La Agregometra plaquetaria por transmisin de luz (ATL) fue

desarrollada en forma independiente por Born y por OBrien

en 1962 y casi cinco dcadas despus, sigue siendo el
estndar de oro para el estudio de la funcin plaquetaria sin
haber sido hasta ahora desplazada por nuevas tecnologas
como el PLATELET FUNCTION ANALYZER (PFA-100), el SISTEMA
VERIFY-NOW y la CITOMETRA DE FLUJO, entre otros.
Su principal uso es el estudio de los pacientes que sangran
por trombo-citopata; sin embargo, recientemente se le ha
usado para estudiar a pacientes con trombosis y para vigilar
el efecto de los frmacos antiplaquetarios.
Las plaquetas maduras que han sido liberadas de los megacariocitos
tienen una forma plana y discoidea, miden aproximadamente
3 x 0.5 m y tienen un volumen plaquetario medio de 6-10 fL.
Su vida en la circulacin es de 7 a 10 das. La apariencia exterior es rugosa
por las aberturas del sistema canalicular abierto (SCA), una serie de
tbulos revestidos de membrana que sirven de comunicacin hacia el
exterior y donde se libera el contenido de los grnulos cuando las
plaquetas se activan.
La membrana celular de las plaquetas es el sitio donde se llevan a
cabo las reacciones de la coagu- lacin (hemostasia secundaria) y es
una bicapa de fosfolpidos y colesterol, con diversas protenas que
representan molculas de adhesin y receptores para diversos
agonistas.

Cuando las plaquetas se activan, cambian de su forma discoidea a

una forma irregular con mltiples prolongaciones. Esto se debe a
cambios en el esqueleto contrctil (compuesto de actina, filamina,
talina, vinculina y otras protenas semirrgidas) y en el anillo marginal de
microtbulos (formado de tubulina).
 LAS PLAQUETAS CONTIENEN
TRES TIPOS DE GRNULOS
GRNULOS DENSOS (G):
Son los menores en tamao y en nmero (4 a 24 por plaqueta).
Contienen agonistas que amplifican la activacin plaquetaria actuando
solo sobre plaquetas vecinas: Adenosn difosfato (ADP), adenosin
trifosfato (ATP), serotonina y cationes divalentes como el calcio y el
magnesio.5-8
GRNULOS ALFA (D): son los ms numerosos (40 a 80 por plaqueta) y
ms grandes. Contienen: protenas adhesivas (Factor de Von
Willebrand
FvW-, fibringeno, fibronectina, vitronectina y trombospondina),
agentes hemostticos (factor V, protena S, PAI-1, etc.) y factores de
crecimiento (factor de crecimiento derivado de las plaquetas
PDGF-, el pptido activador del tejido conectivo
-CTAP III-, el factor de crecimiento transformante beta, etc.).
LISOSOMAS:
Con enzimas hidrolticas. Su funcin en las plaquetas no se conoce.
 La unin de las plaquetas a los sitios de lesin vascular se realiza a travs de los
receptores de membrana para el FvW y para la colgena, que son:

GP Ib/ IX/V y
GP Ia/Iia
GP IV
GP VI

En condiciones de alto flujo sanguneo la nica glucoprotena con capacidad

de unirse al sitio de lesin es la GP Ib, que establece una unin dbil con el FvW y
la colgena subendotelial expuesta. Como esta unin inicial de las plaquetas es
dbil, el flujo sanguneo hace que estas plaquetas rueden sobre la superficie
vascular daada hasta que una unin firme se establece entre los receptores
para la colgena (GP Ia/IIa y GP VI principalmente) y la colgena subendotelial.

Despus de su unin a la colgena subendotelial expuesta por la lesin, las

plaquetas se activan adquiriendo seudpodos que les permiten unirse ms
fuertemente entre si y liberan los agonistas contenidos en los grnulos,
permitiendo la agregacin plaquetaria (unin entre plaquetas a travs de la GP
IIb/IIIa usando como puente al fibringeno).

Todo esto resulta en la formacin de un tapn plaquetario.

Entre los agonistas plaquetarios se encuentran el:
ADP; contenido en los grnulos densos
Trombina; que resulta de la activacin de la hemostasia secundaria
Colgena; presente en el subendotelio
Adrenalina; amina del plasma
Acido Araquidnico; liberado al activarse las plaquetas
Serotonina; presente en los grnulos densos
OTROS
Cuadro 2.1
Cuadro 2.2)

La GP IIb/IIIa (llamada integrina DIIbE3) es el receptor plaquetario

del fibringeno y es un receptor indispensable para la agregacin
plaquetaria. Es la glucoprotena ms abundante sobre la superficie de
las plaquetas (50 a 80 mil por plaqueta).
RECEPTORES DE ADHESIN
Y
AGREGACIN PLAQUETARIA
 La GP Ib/IX/V; Es un complejo formado por GP Ib D, Ib E, GP IX y GP V
con una relacin 2:2:2:1.
La GP Ib D; Es la subunidad ms importante ya que es el sitio de unin
al FvW. El dominio intracitoplasmtico interacta con el citoesqueleto
(actina, filamina, etc.) y con la fosfolipasa A2, lo que inicia la activacin y el
cambio de forma en las plaquetas.

La GP VI; Es un receptor para la colgena que pertenece a la familia de

las inmunoglobulinas. Tiene la habilidad de generar seales intracelulares
gracias a su asociacin con una segunda molcula, el receptor Fc gama
(FcRJ).
El receptor Fc; Gama tiene en su cola citoplasmtica motivos de
tirosina (ITAM), que se relacionan a otras tirosina cinasas como Syk, Lyn y
Fyn que activan numerosas vas de sealizacin a travs de la formacin
de 1,4,5-trifosfato de inocitol (IP3) y 1,2-dia- cilglicerol (DAG)
RECEPTORES PLAQUETARIOS
 Los receptores unidos a protenas G estn constituidos por 7 regiones
que atraviesan la membrana, con su segmento N terminal en el exterior y
el segmento carboxi terminal en el citoplasma. El bucle C3 y C4 son los
que estn implicados en la interaccin con las protenas G. Entre los
agonistas plaquetarios que tienen receptores 7 transmembrana unidos a
protenas G estn la trombina, el ADP, el tromboxano A2 (TxA2) y la
adrenalina.

Los receptores celulares para la trombina son una nica clase de

receptores conocidos como PAR (receptores activados por proteasas),
que son receptores 7 transmembranales unidos a protenas G, pero a
diferencia de los dems, los PAR son activados por escisin proteoltica
de su primer asa extracelular. A la fecha se han descrito 4 PAR, de los
cuales el 1, el 3 y 4 son receptores para la trombina. El PAR1 es el ms
importante y el prototipo de los receptores para trombina.
 Los receptores para ADP presentes en las plaquetas son el P2Y1, P2Y12
y P2X1, los dos primeros son receptores 7 transmembrana unidos a
distintas protenas G y el ltimo es un canal para calcio activado por
ATP.
El ADP no es un agonista muy fuerte, sin embargo es muy importante
ya que viene en los grnulos densos y amplifica la respuesta
plaquetaria inducida por otros agonistas. El receptor P2Y1 esta
acoplado a la protena Gq, que es responsable de la activacin de la
fosfolipasa C la cual transforma al 4,5-fosfatidilinocitol bifosfato (PIP2)
de la membrana celular a 1,4,5-trifosfato de inocitol (IP3) y 1,2-
diacilglicerol (DAG).
El IP3 libera calcio y el DAG activa a la Proteincinasa C. El incremento
en la cantidad de Ca intracelular activa a la Fosfolipasa A2, la cual
libera cido araquidnico de los lpidos de la membrana, y de este se
sintetiza tromboxano A2 (TxA2) mediante la enzima ciclooxigenasa 1
(COX-1). El receptor P2Y12 esta acoplado a la protena Gi, la cual
inhibe la formacin de AMPc (adenosn monofosfato cclico, que
permite la activacin plaquetaria por otras vas).
AGREGOMETRIA PLAQUETARIA

Desarrollada desde 1962 por

Born, es un mtodo in vitro para
valorar la funcin plaquetaria. En
un tubo de vidrio un Plasma Rico
en Plaquetas (PRP) es agitado, lo
que obliga a sus plaquetas a
entrar en contacto. La adi- cin
de un agonista al PRP activa a las
plaquetas que se agregan en
presencia de fibringeno. La
agregacin es medida con el
principio turbidimtrico de Born
que se basa en la diferencia en
la transmisin de la luz en el PRP
comparndolo con el plasma
pobre en plaquetas (PPP)
 AGREGOMETRO

El agregmetro consiste de una fuente de luz, cuyos haces atraviesan

el tubo que contiene el plasma a estudiar.
La intensidad de la luz es captada por una fotocelda que enva los
datos a un procesador electrnico computarizado para elaborar un
registro grfico. El tubo que contiene la muestra de plasma lleva en su
interior una barra de hierro que por magnetismo gira para obligar a
las plaquetas de la muestra a entrar en contacto unas con otras. Las
reacciones se llevan a cabo a 37C, temperatura que es mantenida
por un sistema trmico
 El registro grfico resulta de dibujar el grado de transmisin de la luz
a travs de la muestra de plasma rico en plaquetas (en el eje vertical
o de las ordenadas) en funcin del tiempo (en el eje horizontal o de
las abscisas). La transmisin de la luz por el plasma pobre en
plaquetas representa el punto mximo de transmi- sin de la luz (ya
que el PPP no es turbio por la falta de plaquetas), mientras que la
transmisin de la luz por el plasma rico en plaquetas representa el
punto mnimo de transmisin de la luz (ya que el PRP es turbio en
ausencia de agonista).
 Cuando el agonista es agregado al PRP, inicia un trazo similar donde la
lnea basal es interrumpida por una pequea espiga que indica el
momento en que se agrego el agonista a la muestra, seguido de una onda
negativa por disminucin de la transmisin de la luz al ocurrir el cambio de
forma en las plaquetas activadas. Despus se dibuja un trazo positivo que
dependiendo del agonista empleado podr en forma normal tener una o
dos curvas, donde la transmisin de la luz incrementa al paso del tiempo
por la agregacin de las plaquetas (es decir, el PRP pierde turbidez y se
aclara permitiendo el paso de mas luz a medida que las plaquetas van
agregando).
 CONDICIONES PREANALTICAS Y
PROCESADO DE LA MUESTRA
Para la prueba de Agregometra solicitamos al paciente al menos seis
horas de ayuno. El paciente debe estar libre de medicamentos que
puedan interferir con la funcin plaquetaria (por ejemplo AINEs,
aspirina, algu- nos antidepresivos y antihipertensivos), a menos que lo
que se quiera evaluar sea precisamente el efecto de algn frmaco
antiagregante en el paciente. Se ocupa sangre obtenida de una
puncin no traumtica, a travs de una aguja al menos de calibre 21G
en adultos y calibre 23G en nios. El anticoagulante empleado debe
ser el citrato de sodio al 3.2%. Con 30 a 40 mL de sangre es suficiente. El
PRP es obtenido por centrifugacin de la san- gre anticoagulada con
citrato de sodio por 10 min a 1000 rpm. Este es separado en un tubo de
plstico con ayuda de una pipeta de transferencia (tambin de
plstico). El sobrante se vuelve a centrifugar por 10 min a 3000 rpm,
para obtener el PPP. Algunos autores recomiendan llevar el nmero de
plaquetas en el PRP a 200-300 x 109/L adicionando PPP15 aunque algunos
autores sealan que este paso no es necesario.
 CONCENTRACIONES DE
TRABAJO DE LOS
AGONISTAS
los agonistas ms comunes son: adenosn difosfato (adp), adrenalina (adr),
colgena (col), acido araquidnico (aa) y ristocetina (ri). otros agonistas
son:
El ionforo de calcio, el pptido mimtico del txa2 conocido como
u46619, y el trap (pptido activador del receptor de trombina) conocido
como sfllrn.3 la trombina como tal no se puede usar por que estimula la
coagulacin del plasma, no solo la agregacin plaquetaria Las
concentraciones de trabajo varan con el laboratorio.
AGONISTAS FUERTES
Y DBILES
 MECANISMOS
INTRACELULARES DE
RESPUESTA A LOS AGONISTAS
 INTERPRETACIN DE LA
AGREGOMETRA
El mejor uso de la Agregometra plaquetaria es el es- tudio de las
trombocitopatas que originan hemorragia y debe sospecharse
enfermedad cuando hay respuestas anormales con dos agonistas
(excepto Adrenalina 10M y/o ADP 4 M con los que hasta en un
15% de los individuos sanos puede no haber respuesta), o bien, falta
de respuesta al agonista ADP en dos concentraciones diferentes.
En un estudio se encontr que una respuesta normal a Adrenalina 10
M y ADP 4 M tiene un valor predictivo negativo (VPN) de 95%
para trombocitopata,24 por lo que si la respuesta a estos agonistas
est presente y es normal, se descarta en forma razonable un
defecto en la funcin plaquetaria como causa de sangrado. En el
cuadro 5 se resumen los patrones de alteracin en la agregometra
que son caractersticos de alguna patologa, existen muchas otras
alteraciones que son inespecficas.
OTROS USOS DE LA
AGREGOMETRA
Con menor frecuencia se utiliza la
agregometra para valorar un estado de
trombofilia conocido como sndrome de
las plaquetas pegajosas (sticky platelet
syndrome) en el cual las plaquetas
manifiestan hiperagregabilidad. Para su
diagnstico se busca agregacin con
agonistas dbiles a concentraciones ms
bajas que aquellas usadas para estimular
a las plaquetas normales (Adrenalina 0.5
M o el ADP 0.25 M), el tipo I del
sndrome tiene hiperagregabilidad con
Adrenalina y ADP, y el tipo II solo tiene
hiperagregabilidad con Adrenalina.
Recientemente se ha usado a la
agregometra como una herramienta para
diagnstico de resistencia a los
antiagregantes plaquetarios. A este respecto
no hay valores universalmente aceptados
para definir resistencia a la aspirina o al
clopidogrel, pero los estudios clnicos en este
campo definen resistencia a aspirina como
la agregacin > 20% con cido araquidnico
(1 mM) y/o > 70 % con ADP (10 M) en
pacien- tes que usan dosis antiagregantes
diarias de aspirina.

La resistencia a clopidogrel se ha definido

como la agregacin > 70% con ADP (5 a 10
M) en pacientes que usan dosis diarias de
Clopidogrel.
 VARIANTES DE LA
AGREGOMETRA
PLAQUETARIA
La agregometra tambin puede realizarse en sangre
entera anticoagulada. La agregometra en sangre entera
tiene como ventajas que ocupa menos muestra de sangre
(ya que no se requiere preparar un plasma rico en
plaquetas), que la muestra no se manipula (evitando la
activacin plaquetaria), y que pueden trabajarse muestras
ictricas o lipmicas.

La agregometra en sangre entera no trabaja con luz,

trabaja con impedancia (oposicin al paso de la corriente
alterna entre los dos electrodos). Las plaque- tas de la
muestra recubren dos electrodos de platino y despus de
que se agrega el agonista, las plaquetas activadas se unen
a las plaquetas que ya estaban uni- das a los electrodos.
Esto aumenta la impedancia y es registrado grficamente.
 LUMIAGREGMETRO

Es un complemento de la Agregometra por transmisin

de luz es la Lumiagregometra (tambin conocida como
prueba de liberacin de ATP). El objetivo de la
lumiagregometra es evaluar la liberacin de ATP desde los
grnulos densos al mismo tiempo que se registra la
agregacin plaquetaria en respuesta a un agonista. El ATP
es detectado con un reactivo conocido como
Luciferinluciferasa que produce luz y color al contacto con
ATP. La luciferina y la luciferasa existen en la naturaleza y
participan en las reacciones de bioluminiscencia, es decir,
la produccin de luz por organismos vivos, como las
lucirnagas, medusas, bacterias, etc. La luciferina es
oxidada a oxiluciferina en presencia de oxigeno y con la
luciferasa catalizando la reaccin. El ATP es la fuente de
energa para esta reaccin, la cual genera luz, as, a mas
ATP ms luz generada.
 Se registra la AGREGACIN PLAQUETARIA con algn agonista y
mediante la adicin de luciferin-luciferasa se grafica la luz producida
por el ATP liberado de los grnulos densos. La cantidad de ATP
liberado se mide de acuerdo a la luminosidad generada. Esta tcnica
fundamentalmente sirve para el diagnostico de la enfermedad del
pool de depsito (deficiencia de los grnulos densos) donde hay
dficit de la liberacin de ATP.
La Agregometra plaquetaria por transmisin de luz (ATL) es el
estndar de oro para el estudio de la funcin plaquetaria a
pesar del surgimiento de nuevas tecnologas como el Platelet
Function Analyzer (PFA-100), el sistema Verify-Now y la
Citometra de flujo, entre otros. Su principal uso es el estudio de
los pacientes que sangran por trombocitopata, sin embargo,
recientemente se le ha usado para estudiar a pacientes con
trombosis y para vigilar el efecto de los frmacos
antiplaquetarios.

En este artculo revisaremos los principios de la fisiologa

plaquetaria que son indispensables para comprender los
fundamentos, la tcnica y la interpretacin de la
Agregometra.
 CONCLUSIN
La agregometra plaquetaria constituye una
herramienta til para establecer
diagnsticos de alteraciones plaquetarias,
as como para el monitoreo de la terapia
antiagregante plaquetaria, sin embargo, a
pesar de valor como prueba diagnstica
deben de efectuarse controles de calidad
a efecto de garantizar un resulta- do
confiable.