA de
cadena simple para digerir cualquier sonda marcada no
unida. El filtro puede luego ser analizado en un contador
de centelleo o puede ser cubierto con una película para
rayos X para detección autorradiográfica. Si se utiliza
una sonda marcada con una enzima, el filtro debe expo-
nerse al sustrato de la enzima. Si ha ocurrido la hibrida-
ción, aparecerá un punto coloreado en ese sector·del fil-
tro. Este tipo de detección de la hibridación se denomina
ensayo de hibridación de "dot blot'' (transferencia de
puntos).
Los primeros trabajos con sondas involucraban el mar-
cado de la sonda con compuestos radiactivos como 32 P y
detectaban reacciones positivas por autorradiografía o
contador de centelleo. Luego se desarrollaron sondas no
marcadas que usan enzimas (peroxidasa de rabanito y
fosfatasa alcalina) o marcadores por afinidad como la
biotina como marcador para la detección de sondas de hi-
bridación. Algunas sondas de ácido nucleico comercial-
mente disponibles emplean quimioluminiscencia para la
detección. Las sondas son sintetizadas y ligadas a un és-
ter de acridina. Después del paso de hibridación, la son-
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 45
da no hibridada es eliminada químicamente de la mezcla
de reacción, para dejar sólo la sonda marcada con éster
de acridina que ha hibridado a la molécula blan~o. La d~-
tección se logra mediante el agregado de peróXIdo de hi-
drógeno e hidróxido. Estos resultados provocan la hidró-
lisis de la unión éster y la generación de energía eléctri-
ca, que es detectada por quimioluminiscencia. Este siste-
ma de detección fue desarrollado por GenProbe (San
Diego, CA) y es utilizado en su línea de productos Accu-
Probe® para la confirmación de resultados obtenidos por
cultivo y en los sistemas PACE2 para la detección direc-
ta de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae en
muestras clínicas. Los ensayos con sondas quimiolumi-
niscentes se llevan a cabo en fase líquida desde el princi-
pio hasta el final y no requieren el uso de filtros, radiac-
tividad ni sustratos enzimáticos. La eliminación de·son-
das marcadas no hibridadas se realiza por un paso de hi-
drólisis diferencial en lugar de pasos repetidos de lavado.
Dado que la reacción ocurre en una sola fase, la cinética
de la reacción de hibridación es mucho más rápida. La
hidrólisis del éster de acridina de una sonda hibridada se
detecta instantáneamente por un quimioluminómetro
luego de la adición de los reactivos peróxido/hidróxido.
La tecnología de sondas de DNA e hibridación tam-
bién puede ser implementada en tejidos y biopsias que
son preparadas para examen histopatológico en patología
anatómica ·y quirúrgica; esta técnica es conocida como
hibridación in situ. En este formato, la capacidad para
detectar la hibridación depende en gran medida de la dis-
ponibilidad física del ácido nucleico blanco para la son-
da marcada. Diferentes métodos de fijación pueden afec-
tar esta disponibilidad y, a la inversa, el tamaño de la son-
da limita su capacidad para alcanzar las secuencias de
nucleótidos blanco en la muestra fijada. Inicialmente
cuando fueron desarrollados, los procedimientos de hi-
bridación in ·situ también usaban métodos de detección
basados sobre el empleo de sondas radiactivas y autorra-
diografía. Las sondas tratadas con biotina son hoy los
reactivos más usados para la hibridación in situ. La de-
tección se lleva a cabo haciendo reaccionar los tejidos
con la avidina-peroxidasa de rabanito (avidina-HRP). La
porción avidina de la avidina-HRP se une estequiométri~
camente a la biotina de la sonda. La exposición al sustra-
to de HRP da como resultado una reacción colorimétrica
que se puede detectar en un microscopio óptico. Con la
hibridación in situ, el patólogo puede apreciar la presen-
cia de reactividad a sondas específica en el contexto de la
arquitectura celular y la presencia de otras señales de in-
fección (es decir, la presencia de microorganismos den-
tro de granulomas, microabscesos, etc.). La hibridación
in situ tiene su mayor aplicación en la detección de mi-
croorganismos que son difíciles de crecer en cultivo, co-
mo los papilomavirus humanos, el virus de Epstein Barr,
el virus de la hepatitis B y el HIV-1. 86,98 ,262,280
APLICACIONES DE LAS SONDAS DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Aunque la tecnología de sondas de ácidos n_ucl~ico~
más costosa que el enfoque convencional, la d1srrunu~1on
:s
en el tiempo de incubación obtenida por algunas aplica-
ciones de esta tecnología puede afectar significa!ivamen-
te la evolución de pacientes al proveer un ~et_odo. ~e
diagnóstico más rápido, con la consecuente d1smmuc1on
 46 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

de los co~tos Y.de estadía e.n el hospital. Las sondas para

la detección directa de rrucroorganismos patógenos en
muestr~s clínica.s puede ser ventajosa, particularmente
p~a rrucroorg~smos para los cuales no hay disponibles
CUADRO
p S CON
1-4• RUEBA.
CIALMENTE PARA USO EN ~ ABOR1 I L -~
,,__,.,,.,.:.,i•,,.-W~~
RIOS CLÍNICOS
J
SONDAS DISPONIBLES COMER-

me~odos de cultivo confiables o no son prácticos. Esto es Aplicación

aprobada Microorganismos detectados
váhdo para bacterias como especies de Bartonella y vi-
rus como los papilomavirus humanos, el parvovirus B-19 Bacterias
Confirmación de
Y el HIV. 1:,as sondas de detección directa pueden resul- cultivo solamente Especies de Ca":~ylobacter (C. jejuni,
tar convementes para la detección de patógenos exigen- c. coli, C. lan) •
t~s com? Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachoma- Especies de Enterococcus
tl~, part~cularmente si las muestras son recogidas en clí- Haemophilus influenzae •
mcas leJanas y enviadas a laboratorios de referencia para Listeria monocytogenes'
la detección de microorganismos. 157 Las sondas de detec- Mycobacterium avium'
ción directa, sin embargo, carecen de un paso de ampli- Complejo Mycobacterium avium •
ficac~ón y suelen ser más sensibles que los métodos con- Mycobacterium gordonae'
vencionales de cultivo, pero menos sensibles que las Mycobacterium intracellulare'
pruebas con sondas llevadas a cabo luego de cierto tipo Mycobacterium kansasii
de amplificación del blanco. En este momento, de todos Complejo Mycobacterium tuberculosis'
modos, sólo unas pocas sondas están autorizadas por la Neisseria gonorrhoeae'
Food and Drug Administration (FDA), y están disponi- Streptococcus agalactiae (estreptoco-
bles comercialmente para su uso en laboratorios de mi- cos ~-hemolíticos del grupo B)'
crobiología clínica en los Estados Unidos (cuadro 1-4). Hongos
La mayoóa son sondas para la confirmación de cultivos Blastomyces dermatiditis'
que son utilizadas para identificar microorganismos que Coccidioides immitis'
ya han crecido en medios líquidos o sólidos. 52 Dadas las Cryptococcus neoformans'
restricciones económicas bajo las cuales han sido coloca- Histoplasma capsulatum'
dos los laboratorios en los últimos años, la utilidad de al-
gunas de estas sondas de confirmación de cultivos para Detección directa Bacteria
en muestras clí- Chlamydia trachomatis'
uso de rutina es cuestionable, dados la alta confiabilidad,
nicas Gardnerella vaginalist
la rapidez y el bajo costo de métodos que ya están dispo-
Legionella pneumophila'
nibles y que brindan las mismas respuestas. Una prueba
Neisseria gonorrhoeae'
con el sustrato PyR llevada a cabo sobre uh "estreptoco-
Streptococcus pyogenes (estreptococos
co" no hemolítico catalasa negativo para la identificación
~-hemolíticos del grupo A)'
de especies de Enterococcus es mucho más rápida, me- Hongos
nos costosa y tan certera como las pruebas con sondas de Especies de Candidat
DNA. Una prueba como la de la confirmación del culti- Protozoos
vo por medio de sondas para Neisseria gonorrhoeae, de Trichomonas vaginalist
la que se ha demostrado que es sensible y específica en Virus
un 100%, puede tener utilidad como una técnica confir- Papilomavirus humano:j:
matoria confiable en ciertas circunstancias, como la con-
firmación de presuntos aislados de gonococos de un niño • Gen-Probe, !ne, San Diego, CA
t MieroProbe Corp, Bothell, WA
como indicadores de abuso sexual. 117•155 Las sondas para t Digene Diagnosties, !ne. Silver Spring, MD
la confirmación de cultivo para Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatiditis, Coccidioides immitis y Cryp-
tococcus neoformans presentan claras ventajas sobre los
que en los medios sólidos convencionales. Una vez que
procedimientos convencionales para la identificación,
el BACTEC muestra un índice de crecimiento positivo,
debido a su alta sensibilidad y especificidad y a que es
"grata para el usuario". 245 el contenido de la botella se puede hacer reaccionar di-
rectamente con las sondas para micobacterias para iden-
Entre las pruebas con sondas que ya se usan en los la-
tificar los microorganismos en el mismo día en que son
boratorios de análisis clínicos se encuentran aquellas que
detectados por el sistema BACTEC. La contraparte im-
sirven para la identificación de especies de Mycobacte-
plica el subcultivo de una botella de BACTEC positivo a
ria. 9J.180 Como se indica en el cuadro 1-4, se dispone de
un medio sólido de crecimiento, la incubación por varios
sondas para la confirmación de cultivos para varias mico- días y la inoculación en los medios de identificación con-
bacterias clínicamente importantes. En contraste con las vencionales. Infecciones mixtas por micobacterias tam-
pruebas convencionales de confirmación P:U:ª .estos mi- bién han sido detectadas con estas sondas. 50
croorganismos, las pruebas con sondas son rap1das, alta- La tecnología de sondas literalmente ha estallado en
mente sensibles y específicas y requieren sólo un peque- los últimos años. La lectura atenta de la literatura de los
ño inóculo para llevarlas a cabo.~ 1 La mayoóa.de los la- últimos 5 a 1O años revela que las sondas han sido desa-
boratorios utilizan estas sondas JU~to con e~ sistema .ra- rrolladas para una amplia gama de microorganismos. Las
di ométrico para la detección de m1cobactena~ conocido sondas de DNA se han desarrollado para la detección de
BACTEC que provee una muestra amplificada pa- varios virus; la mayor parte de las sondas se han utiliza-
como ba co~ sondas.so.si .197 El crecimiento de Myco- do en investigación clínica y con procedimientos previos
ra la ~~ue t berculosis y de otras bacterias clínicamente de amplificación del blanco o sin ellos. Las sondas de
b.act.e, L U": u urre más rápido en el sistema BACTEC
s1 grnficatJVas oc DNA han sido descritas para CMV, rotavirus, virus del

herpes simple,
. adenovirus . entéricos , vtru·s de 1a hepa t·t·
1 1s
B y virus de Epstem Barr
nos 1.46.66.76.79.101.1so.181. 229.242 L ' por nombrar algu-
. . . as sondas también han sido
desarrolladas . , . para la 1dentificacio'n de nucroorgamsmos
· ·
que son d if1c1les de detectar e identificar .
. d M b'l 1
e me uyen espe-
cies e o I uncus, especies de Campylob t
. d Le . ll ac er, espe-
cies e . gwne a, Haefl1;ophilus ducreyi, Chlamydia tra-
ch?matis, Mycoba~tenum kansasii, Mycobacterium
av1um, Mycoba_ctenum intracellulare y Mycobacterium
paratube~c_ulosis. ~1. 72 .9s.110.1s6.192.193_198.m .2so.26s.219 Las son-
d~s tamb1en han sido aplicadas en estudios epidemioló-
gicos para establecer las cepas bacterianas involucradas
en brotes. Kristiansen y col. descubrieron en contactos
faTT?iliares la fuente_ de la cepa Neissera meningitidis re-
lac1o~_ada con la epidemia de meningitis del grupo B en-
tre nmos en edad escolar en Noruega del Norte.1 41 Las
sondas ta1!1bién han sido utilizadas para la detección di-
recta, codificada genéticamente, de los factores de viru-
lencia en los aislados en cultivo o en muestras clínicas
incluidos genes para enterotoxinas de Escherichia coli;
Clostridium perfringens (el último para confirmar enve-
nenamiento alimentario masivo), la detección de toxinas
de tipo shigela I y II y la detección y diferenciación de
Staphylococcus'aureus que codifican para las enterotoxi-
nas A, B, y C y la toxina I que provoca el síndrome del
shock tóxico. 9· 173·182. 184·263·268 También se han desarrollado
sondas para la detección de genes que codifican para la
resistencia a agentes antimicrobianos. 92 -151 Daly y col.
identificaron 325 de 327 aislados de Streptococcus aga-
lactae, Haemophilus influenzae y especies de Enterococ-
cus de pacientes pediátricos con las sondas de confirma-
ción de cultivo Accuprobe ya descritas.52
Los avances en la tecnología de sondas han logrado
superar muchas de las desventajas de las primeras sondas
de DNA; a saber, la vida útil de las sondas no isotópicas
se ha extendido, la sensibilidad y la especificidad se han
mejorado y el número de pares de bases que se requieren
para que en la hibridación se produzca una señal positiva
se ha reducido. Sin embargo, la meta final de detectar pe-
queñas cantidades de DNA en muestras clínicas, que
prácticamente permite un diagnóstico inmediato, está
ahora en el horizonte inmediato mediante la unión de la
tecnología de sondas y la emergente tecnología de la am-
plificación del DNA.
AMPLIFICACIÓN DE GENES: REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA Y OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase
chain reaction [PCR]) es una técnica altamente sensible
por medio de la cual secuencias de DNA o RNA que se
encuentran en cantidades muy pequeñas se pueden am-
plificar enzimáticamente de un modo tal que es posible
disponer de una cantidad de material suficiente para al-
canzar una "señal" umbral detectable. 195 El ímpetu para
el desarrollo de esta nueva tecnología surgió a partir de
investigaciones básicas realizadas por Mullís y otros
científicos que trabajaban en la Corporación Cetus en el
Departamento de Genética Humana de Emerysville, Ca-
lifomia. 74-178-179-222 La técnica puede ser utilizada para de-
tectar cantidades muy pequeñas de ácido nucleico espe-
cífico en muestras clínicas en las cuales se piensa que
agentes bacterianos, virales o fúngicos tienen un papel
causal. La base fundamental de esta tecnología es que ca-
BACTERIOLOGÍA BÁSICA 47
da agente infeccioso causante de una enfermedad ~º~;e
una "secuencia característica propia" en su com~os1c~on
de DNA o RNA por medio de la cual puede ser 1dent1fi-
cado. La PCR es un método por el cual se realizan in vi-
tro repetidos ciclos de síntesis, dirigida por oligonucleó-
tidos, de estas secuencias propias de DNA.
METODOLOGÍA DE LA PCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica
de "amplificación de un blanco". Esto significa que una
secuencia blanco de DNA es identificada y amplificada
hasta un punto en que puede ser detectada. La PCR se
realiza con un "soporte caliente" automatizado y compu-
tarizado denominado ciclador térmico (Perkin-Elmer
Corp, Norwalk, CT). Los "ingredientes" necesarios para
la reacción -el dsDNA de interés, los oligonucleótidos
"iniciadores" de cadena simple, el desoxinucleótido tri-
fosfato (generalmente. marcados con 32 P) y la DNA poli-
merasa Taq- se disponen juntos en un pequeño vial, que
a su vez se ubica en el soporte. El ciclador térmico es ca-
paz de elevar, mantener y enfriar la temperatura de los
viales de un modo que permite la desnaturalización ini-
cial del DNA y que luego ocurran ciclos repetidos de sín-
tesis y desnaturalización del DNA. El paso inicial de des-
naturalización "funde" el dsDNA entre los 95 y los
l0O°C. Los oligonucleótidos "iniciadores" de cadena
simple que flanquean la secuencia de DNA de interés (la
que necesita ser amplificada) se unen a los filamentos de
DNA desnaturalizado durante un paso de enfriamiento.
La extensión de los iniciadores por síntesis del DNA se
realiza por una polimerasa Taq termoestable (purificada
a partir de Thermus aquaticus, una bacteria termofílica
que vive en corrientes de agua caliente a temperaturas de
7O-75°C). La repetición secuencial de la desnaturaliza-
ción por calor-unión del iniciador y de la reacción de ex-
tensión a partir del iniciador determina la amplificación
de las secuencias de DNA localizadas entre los iniciado-
res. Un protocolo típico de PCR para la amplificación de
una secuencia blanco consiste en 30 a 50 ciclos térmicos,
con la duplicación del número de secuencias blanco con
cada ciclo. En la figura 1-27 se muestra un diagrama que
representa la técnica de la PCR y la amplificación de
genes.
La detección de los productos finales de una PCR sue-
le realizarse por separación electroforética de los compo-
nentes de la muestra final amplificada en geles de agaro-
sa o poliacrilamida, seguida por una tinción del gel du-
rante 15 minutos en la solución buffer de migración que
contiene un par de gotas de bromuro de etidio en una
concentración de 2 mg/mL. La separación en el gel se
puede visualizar en un transiluminador de radiación ul-
travioleta de corta longitud de onda, que compara las
bandas separadas con aquellas obtenidas en una corrida
estándar realizada en paralelo. Las secuencias blanco de
DNA o RNA que han sido amplificadas también se pue-
den detectar más específicamente por hibridación del
DNA amplificado con una sonda sintética marcada que
sea complementaria a toda O a una parte de la secuencia
amplificada del DNA. Con ]a tecnología de la PCR, el
DNA se puede amplificar exponencialmente en un fac_t?r
promedio de 107, hasta que se obtiene una concentrae10n
deseada de ácido nucleico que alcance el mvel umbral
para el sistema de detección que se utiliza.
 48 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
. Reacción en cadena de la pol!me-
F1g. 1-27 · El .mer paso en la secuencia de
~lllllíilllllllllliiOIIIIIIOIIIIPilllliilliill~ DNA no amplificado rasa (PCR). pnturalización del dsDNA no
Ja desna .
Secuencia blanco PCR .es Cuando ocurre la desnaturahza-
O
arnphficad ·J' nucleótidos cebadores que

Ciclo 1
c16n, los i°
igo·ón del ácido nucleico de in-
flanquean . ~ re~~n el DNA desnaturalizado y
Q,...,.._~-~----iillliiio"fflff"""'...,....~"" . é
Desnaturalizar y unir mol cu Iª
s iniciadoras 1
terés se l~nfi1 adno Los cebadores se extienden
~-=--===------~-vvO no amp I ca •
. DNA polimerasa terrnoestable
gracias a una .
.
ohmerasa "'aq)
, , que sintetiza las cadenas
.
111111110111111110000\ o (p
Extensión de las moléculas iniciadoras comp 1emen tan.as del DNA desnaturalizado
O IOOIOOIIIIIIIOOIIIII~ . I) Las moléculas de dsDNA resultan-
(c1c1o •
aturalizadas otra vez por calor,
tes son de Sn
los ce ba dores se pegan a estas moléculas
,,, . .de
NA y luego la polimerasa ,aq smtetJza
Desnaturalizar y unir moléculas iniciadoras ~s c;:enas complementarias (ciclo 2). ~ste
.
CIC1o se
repi·te muchas veces, y con . cada ciclo
el número de copias de secuencias del DNA
localizadas entre los cebadores opuestos se
~jjjjjjjljjjjj¡¡¡¡¡¡¡¡jjjjjj
o . Esto resulta en un mcremento de
d upl1ca. . por
o o Extensión de las moléculas iniciadoras lo menos ¡ 05 veces en el número de c.op1as de
o 111110 o la secuencia del DNA. Esta sec~enc1a puede
o IIOlllllllllllllOIIIIIO ser detectada por sondas de ácido nucleico
l específicas de secuencia.
Ciclo3
0,,.,...,------===:--.-vv
a-= w.g
--ó--==:=~º~.,..,,.. -iiiliiio

-iiiliiio
Desnaturalizar y unir moléculas iniciadoras

O)l••t---illlliiiommmm=~""
,_-=-o--==="----~-vvO

~jjjjjjjjjjjjjjjjiljjjjjjjjj
o
o ........••. 11111111r··········· o
o ••••••••••• 111111111" .......... . o
o •.•..•.••••IIIIIIIII"··········· o
o ...........111111111············ o Extensión de las moléculas iniciadoras
o ...•...•••. 111111111···.. ••••••• o
o ........... 111111111" ......... .. o
,--,v,____:09!111111!!11!11!!rrIIIIIIII!lIII!l[[[]jlIIIII'.

Ciclos 4-25

Al menos un incremento
de 105 veces del DNA

Se ha:n descrito muchas modificaciones de la técnica
básica de la PCR. Una de ellas es la PCR múltiple. Con
esta modificación, múltiples pares de iniciadores para di-
ferentes moléculas blanco se añaden a la misma mezcla
de amplificación. Esta preparación teóricamente puede
ser utilizada para amplificar en forma simultánea secuen-
cias blanco de distintos microorganismos patógenos en
un único vial de reacción. En alguqas aplicaciones de es-
ta técnica, un grupo de iniciadores· es usado para ampli-
ficar una secuencia interna "control" mientras que otro
grupo es utilizado para ~iciar la amplificaci~n de la se-
cuencia de DNA de interes. Este enfoque ve!'Ífica que la
amplificación del b_l~co deseado haya ocumdo. La PCR
. ha sido utihzada para detectar los genes estruc-
mú]tlP1ede las toxinas A y B d~ C/ostn'd'ium diffi
rurales ·¡
l e! e y e
1 cuencia amplificada por el primer grupo (el segundo gru-
.
gen estructur al mecA , que codifica para una protema que
se une a la penicilina de baja afinidad en cepas de estafi-
lococos oxacilinorresistentes. 87 •169 La PCR múltiple po-
dría ser una opción conveniente para laboratorios clíni-
cos debido a que teóricamente se puede usar en una úni-
ca reacción de PCR un "cóctel" de pares de iniciadores
dirigidos a amplificar las secuencias propias (p. ej. 16S
rRNA) de distintos microorganismos patógenos. La de-
tección de distintos amplicones podría entonces realizar-
se con sondas de hibridación "específicas de especie".
La PCR anidada es una técnica en la se realizan mu-
chas rondas de amplificación con un grupo de iniciado-
res y e} producto de esta amplificación posteriormente es
amplificado utilizando otro grupo de iniciadores dirigi-
dos a una secuencia que se encuentra dentro de la se-
po de iniciadores está "anidado" dentro de la secuencia

amplificada por el primer ru . . .
anidada es extremadamen~e po d_e inic1adores). La PCR
• . . sensible p . .
desven t~Jas, _me1u1da la necesidad , ero llene ciertas
duetos smtetJzados con el p . de transfenr los pro-
. 1 de reacción para sunmer
otro v1a . . grupo de m1ciadores
· · ·
. . . s1gu1ente am l'fi .,
d
e1 grupo e m1ciadores anid d P 1 1cac10n con
trae aparejado el riesgo de ª os, 10 cual de este modo
amplificado. Este requerimieg~nerar aerosole~ de DNA
0
separación física en el mism n . ~e puede evitar con la
1
ción del primero y el segun~~ia e las ~e~c_las de reac-
medio de una fase oleosa L grud po de m1c1adores por
• uego e la a ¡·fi -
el primer grupo de 1·n· · d mp 1 cac16 n con
1cia ores las fa d
mezclan y los contenidos se re'am lifi~es separa as se
segundo grupo de 1·n· · d P an utJhzando el
1c1a ores. Otro métod 0
una PCR anidada en ¡ • . para rea1izar
•¡· . , e rrusmo viaJ de reacción involucra
la utl 1zac1on de pares de iniciadores . .d
1os nuc1e6ti·dos apropiados
.
de modo
ennquec1 os con
·6 ' que 1as temperatu-
ras de fus1 n del DNA sintetizado durant I d . 1
de amplificación sean distintas. e os os c1c os
OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
Desd~ la descripción de la PCR se han descrito otras
es~ateg1as refinadas para la amplificación de ácidos nu-
cle1c_os blanco. Kwoh y col. describieron un método de-
n?,rrunado am_plificación basada sobre la transcrip-
c1on, que ha s1d? llama~o NASBA (amplificación basa-
da en la secuencia del ácido nucleico) o 3SR (replicación
autosustentable de secuencias) (fig. 1-28). 144 La técnica
de 3SR tiene su máxima utilidad en la amplificación de
ss~A m~ que en la de DNA. En esta estrategia, se sin-
tetiza en pnmer lugar el DNA complementario a una se-
cuencia blanco de RNA; este DNA es luego utilizado co-
mo un templado para la transcripción. La técnica de 3SR
usa tres enzimas en la mezcla de reacción: una transcrip-
tasa inversa (TR, purificada del virus de la mieloblasto-
sis aviaria), RNAasa H (de E. coli) y la RNA polimerasa
DNA-dependiente del bacteriófago TI. Inicialmente, un
DNA copia (cDNA) se obtiene a partir de la secuencia
blanco de RNA con iniciadores que contienen algunas
secuencias específicas de blanco (para la hibridación de
los iniciadores a una parte del blanco) junto con una re-
gión promotora para unir la RNA polimerasa del fago
TI. La TR realiza una copia del cDNA del blanco y for-
ma de este modo un híbrido cDNAc/RNA blanco. La en-
zima RNAasa H degrada luego la cadena de RNA del hí-
brido cDNA/RNA blanco, que deja el cDNA de cadena
simple. El segundo iniciador se une al recientemente sin-
tetizado cDNA, la enzima TR se une al segundo inicia-
dor y lo extiende usando la cadena de cDNA como mol-
de. El resultado es una copia de dsDNA de la secuencia
blanco. Después de esta secuencia de eventos, ambos fi-
lamentos del DNA copia son flanqueados por regiones
promotoras·de la RNA polimerasa de TI y ambos pueden
servir como molde para esa enzima. Consecuentemente,
por acción de la enzima de TI, se producen muchas co-
pias de RNA antisentido· de la secuencia blanco a partir
de la molécula de dsDNA. Estos RNA pueden actuar lue-
go como molde para la TR, lo cual da como resultado
nuevamente una molécula de dsDNA, cuyas cadenas
pueden ser entonces transcriptas por la RNA polimerasa
de TI para producir muchas copias de RNA blanco (véa-
se fig. 1-28). La 3SR no requiere un ciclador térmico y es
más adecuada para la detección de blancos de ssRNA.
BACTERIOLOGfA BÁSICA 49
Las técnicas de 3SR han sido descritas para la detección
de mutaciones puntuales resultantes de la resistencia a la
zidovudina en cepas de HIV-1. 90
a
La técnica de amplificación por desplazamiento de
la cadena (SDA) (fig. 1-29) explota el hecho de que, lue-
go de un corte en una de las cadenas de dsDNA por una
endonucleasa-de restricción específica de sitio, la DNA
polimerasa puede unirse y sintetizar una copia comple-
mentaria del ssDNA; la cadena cortada es desplazada por
la cadena que se copia durante el proceso de síntesis de
DNA. La incorporación de nucleótidos a-tio sustituidos
(p. ej., 5'-[a-tio]-trifosfato de desoxiadenosina) en la
mezcla de reacción vuelve a las cadenas recién sintetiza-
.
das resistentes a los cortes por endonucleasas de restric-
ción. Moléculas de DNA cadena doble que poseen una
cadena a-tio sustituida sólo pueden ser cortadas por en-
zimas de restricción en la "cadena nativa", de modo que
el ssDNA que es desplazado durante el proceso de copia
puede actuar luego como molde para la unión de un ini-
ciador y la extensión de cadenas de nucleótidos. El corte
de una cadena simple y la .polimerización siguiente y el
desplazamiento de la cadena siguen ocurriendo debido a
la regeneración continua de sitios de corte inalterados en
las moléculas dúplex. Las técnicas de SDA han sido co-
municadas para la detección de Mycobacterium tubercu-
losis en muestras de esputo. 61
La reacción en cadena de la polimerasa, la 3SR y la
SDA involucran la amplificación de una secuencia blan-
co que es detectada después con otro tipo de sonda. Otros
métodos de amplificación no amplifican el número de
moléculas blanco, pero amplifican la "sonda" utilizada
para detectar la secuencia genética de interés. Dos tipos
de ensayos emplean la estrategia de amplificación de la
sonda: la amplificación por la replicasa Qbeta y la rea~-
ción en cadena de la ligasa (LCR). 159-287
El método de la replicasa Qbeta utiliza una enzima
"replicasa" capaz de sintetizar el RNA genómico del
bacteriófago Qbeta (fig. 1-30). El genoma RNA del fago
Qbeta tiene muchos rulos de ssRNA y regiones parcial-
mente doble-cadena (como una molécula de tRNA). En
el ensayo de amplificación se utiliza una variante natural
de la partícula fágica denominada MDV-1; esta variante
se comporta como un sustrato para la enzima replicasa
del fago Qbeta y puede ser manipulada de modo que una
secuencia de oligonucleótidos "sonda" puede ser inserta-
da en uno de los rulos. La sonda MDV-1 se adiciona a la
mezcla de reacción y se une a su secuencia blanco (si el
blanco es dsDNA, se utiliza calor para desnaturalizar el
DNA, que permite la hibridación de la sonda). Una vez
que la región de la sonda en el rulo se une a su secuencia
de reconocimiento, se vuelve resistente la hidrólisis por
RNAasa; el tratamiento con RNAasa hidroliza a la sonda
no unida y luego un paso de lavado remueve a estas mo-
léculas de la mezcla de reacción. La adición de la enzi-
ma replicasa Qbeta al complejo sonda-blanco y la incu-
bación siguiente da como resultado la amplificación es-
pecífica de la sonda. El método de amplificación por la
replicasa Qbeta puede ser utilizado para detectar tanto
blancos de DNA como de RNA.
La reacción en cadena de la ligasa o LCR, es otra téc-
nica de amplificación de sondas (fig. 1-31 ). El_ blanco ~e
DNA cadena simple se incuba con sondas de ohgonucleo-
tido que se unen extremo a extremo al blanco. Luego, una
DNA ligasa termoestable "liga" o une entre sí a las dos
50 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

3, ANA blanco
, ,-- , ,,-,_,,- ,,_ ,--,_,'-,_,, - , __ ,·,,_,--, __, -,_ ,' - ~ 5' DNA
5

2
s , _, ~~;:;,~: , s bl=o

3' ANA blanco

5' DNA
3 5'

4 3'

5' DNA
5 3'

5' DNA
6 3' DNA
ANA polimerasa
deT7
5' DNA
7 3' 3' DNA

ANA polimerasa
deT7
Promotor de T7 (PBS)

i. )}:~\}:){/\\ :(: ~¡ 1:
5'0
8

9 ,_-,,-.,,,¡,,-_,,~-,·
TA+
5'
DNA
ANA blanco

Molécula iniciadora B TR/ANAasa H

10 3' DNA
5' RNA blanco

DNA
11 5' 5' DNA

3' DNA
12 5' 5' DNA

3' DNA

o
13 5' 5' DNA
3'

Promotor de T7 (PBX)
AAN polimerasa de T7

....
, . , ,-, ,·, ANA ~DNA Secuencia promotora
deT7-(PBS)

O
RNA
Tr~ncriptasa poli me rasa RNAasa H
inversa deT7

Fig. 1_28 • 35 R (replicación de secuencias autosustentable). (Redibujado de Persing y col.: Diagnostic Medica! Molecularbiology: Princi-
pies & Applications. Washington, DC, ASM, 1993, p. 67.)
 8ACTERIOLOGfA BÁSICA 51

sondas. El dúplex resultante se r

et
14

naturalización y la separación d ienta Ycausa la des- 5'

sondas ligadas. Las sondas ligad:s ssDNA blanco y las 5'
nuevamente a secuencias sonda Y el blanco se unen T2 Desnaturalizar e hibridar
do por un ligado para la form ~~tremo a extremo, segui-
l ----
moléculas iniciadoras de ADC
. ac1on de otro d, 1 E
Pasos se repiten muchas veces · La acumulac . ,up ex. stos , ·
T2
ca de los productos del lig • ion geometn-
ción de la sonda. La unió a;iento genera~ la amplifica- P2
na, enzimas) a las sonda; d:t!runupos ful nc10nales (bioti-
•
. d
prod uctos l1ga os a la sonda ¡0 cual
d . '
Otra iorma e amp!tficación es aquel!
na e marcado de los
. d
permite etectarlos
1 .
l Polimerizar usando
dNTPs y dNTPaS

d a en a que una
- 1
s~na genera a ?ºruna sonda es amplificada en lugar del
numero de moleculas blanco (como en la PCR 1 3SR
la SDA) o el númer? de sondas (como en las ~st~ategia~
l Cortar

de LCR. , yd de1 la rephcasa

ti cac10n e a sena
- 1
... •
Qbeta). Las técnicas de
.
traba.ian tanto por el añadi'd
son da de grupos ~niormantes" adicionales O bien por in-
cremento de ,la dsena!b generada por una sonda . A d"f
amp 1I-.
o a una ( 1
Polimerizar y
desplazar la cadena
. d 1 eren-
c1a e 1os meto, os .asados sobre la PCR, estos tipos de
ensayos no estan SUJetos a los problemas de contamina-
ción que se ?escriben más adelante para las PCR, pero al-
gunos tr~baJadores han encontrado que el método es me-
nos sensible, de modo que muestras que contienen muy Hibridar moléculas iniciadoras ADC
po~as moléculas ?ianc?,Podrían no ser detectadas por los a las cadenas desplazadas
m~todo?,de amphf~cac1on de la señal. Un ejemplo de am-
Fig. 1-29. Amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA).
phficac1on de la sena! es el método de la ramificación de
T, y T2 son las secuencias blanco; P, y P, son moléculas cebado-
1~ cadena de DNA (desarr~llado por la Chiron Corpora- ras. (Redibujado de Persing y col. Diagnoslic Medica] Molecular-
t1on) (fig. 1-32). En este metodo, el DNA blanco es libe- biology: Principies & Applications. Washington, DC, ASM, 1993,
rado de una muestra y desnaturalizado a cadena simple.
p. 69.)
El blanco de DNA de cadena simple se une a pequeñas
"sondas de captura" de oligonucleótidos, que se unen a
conjuntos de oligonucleótidos contiguos. "Sondas exten- cleótidos marcados con enzimas (las moléculas informa-
dedoras" también se unen al oligonucleótido blanco doras) hibridan las ramificaciones de ssDNA del multí-
"capturado" pero en secuencias adyacentes a las de las mero grande por medio de un apareamiento de pares de
sondas de captura. Estas sondas extendedoras también bases homólogas, para formar un "árbol" de dsDNA
contienen secuencias que se unen a cadenas simples de (véase fig. 1-32). La adición del sustrato de la enzima ge-
oligonucleótidos que forman la "cola" de un gran "mul- nera una señal amplificada. Los ensayos de ramificación
tímero" de amplificación ramificado. Luego, oligonu- de la cadena de DNA han sido descritos para la detección

Lavar la sonda
no unida
Tratar con ~ 1 111~
RNAasa 111

~Tooo
Liberar la sonda,
agregar la replicasa
QB

\ de blanco ()

Sitio sensible
Fig. 1-30. Amplificación a la RNAasa 111
de la sonda por la replica-
sa Qbeta. (Redibuj ado de
Persing y col. Diagnostic
Medica! Molecul arbio-
logy: Principies & Appli-
cations. Washington, DC.
ASM, 1993, p. 73.)
 52 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
••
<l
---=--+ o--
o
,,,-/ o-----a
• Pegar al
templado
Mezcla
de moléculas
iniciadoras
~11111111 ~
Etc.+---- 8 copias
4 copias
de muchos virus, incluidos el HIV-1, el de la hepatitis C
y el CMV y han sido usados para detenninar la carga vi-
ral y la respuesta de pacientes a la terapia con distintos
agentes antivirales, entre ellos zidovudina, ganciclovir e
interferón-a. 59 -190.2 15•235
PROBLEMAS TÉCNICOS CON LA PCR
A pesar de que la teoría básica de la PCR y la amplifi-
cación de genes es relativamente simple, una cantidad de
problemas técnicos ha evitado que en la actualidad esta
tecnología sea de uso corriente en las pruebas de labora-
torio clínico. 73 •195•286 Las reacciones falsas positivas cau-
sadas por la introducción de ácidos nucleicos contami-
nantes en las mezclas de reacción son un problema prin-
cipal. La contaminación por ácidos nucleicos se puede
originar por contaminación cruzada en una muestra úni-
ca que contenga un gran número de moléculas blanco, la
contaminación de los reactivos por DNA derivado de
muestras analizadas previamente y la acumulación de
productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por la
amplificación repetida del mismo blanco. En los siste-
mas de amplificación por PCR, LCR y SDA, los ampli-
cones de DNA son la fuente principal de contaminación,
mientras que los productos del RNA son responsables de
las contaminaciones en las pruebas de la 3SR y de la re-
plicasa Qbeta. La presencia ?e "ampli~ones c?ns_truidos"
en los reactivos de laboratonos, matenal de v1dno, auto-
claves y sisLemas de ventilación puede ser un problema
Fig. l-31. Reacción en
cadena de la ligasa. (Re-
dibujado de Persin~ Y
col. Diagnostic Med1cal
Molecu Iarbiology:
Principies & Applica-
tions. Washington, DC,
ASM, 1993, p. 74.)
Ligar,
calentar,
pegar
l
_1_111_11_111_11_111_,
0 0
Ligar,
calentar,
pegar
j
Ligar,
calentar, ~11111111 ~
pegar
<l-----¡¡¡¡¡¡-¡
o------i
2 copias
serio. Cada recipiente de PCR, luego de una amplifica-
ción, puede contener hasta 10 12 copias de un amplicón;
de este modo, incluso una pequeña gota de aerosol pue-
de contener un número significativo de blancos contami-
nantes. Sin embargo, actualmente se dispone de distintas
modificaciones metodológicas para evitar el problema de
la contaminación. 196
A pesar de estos problemas, las técnicas de PCR se es-
tán usando con éxito en muchos centros de investigación
donde las variables pueden ser controladas cuidadosa-
mente. Estas variables incluyen no sólo el espacio físico,
sino también las funciones de los trabajadores del labora-
torio en ese espacio. Ehrlich73 delineó las provisiones es-
pecíficas que deben establecerse en cualquier laboratorio
que desee dedicarse a los análisis por PCR (recuadro 1-5).
Los requerimientos de espacio y del personal para la
realización de análisis de PCR actualmente excluye del
uso de esta tecnología a todos los laboratorios excepto a
ciertos laboratorios de investigación para fines diagnósti-
cos. La ausencia de modos eficaces para detectar ampli-
cones luego de una amplificación por PCR también es un
disuasor para la implementación de. esta tecnología en la
mayoría de los laboratorios clínicos. La utilización de
electroforesis en geles, hibridación en membranas de fil-
tros y las sondas radiactivas son actividades de labor in-
tensa que insumen mucho tiempo y requieren de un per-
sonal altamente entrenado y dedicado. La introducción de
formatos de detección no isotópica acoplados con la auto-
matización pueden representar en el futuro una solución
 BACTERIOLOGÍA BÁSICA 53
Fig, 1-32. Señal de amplifica-

1\
. Romper los Hibridar sondas Hibridar el bDNA
ción basada sobre el DNA rami- (amplificación del
microorganismos
ficado (bDNA). multímero)
Y desnaturalizar al ~_l:~~~fid! la

i
el ácido nucleico Extender
las sondas --

Capturar
las sondas
~I "" "

Hibridar las sondas

marcad!F bc8~;nzimas "-""""\ \ \ 1 / / / / / /

~§
•..•l....
~
l 1

p~a este p~o~lema. La PCR no alcanzará una aplicación

1
Agregar el sustrato
(dioxetano) y medir
qu1m1o=enc1a
~ ll
1 1
•••••
1

yos, pruebas de pericia y control de calidad y seguros de

umversal s1m1lar a otras tecnologías actuales en los labo-
ratorios de microbiología clínica hasta la introducción de
una instrucción formal en técnicas moleculares en los
programas de adiestramiento clínico para técnicos en me-
dicina, en los programas de adiestramiento para residen-
tes en patología y en las becas en microbiología clínica.
Es preciso que se escriban, se adopten y se pongan en
práctica estándares nacionales para la realización de ensa-
calidad antes de que se pueda implementar verdadera-
mente la tecnología de la PCR a gran escala en los labo-
ratorios clínicos. Las consideraciones financieras también
son importantes debido a que pasarán muchos años antes
de que los costos de los métodos de amplificación y de
sondas de ácido nucleico para el diagnóstico de enferme-
dades infecciosas puedan justificarse en comparación con
los métodos convencionales actualmente en uso.

R ECUA DRO 1-5. REQUERIMIENTOS DE LAS INSTALACIONES PARA LA REALIZACIÓN DE LA PCR

l. La instalación debe permitir al menos tres funcio-
nes separadas para acomodar las muestras recibi-
das , desarrollar la reaq:ión y para el análisis/ ampli-
ficación, cada una de ellas en habitaciones separa-
das con abastecimiento y salida individual de aire
que permita un 100% de intercambio de aire con el
exterior y sin intercambio de aire entre los cuartos.
Cada uno de los cuartos del laboratorio debe tener
una esclusa de aire.
2. Los miembros de recepción de muestras del labora-
torio deben ser individuos que no tengan contacto
con DNA o productos de amplificación. Este labora-
torio también puede servir para el procesamiento de
la muestra, la separ.ación en partes alícuotas y el al-
macenamiento y debe estar localizado lo más lejos
posible del laborat9riq de amplificación, con presión
negativa en los pasillos.
3. El laboratorio de desarrollo debe tener presión posi-
tiva en el pasillo y hacia el laboratorio'de amJ?lifica-
ción de modo que el movimiento del flujo no contro-
lado de aire sea desde el laboratorio limpio hacia· el,
laboratorio (sucio) de amplificación. El laboratorio
de amplificación/análisis, a la inversa, debe tener
presión negativa hacia el pasillo y el laboratorio de 1
desarrollo de modo que cuando la gente pasa a tra-
vés de la esclusa de aire la circulación de aire sea ha-
cia el laboratorio y hacia afuera del pasillo.
4. Estos laboratorios no deben estar interconectados di-
rectamente y el personal de laboratorio debe estar'
aislado por tareas. •
5. Cada laboratorio debe estar completamente equipado
con sus propias área de preparación de reactivos. No ~
debe haber, en absoluto, tráfico de cualquier material ·
entre laboratorios, particularmente del laboratorio
s.ucio al laboratorio limpio. También se recomienda
el uso de material .desc¡¡¡:table,, reactivos separa4os
previamente en partes alícuotas y pipetas con despla-1,
zamiento positivo. ! .,. ,--,;;'
 54 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

, ACIÓN EN BACTERIOLOGÍA CLÍNICA

CUADRO 1-5. APUCACIONES SELECCIONADAS DE TECNICAS DE AMPUFI~ -~---·· 1

"---'- "'~
Método Aplicación Referencias
Agente de amplificación
224
PCR Identificación de aislados clínicos
Especies de Aureobacterium
32,214
Bordetella pertussis PCR, PCR anidada Detección
Detección antes, durante y después de la terapia 226
Borrelia burgdo,feri PCR anidada
Detección/identificación 164
Especies de Bruce/la
Identificación/detección en pus y en la capa leucocitaria 62
Burkholderia pseudomallei PCR
Identificación por análisis del 16S rRNA 38
Especies de Campylobacter PCR

CDC grupo IV-c-2 PCR Tipificación de aislados asociados a epidemias 171

Chlamydia trachomatis PCR AMPLICOR Diagnóstico en pacientes asintomáticos . 259

Evaluación de equipos de diagnóstico comerciales 194,209

Estafilococos coagulasa negati- PCR Múltiple Detección de mecA para resistencia a meticilina 264,291
vos
Corynebacterium diphtheriae PCR Detección de cepas toxigénicas 170

Escherichia coli O157:H7 PCR Múltiple Detección de cepas toxigénicas 82

11 Haemophilus ducreyi PCR Múltiple Detección directa en muestras de úlceras genitales 187
11
Helicobacter pylori PCR Detección de microorganismos en biopsias gástricas 145
¡;
Legionella pneumophila PCR Tipificación molecular de cepas asociadas con epide- 94
mias
11

Leptospira interrogans PCR Identificación de leptospiras serovars 296

Complejo Mycobacterium avium PCR Diferenciación de M. avium y M. intracellulare 43
11
Mycobacterium tuberculosis PCR Diagnóstico de tuberculosis pulmonar 18, 105
PCR AMPLICOR Evaluación de equipos comerciales de diagnóstico 20,39,60,282
SDA Detección en muestras del tracto respiratorio 68
PCR Diagnóstico de micobacteriemia 78
Qbeta Detección directa en muestras clínicas 234
Neisseria gonorrhoeae LCR Detección directa en muestras de hisopado urogenital 45

i
Salmonella typhi PCR Tipificación y detección de plásmidos de resistencia 104
Staphylococcus aureus PCR Múltiple Detección de resistencia a meticilina 264
Streptococcus pneumoniae PCR Dete_c~ión de proteínas que se unen a penicilina y a au- 261
tohsma
Streptococcus pyogenes PCR Tipific~ción de cepas por análisis de los genes de la 16
protema M
Treponema pallidum PCR Múltiple Detección directa en muestras de úlceras genitales 187
Yersinia enterocolitica PCR Tipificación de cepas
278

APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA
DE LA PCR EN MICROBIOLO<;.ÍA CLÍNICA
La reacción en cadena de la polimerasa y otras técni-
cas de amplificación y detección poseen una variedad de
aplicaciones en el laboratorio de microbiología clínica
(cuadros 1-5 a 1-8). En bacteriología clínica, la PCR pue-
de ser usada para la detección/identificación directa de
rcroorg~nis~os, d~tección de genes que codifican para
actores e vrrulencia, detenninación de la presencia de
f¡;~:i~:itcf
:~!ª!~~!d~es la resi~tencia anti~cro~iana y la
epidemiológicas L dbacte_r~anos _en las mvesttgaciones
· a etecc1on e 1d ffi ·, .
croorganismos por la PCR en 1 1cac1on de mi-
para aquellas bacterias es probablemente más valiosa
difíciles de hacer crecer ~ue crde~en lentam~nte, que son
n me ios convencionales o que
 BACTERIOLOGfA BÁSICA 55

CUADRO 1-6. APLICACIONES

SELECCIONADAS DE TÉCNICAS DE AMPLIFIC \CION EN ~IICOLOGÍA CLÍNICA

Método
Agente
de amplificación Aplicación Referencias
Especies de Aspergillus PCR Detección en muestras de lavados broncoalveolares 266
Especies de Candida PCR 253
Identificación y caracterización por huellas digitales de DNA
Pneumocystis carinii PCR 154
Detección en muestras del tracto respiratorio

no posee~, sist~mas _de cultivo sensibles. Protocolos para
la detecc1on e 1dent1ficación por PCR han sido descritos
para ~uchas bacterias; entre ellas se encuentran Myco-
bacterzum _tubercul_osis, otras micobacterias, Chlamydia
t~achoma~is, especies de Bartonella, Bordetella pertus-
s!s, especies de Bruce/la, Francisel/a tularensis y espe-
cies de My~~plasma. 1~.24.J2.4J.69.121.209_2s9 A pesar de que las
sondas de ac1do nucleico han sido utilizadas exitosamen-
te en 1~ confirmación en cultivos de especies de Myco-
bacterzum, como se mencionó antes, las sondas carecen
de la sensibilidad para la detección directa de DNA o
rRNA micobacteriano en esputo y otras muestras clínicas
sin amplificar. Tanto la investigación básica como la apli-
cada se encuentran actualmente dedicadas a desarrollar
métodos de PCR para amplificar secuencias repetitivas
de DNA o rRNA específicas para Mycobacterium tuber-
culosis, con vistas a que el diagnóstico de tuberculosis
pueda ser reducido a un procedimiento de 1 o 2 días en
lugar de los muchos días o semanas requeridos para los
métodos convencionales. 24 ·75•100 El procesamiento de las
muestras, la extracción de ácidos nucleicos específicos
para especies de Mycobacterium y la amplificación se

CUADRO 1-7, APLICACIONES SELECCIONADAS DE TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN EN VIROLOGÍA CLÍNICA

Método de
Agente amplificación Aplicación Referencias

Adenovirus PCR Identificación de subgéneros en aislados humanos 131

Citomegalovirus PCR Detección de virus en sangre, líquido cefalorraquídeo 97, 183,270

Enterovirus PCR Detección en muestras clínicas; tipificación de cepas !O, 289

Hepatitis C PCR Detección en suero 17

bDNA Cuantificación de virus en suero y plasma 59

Hepatitis E PCR Detección en materia fecal y suero 260

Virus del herpes simple tipo 2 PCR Evaluación de la evolución del tratamiento 64

Virus del herpes simple tipos l PCR Múltiple Detección directa en muestras de úlceras genitales 187
y2

Herpesvirus humanos 6 y 7 PCR Desarrollo y detección directa en muestras de nódulo linfático 230

Virus de la inmunodeficiencia NASBA, PCR, Cuantificación de HIV-1 en suero (carga viral) 215
humana bDNA
PCR Cuantificación de RNA de HIV-1 y DNA proviral 158

Papilomavirus humano . PCR in situ Detección de virus en carcinomas del cuello del útero 13

Parvovirus humano Bl9 PCR Detección directa de virus en suero l06

Virus del sarampión PCR Detección de virus en orina 220

Virus sincitial respiratorio PCR Diferenciación de cepas de vacuna y salvajes de RSV; subti- 93,294
pificación de muestras

Virus de la rubéola PCR Diagnóstico de rubéola congénita intrauterina y durante la in- 25

fancia

56 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
I'
Método
Agente de amp/ificaci611
'culas iniciadoras y sondas; detección en biopsias
Enterocytozoo11 bieneusi PCR Desarro 11 o de mo le
intestinales
Diagnóstico/seguimiento de infecciones diseminadas
Encephalitozoon hellem PCR
Detección de parásitos de la malaria en muestras de sangre
Especies de Plasmodium PCR
Diagnóstico/seguimiento de toxoplasmosis diseminada
Toxoplasma gondii PCR
Detección comparada con métodos microscópicos
Trypanosoma cruzi PCR
pueden realizar el primer día y los productos se analizan
en el segundo día. La prueba de AMPLICOR PCR para
Mycobacterium tuberculosis (Roche Molecular Systems,
Branchburg, NJ), una adaptación comercial de la meto-
dología de la PCR, se muestra promisoria para la detec-
ción directa de M. tuberculosis en muestras clínicas. 20
La reacción en cadena de la polimerasa y otros méto-
dos han sido usados para detectar y caracterizar genes que
codifican para distintos factores de virulencia, como las
enterotoxinas y los factores de resistencia antimicrobia-
nos. Kato y col., comunicaron que las cepas toxigénicas y
no toxigénicas de Clostridium difficile podían ser diferen-
ciadas por medio de oligonucleótidos iniciadores de las
secuencias no repetidas del gen de la toxina A para ampli-
ficar un producto de DNA de 1.266 pb. 125 El DNA extraí-
do de cepas no toxigénicas de Clostridium difficile no hi-
bridaban, indicativo de que carecían del gen de la toxina
A. Víctor y col., utilizaron la PCR para amplificar una
reacción altamente conservada de la subunidad A del gen
tennosensible de la enterotoxina de Escherichia coli. Es-
tas cepas productoras de la toxina tennosensible eran res-
ponsables de alrededor del 9% de las diarreas no diagnos-
ticadas en su serie de estudios. 268 Los genes que codifican
la resistencia a meticilina en los estafilococos también
han sido amplificados y detectados por PCR. 127
La tecnología de la reacción en cadena de la polimera-
sa también ha sido evaluada para el diagnostico de sífilis
y otras enfermedades causadas por espiroquetas. Grim-
pel y col., encontraron que la PCR era un aditamento útil
en el diagnóstico de sífilis congénita por detección de
Treponema pallidum en líquidos amnióticos de mujeres
embarazadas con sífilis no tratada. 96 Muchos estudios
han demostrado el valor de la PCR en el diagnóstico de
la enfermedad de Lyme. Rosa y Schwan fueron los pri-
meros en aplicar la PCR a la detección de Borrelia burg-
dorferi, con la detección exitosa en 17 de las 18 cepas
examinadas. 219 El gen de la proteína de superficie exter-
na A, localizado en la espiroqueta en un plásmido lineal,
ba sido utilizado como un blanco de PCR para la detec-
ción de B. burgdorferi. Wise y Weaver, en contraste, uti-
lizaron una región de 419 pares de bases de la secuencia
génica de la flagelina de B. burgdorferi como secuencia
blanco para PCR. 281 Se consiguió ~na sensibilidad a ni-
vel de l a 1Oespiroquetas por med10 de una sonda espe-
cífica de gen y no radiactiva. Kron y col. utilizaron la
PCR en estudios epidemiológicos para detectar B. burg-
r
Referencias
Aplicaci611
54, 81
65
132
12, 70
133
dorferi en tejidos obtenidos de ~arra~~tas infectadas, lo
cual brindó una alternativa a la d1secc10n de garrapatas142Y
a los análisis indirectos con anticuerpos fluorescentes._
Esta tecnología también ha teni~o ~pl_icacione~ de m-
vestigación en el diagnósti~o paras1tolo~~º· Tach1bana Y
col., diferenciaron entre aislados patolog1cos Y n? pato-
lógicos de Entamoeba histolytica ~on la tecnol_o~1a de la
PCR para amplificar una secuen_c1a de nucl_eot1do~ que
codifican para un antígeno asociado a la v~!enc1a de
30.000 megadaltons. 246 Kirchhoff y co!., uttlizar~m la
PCR para Trypanosoma cruzi para momtorear la infec-
ción en ratones infectados experimentalmente. 133·172 Du-
rante la infección aguda, la PCR detectaba microorganis-
mos en el torrente sanguíneo 4 días antes que el examen
microscópico. La PCR también fue positiva a lo largo de
la fase crónica de la enfermedad, mientras que la positi-
vidad microscópica fue intermitente. Los métodos de
PCR también han sido publicados para la detección di-
recta de Toxoplasma gondii. En una comunicación, el
ácido nucleico de tan poco como 10 microorganismos in-
dividuales pudo ser detectado en presencia del DNA de
100.000 Jeucocitos. 33 Se ha comunicado un método aba-
se de PCR para el diagnóstico de infección por micros-
poridios, específicamente Enterocytozoon bieneusi, que
utiliza pares de iniciadores adyacentes a la secuencia úni-
ca de la subunidad menor del rRNA. 54
La reacción en cadena de la polimerasa y otras técni-
cas de amplificación son de particular utilidad y altamen-
te sensibles para la detección de antígenos virales, mu-
chos de los cuales no pueden ser cultivados en los siste-
mas de cultivos utilizados de rutina. En un estudio de
Puchhammer-Stockl y col., el DNA del virus de la vari-
cela zoster fue detectado en el líquido cefalorraquídeo de
pacientes sintomáticos con una infección por ese virus
luego de la amplificación por PCR. 2º7Arthur y col. detec-
~'.11"on DNA de los poliomavirus humanos BK y JC en te-
Jtdo cerebral y en orina luego de la amplificación por
PCR con el uso de un solo par de oligonucleótidos inicia-
dores de 20 bases complementarios a las secuencias
comp~idas en la misma región de ambos virus. 11 Cao y
col. aplicaron la PCR a la detección rápida de infeccio-
nes cután~as por el virus del herpes simple. 37 Cassol y
col. a_mphficaron_ DNA del CMV en muestras clínicas
obtemdas d~ pacientes con trasplante de médula ósea.4º
tecn_ologta de la PCR también ha tenido una aplica-
c10n exitosa para la detección de papilomavirus humano

en tejidos normales y
236.293 E t é . anormales d 1
ro. .s as t crucas tambié cuello del úte-
la d~tecc16n. ~e distintos v~s han sido utilizadas para
(p. eJ., hepatitis E en materia " causantes de hepatitis
ro). 11.59.260 . ,ecal ' hep ªt't•
1 Is C en sue-
La reacción en cadena d 1 . plasnudos o elementos transponibles que codifiquen pa-
de biología molecular se he ª pohmerasa y otras técni·cas
an convern·d
po derosas para el diagnósf o en herramientas
nes por el HIV-1.211.284 El
ficas para HIV-1 ha detenni J el ranejo de las infeccio-
e PCR Y sondas especí-
detectado en linfocitos d na O que el HIV-1 puede ser
. " e sangre p .,,, ·
m,ectadas 3 a 6 meses ant d en,enca de personas
sión 111.130,160.1s9 Las t' . es e que ocurra la seroconver
. . ecrucas de PCR .,
dar en el diagnóstico de la •w ., tamb1en pueden ayu-
nacidos, para quienes los {c~ion por my-1 en recién
nóstico se encuentran impedi~is os serológ1co~ de diag-
cuerpos transplacentarios.42.1s 3.218 ~r la presencia de anti-
cación de genes también han s·d ~.métodos de amplifi-
1
nar el significado de West ? uti IZados para determi-
persistente o transitoriamen~~n~n~un?blots para HIV-1
dios indican que aquel! e errnmados. Estos estu-
. . as personas que se e
baJo nesgo de ~ontraer una infección por HI~:tntran _en
nen un patrón , •mdeterrninado de Wiestem bl ot rara y que
veztie:
al guna, estan infectadas por el HIV-l 113 C 1
· , d dr • • · on a aproba-
c1on e ogas anuvrrales para el trat~m;ento d 1 . "
'6 HIV 1 (' . . ""'-' e a m,ec-
~1 ? por - mhibidores de la transcriptasa inversa
inh1b1dores
. . de proteasa
. , etc ·), PCR y otras t,ecmcas . de am-'
p~cación han ~ido desarrolladas para monitorear muta-
c10nes en la región poi_ del genoma viral para el análisis
de c~pas de HIV-1 resistentes a la zidovudina.1s1.1s2 Las
rela~1,ones entre los niveles d~ ~A en el plasma y la pro-
gres10n d~ la enfermedad chruca han sido detenninadas
con estud10s de amplificación. ws.191,201.21s,233 Como resul-
tado, tanto los métodos de PCR como los de ramificación
de cadena del DNA se están considerando para el moni-
toreo de la c~ga _v~al, la_determinación de la replicación
del HIV-1 en mdiv1duos infectados y la cuantificación de
las respuestas a distintas intervenciones terapéuticas. Fi-
nalmente, la PCR y los métodos de sondas han sido desa-
rrollados para diferenciar el HIV-1 del HIV-2 y han sido
utilizados para demostrar la presencia de ambos virus en
unos pocos pacientes.212.213,216
MÉTODOS DE TIPIFICACIÓN EPIDEMIOLÓGICA
En el pasado, la subtipificación y la caracterización de
un aislamiento bacteriano involucrado en infecciones
hospitalarias o brotes epidémicos se llevaba a cabo por
métodos fenotípicos, como la biotipificación, la serotipi-
ficación, la tipit'j.cación por fagos y la susceptibilidad a
bacteriocinas. La biotipificación se basa sobre el estudio
de las actividades metabólicas de los microorganismos,
como la utilización de carbohidratos o la producción de
ciertos productos metabólicos finales. Los métodos de
biotipificación, de todos modos, generalmente carecen
de reproducibilidad y de capacidad discriminatoria. Por
ejemplo, cepas de Haemophilus injluenzae pueden tener
reacciones biotípicas idénticas (basadas sobre la produc-
ción de indo), ureasa y omitina descarboxilasa; véase
cap. 7) pero pueden mostrar patrones difer~nte_s e? el
análisis de las proteínas de la pared celular, md1cat1vos
de que las dos cepas son verdaderamente diferentes. Los
patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos tam-
bién han sido utilizados para la caracterización de cepas,
BACTERIOLOGfA BÁSICA 57
especialmente cuando los microorganismos asociados
con gru~os de infecciones tienen perfiles de susceptibili-
d~d part1culare_s o poco ~omunes. Sin embargo, la capa-
c1~ad ?e los nucroorgamsmos para adquirir rápidamente
ra la_ r~siste~cia limita en cierto modo este enfoque.ª·161
La Up1ficac1ón por bacteriófagos (usualmente utilizada
para estafilococos) y la susceptibilidad a bacteriocinas
(p. ej., la tipificación por piocinas de Pseudomonas aeru-
ginosa) están limitadas en gran parte por la falta de dis-
P?,nibilidad de reactivos de alta calidad y de estandariza-
cion.23·2º2 Aunque la serotipificación ha sido el método de
-
referencia para la caracterización de cepas de ciertos mi-
c_roorganismos (es decir, tipificación por antígeno somá-
tico o flagelar de especies de Salmonella), esta técnica
también está limitada por la disponibilidad de reactivos.
La capacidad de la serotipificación para diferenciar entre
c~pas tambi~n puede estar limitada por la abundancia de
c~ertos_ serot1pos entre los aislamientos clínicamente sig-
mficativos y la presencia de cepas no tipificables seroló-
gic~mente. Los anticuerpos monoclonales para la tipifi-
cación de cepas han demostrado una utilidad significati-
s1 va para algunos microorganismos, como Neisseria go-
• norrhoeae, pero la abundancia de ciertas serovariedades
de gonococos puede requerir el uso de métodos adiciona-
les de tipificación (p. ej., auxotipificación por requeri-
mientos nutricionales; véase cap. 10) para lograr la dis-
criminación adecuada entre cepas. 135 ·136 El análisis mole-
cular de las moléculas ultraestructurales bacterianas co-
mo lipopolisacáridos, principales proteínas de la cara ex-
terna de la membrana celular, y los ácidos nucleicos son
ahora los métodos de elección para la caracterización de
cepas de microorganismos. Esto ha surgido debido al de-
sarrollo de técnicas de separación de alta discriminación
(p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida [PAGE]),
la disponibilidad de programas analíticos de computa-
ción y la explosión virtual de la tecnología de los ácidos
nucleicos con el desarrollo de las sondas y las técnicas de
amplificación.
La tipificación de bacterias por el análisis de la totali-
dad de las proteínas de la célula se puede efectuar me-
diante una técnica llamada electroforesis enzimática
multilocular. Este método caracteriza a las proteínas ce-
lulares por separación electroforética en una matriz de al-
midón y luego los geles son expuestos a sustratos cromó-
genos para la detección de actividades enzimáticas. 232
Las diferentes movilidades de las enzimas proteicas en la
matriz del gel de almidón se traducen en diferencias en
la secuencia polipeptídica que está codificada en el DNA
de la bacteria. Por lo tanto, se puede decir que microor-
ganismos con diferentes movilidades enzimáticas perte-
necen a cepas diferentes.
Los métodos de tipificación que se basan sobre los áci-
dos nucleicos incluyen el análisis de plásmidos, el análi-
sis de restricción con endonucleasas, huellas digitales
(finger printing) con sondas de DNA y huellas digitales
por PCR. El análisis del contenido de plásmidos fue uno
de V los primeros métodos basados sobre el ácido nudei- 166
co usados para la caracterización de microorganismos.
Estas moléculas de DNA autónomo transmisible y extra-
cromosómico pueden ser extraídas con relativa facilidad
de las células y separadas por electroforesis en. un gel de
agarosa según su tamaño. El análisis ~e plásnudo~ e~ u?
método analítico apropiado para estudiar brotes ep1derru-
58 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
cos que de alguna manera están restringidos en el tiempo
y el espacio.122•125 La capacidad discriminatoria del sim-
~le análisis de plásmidos no es adecuada para las inves-
tigaciones epidemiológicas prolongadas porque los mi-
croorganismos pueden perder o ganar plásmidos y trans-
posones cuando son expuestos a presiones selectivas
(p. ej., cambio en el tratamiento antibiótico) a lo largo del
tiempo. La extracción de plásmidos y el tratamiento con
endonucleasas de restricción antes de la electroforesis in-
crementa significativamente la utilidad del análisis de
plásmidos.
El análisis con endonucleasas de restricción depende
del uso de enzimas producidas por¡varias bacterias lla-
madas endonucleasas de restricci,n. Éstas son enzimas
que cortan el DNA en secuencias específicas de recono-
cimiento compuestas por cuatro a seis pares de bases.
Las enzimas de restricción más utilizadas incluyen
EcoRI (de E. coli), HindIII (de H. injluenzae) y BamHI
(de Bacillus amyloliquefaciens). Para llevar a cabo el en-
sayo de huellas digitales, el DNA cromosómico o el del
plásmido se aísla y se trata con la endonucleasa de V res-
tricción. Este tratamiento resulta en la generación de va-
rios fragmentos, cuyos tamaños son determinados por el
contenido de secuencias de reconocimiento en la molé-
o ~º o Células
0
1 DNA
1 DNA cortado luego
del tratamiento con
endonucleasa
1
Electroforesis --+
1 o ribotipificación
Gel---4'- Membrana
Transferencia
(blottlng)
o
Membrana
Reconocimiento
rRNA marcado no con sondas
radiactivamente
culas. La separación de los fragmentos _obte_nid~s por
electroforesis en geles de agarosa y su v1Sual1zac1ó_n _se
lleva a cabo con el teñido del gel con bromuro de et1d10.
Las diferencias (polimorfismo) en el tamaño de los frag-
mentos de DNA generados por tratamiento con endonu-
cleasas de restricción son llamadas polimorfismo de
longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (fig.
1-33). Con este método, los aislamientos de brotes hos-
pitalarios o de grupos relacionados pueden ser analizados
para ver si tienen el mismo o diferentes RFLP. La elec-
troforesis en gel con campo pulsante (PFGE) es un ti-
po especial de análisis de RFLP. 228 En la PFGE, suspen-
siones de células bacterianas completas se colocan sobre
tacos de agarosa, son lisadas in situ, y tratadas con enzi-
mas de restricción que generan un pequeño número de
fragmentos relativamente grandes de restricción. Estos
fragmentos son luego corridos por electroforesis en un
campo eléctrico donde las polaridades del campo eléctri-
co son invertidas periódicamente en lugar de permanecer
constantes. Este método produce pocos pero fragmentos
grandes de DNA que son separados limpiamente en ban-
das resultantes de electroforesis. El análisis de PFGE ha
sido aplicado en estudios epidemiológicos de una gran
variedad de microorganismos. 15.85.143.185.203.205,231 .255.285
Fig. 1-33. Procedimiento para el análisis de polimor-
~sm~s .por l?ngitud de los fragmentos de restricción y
nbo~ipifica?16n. (Redibujado de Persing y col. Diag-
no~tJ.c Medica! Molecularbiology: Principies & Appli-
catJons. Wash!_ngton, DC, ASM, 1993, p. 35.)

El análisis de RFLP tamb·,
rencia de DNA sometido a ·e,:~~r
análisis de sondas de DNA tn puede asociarse con el
se log:a por la transfe-
nitrocelulosa (denominada So th oforesis sobre papel de
del papel con los fragmento: d:rn b!~t) tia exposición
st
separados, a una sonda marcada ;e nc~10n adherentes
diografía se emplea para detectar h"I~ ~ana_s; L~ autorra-
das son marcadas con nucleósido n?ac!on s1 las son-
das tratadas con biotina se pued s ~adiactivos .. Las son-
vidina-peroxidasa de rab . en acer reaccionar con
a amto y lu
ustrato de la enzima par gen erar unaego "b se d ,,exponen al
S 1
donde la sonda ha hibridado L an ~. co oreada
estos análisis pueden ser so.me~~d~~n~a~-~t!hza?,ªs para
fragmentos de DNA cromosómico i n?ac10n p~ra
· , secuencias especifi-
cas de DNA (p. eJ. , aquellas que cod"fi
de virulencia similares a la producc1·0,1 icdan Pª? factores
-¡· · d f n e toxmas) o rR-
NA. El ana 1s1s e ragmentos de restncc1on . . , con sondas
que· d·fi
etectan r RNA se denomina riboti'p'fi ., L .
·6 h · 1 1cac1on a n-
bot1p1
. •cac1
, n ba .sido
.fi ampliamente
., us ad a para 1a·carac-
tenzac1on y su t1p1 cacion epidemioló . d
especies de bacterias.19.44.l4J.20J.2os. 23 1. 255 gica e muchas
El método de
. la. reacción
, en cadena de 1a po11merasa .
usado en comb mac1on c?n las técnicas detalladas también
mu~~tra un potencia) para la tipificación o subtipifi-
cac1on
, . deDaislados
, dbactenanos con propósitos ep·d I em10
· _
1og1cos.. espues e_ una amplificación por PCR de una
secuencia o secuencias específicas de DNA, los amplico-
nes pueden ser tratados con endonucleasas de restricción
para generar fragmentos polimórficos de restricción. Esos
fragmentos pueden ser luego analizados electroforética-
mente (análisis PCR-RFLP). Grandes cantidades de frag-
me,n~~s homogéneo~ de J?,NA pueden ser generados por
anahs1s con la mod1ficac10n de los procedimientos de la
PCR (p. ej., PCR anidada). El análisis del rRNA 16S por
PCR-RFLP se puede emplear para la identificación de
nuevas especies de microorganismos y verificar las rela-
ciones entre microorganismos porque estos genes están
muy conservados dentro de las especies. La caracteriza-
ción de secuencias basadas sobre la PCR ha sido utiliza-
da para identificar microorganismos de descripción re-
ciente o no cultivables y para subtipificar una gran varie-
dad de patógenos fúngicos y bacterianos, que incluyen
micobacterias, legionella pneumophila, Clostridium dif-
ficile, Helicobacter pylori, especies de Bartonella. Myco-
plasma pneumoniae, especies de Aspergillus y especies
de Cryptococcus 6,16.J7.47.84,94,16s.m .241 ,249 La PCR y otras
técnicas de amplificación también se pueden utilizar para
generar segmentos únicos de DNA que pueden ser se-
cuenciados directamente por procedimientos automáticos
de secuenciación de DNA. Con este enfoque se puede de-
terminar la secuencia verdadera de nucleótidos en un
fragmento de DNA.
La PCR y otras técnicas de amplificación pueden tener
un efecto profundo en el acortamiento de los tiempos y
e_n el incremento de la certeza del diagnóstico de una va-
74
r!edad de infecciones por microorganismos. Ehrlich es-
limó que las prioridades iniciales en la aplicación de la
tecnología de la PCR estaban dirigidas a la detección de
aquellos agentes infecciosos para los cuales los métodos
de investigación alternativos resultaban costosos y engo-
rrosos, o en los cuales la demora en el diagnóstico era
causada por el crecimiento lento de los microorganismos
en los medios de cultivo convencionales. Sugirió la posi-
bilidad del desarrollo de paneles de prueba, en los cuales
8ACTERIOLOGIA BÁSICA 59
secuencias únicas particulares amplificadas de DNA de
varios microorganismos pudieran ser desarrolladas si-
multáneamente para el uso específico en especialidades
médicas. Por ejemplo, Ehrlich propuso la posibilidad de
ofrecer un "panel de hígado" consistente en pruebas pa-
ra los virus de la hepatitis (tipos A, B, C, D, E, y F), el
CMV y el virus de Epstein-Barr. A través de un enfoque
multidisciplinario que combine los emprendimientos de
científicos investigadores que trabajan en nuestras insti-
tuciones académicas, los recursos disponibles desde la
industria, el diagnóstico de médicos dedicados y el cono-
cimiento de los técnicos en el laboratorio de diagnóstico,
la facilidad y la certeza con que los síndromes infeccio-
sos se podrán diagnosticar en el futuro es virtualmente
ilimitada.
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