UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE TECNOLOGA MDICA

DISTRIBUCIN DE RECEPTORES DE INOSITOL 1,4,5-TRIFOSFATO EN MSCULO ESQUELTICO HUMANO NORMAL Y DISTRFICO

TESIS PROFESIONAL PARA OPTAR AL TTULO DE TECNLOGO MDICO CON MENCIN EN MORFOFISIOPATOLOGA Y CITODIAGNSTICO

AUTOR: Reinaldo Figueroa Contreras

TUTOR: Prof. Dr. Enrique Jaimovich P.

2008

NDICE GENERAL Pg. RESUMEN .............................................................................................................................. 4 INTRODUCCIN ................................................................................................................... 5 MARCO TERICO ................................................................................................................ 6 La distrofia muscular de Duchenne ............................................................................. 6 El Ca2+ y los IP3Rs en la clula muscular esqueltica ................................................. 7 Los tipos de fibras musculares esquelticas y los IP3Rs .............................................. 9 Rol del Ca2+ en la patogenia de la DMD ..................................................................... 9 HIPTESIS ............................................................................................................................. 12 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................... 12 OBJETIVOS ESPECFICOS .................................................................................................. 12 MATERIALES Y MTODOS ................................................................................................ 13 Muestras de tejidos ...................................................................................................... 13 Reactivos ...................................................................................................................... 14 Inmunofluorescencia .................................................................................................... 16 Examen microscpico y adquisicin de imgenes ...................................................... 17 Anlisis de cuantificacin de fluorescencia ................................................................. 17 RESULTADOS ....................................................................................................................... 19 Distribucin y localizacin intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP 3Rs en msculo esqueltico humano normal ........................................................................... 19 Distribucin y localizacin intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP 3Rs en msculo esqueltico humano distrfico ....................................................................... 23 DISCUSIN ............................................................................................................................ 33 Los IP3Rs presentan una distribucin diferencial en el msculo esqueltico humano normal ............................................................................................................ 33 La distribucin diferencial de los IP3Rs se pierde en el msculo esqueltico distrfico ...................................................................................................................... 38 REFERENCIAS ...................................................................................................................... 42

NDICE DE FIGURAS Pg. Fig. 1. Distribucin del IP3R tipo 1 en msculo esqueltico normal....................................... 25 Fig. 2. Distribucin del IP3R tipo 1 en msculo esqueltico normal....................................... 26 Fig. 3. Cuantificacin de intensidad de la fluorescencia citoplasmtica del IP 3R tipo 1 ........ 27 Fig. 4. Distribucin de los IP3Rs tipos 1 y 2 en msculo esqueltico normal ......................... 28 Fig. 5. Localizacin intracelular de los IP3Rs tipos 1 y 3 en msculo esqueltico normal ..... 29 Fig. 6. Distribucin de los IP3Rs tipos 1 y 2 en msculo esqueltico peditrico normal ........ 30 Fig. 7. Localizacin intracelular de los IP3Rs en cortes longitudinales de msculo esqueltico normal ....................................................................................................... 31 Fig. 8. Distribucin de los IP3Rs en msculo esqueltico de pacientes con distrofia muscular de Duchenne ................................................................................................. 32

RESUMEN Los mecanismos que producen el dao tisular en la distrofia muscular de Duchenne (DMD) permanecen poco claros. Se postula que aumentos del Ca 2+ intracelular tienen un rol central en la degeneracin muscular. Los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs) participan en la generacin de seales intracelulares de Ca 2+ que modulan la expresin gnica en clulas musculares esquelticas. Las seales de Ca 2+ y la expresin gnica asociadas a los IP3Rs podran estar alteradas en el msculo distrfico. No existen reportes sobre la expresin de IP3Rs en msculo esqueltico humano adulto normal ni distrfico. Se propuso que los IP 3Rs presentaran un patrn organizado de distribucin en el msculo normal y que esta distribucin podra alterarse en el msculo distrfico. Mediante inmunofluorescencia se describi la distribucin y localizacin intracelular de los IP 3Rs en msculo esqueltico humano normal y de pacientes con DMD. Los IP3Rs se expresan en msculo normal, presentando una distribucin diferencial (de mosaico) preferentemente en fibras tipo II. Los tres tipos de IP3Rs se localizan en el citoplasma, probablemente en retculo sarcoplasmtico. Los IP3Rs tipos 1 y 3 presentan una localizacin compatible con los ncleos. El msculo distrfico no presenta la distribucin diferencial de IP 3Rs, los que se expresan en todas las fibras, independiente de su tipo. La distribucin diferencial de los IP 3Rs en el msculo normal sugerira que seales de Ca2+ originadas en los IP3Rs regularan programas gnicos asociados al tipo de fibra. La prdida de este patrn en msculo distrfico sugerira una alteracin en la expresin gnica modulada por Ca2+.

INTRODUCCIN La DMD es una enfermedad letal causada por mutaciones en el gen de la distrofina. Aunque es conocido que la alteracin en la regulacin del Ca 2+ juega un rol central en la patogenia de la enfermedad, es poco lo que se sabe acerca de la liberacin de Ca 2+ intracelular en este fenmeno. La relacin entre la ausencia de distrofina y la alteracin en la regulacin intracelular del Ca2+ es desconocida. Los IP3Rs son una familia de canales permeables al Ca 2+ localizados en el retculo sarcoplasmtico y los ncleos de las clulas musculares esquelticas, que median una seal de Ca2+ de propagacin lenta, gatillada por la despolarizacin celular, involucrada en la regulacin gnica. El hecho que los niveles de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y de IP3Rs se encuentren aumentados en lneas celulares derivadas de msculo distrfico humano y de ratones mdx, uno de los modelos animales de DMD, llama la atencin sobre la posible relacin entre la deficiencia de distrofina y los IP 3Rs (Liberona y cols,. 1998). Por otro lado, no existen reportes previos que describan la expresin de IP 3Rs en msculo esqueltico humano adulto normal ni distrfico. Hasta la fecha, son escasos los datos sobre la relacin posible entre las seales de Ca2+ mediadas por los IP3Rs y los procesos regulados por ellas, con la ausencia de distrofina y el fenotipo distrfico. Por lo tanto, se identifica dos problemas de estudio. Primero, la escasa informacin que explique la posible participacin de los IP 3Rs en la alteracin de la homeostasis del Ca2+ en las fibras musculares distrficas. Segundo, la ausencia de estudios previos que describan la expresin de los IP3Rs en el msculo esqueltico humano, tanto normal como distrfico. En nuestro estudio se abord el segundo problema mediante una aproximacin inmunohistoqumica, intentando proponer posibles significados funcionales a nuestros hallazgos morfolgicos.

MARCO TERICO La distrofia muscular de Duchenne La DMD (OMIM 310200) es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X con una incidencia global aproximada de 1 en 3.500 varones nacidos vivos (Emery, 1991), que produce una progresiva degeneracin muscular y la muerte prematura por insuficiencia respiratoria o cardaca hacia la tercera dcada de la vida (Emery, 2002). Est establecido que es causada por la ausencia de distrofina, producida por deleciones o mutaciones puntuales en el locus Xp21 (Blake y cols., 2002). La distrofina es una protena del citoesquleto, con un peso molecular relativo de 427 kDa, normalmente localizada en la cara interna de la membrana plasmtica (Ahn y Kunkel, 1993). En el msculo esqueltico normal, la distrofina est asociada a un complejo glicoproteico denominado complejo distrofina-glicoprotena (DGC, dystrophin-glycoprotein complex), que incluye distroglicanos, sarcoglicanos, sintrofinas, distrobrevina y sarcospano. Este complejo provee un anclaje entre la matriz extracelular y el citoesqueleto, tendiendo a estabilizar mecnicamente la membrana plasmtica (Blake y cols., 2002; Bevilacqua, 2003). La ausencia de distrofina en el msculo distrfico produce la desorganizacin del DGC y altera la estabilidad de la membrana plasmtica, causando fragilidad mecnica y aumento de la permeabilidad al Ca 2+ (Batchelor y Winder, 2006). Los mecanismos ntimos que subyacen a la generacin de la enfermedad an permanecen oscuros, las hiptesis patognicas actuales atribuyen un rol compartido a la disrupcin mecnica de la membrana celular y a los efectos deletreos de las elevadas concentraciones del Ca 2+ intracelular (Berchtold y cols., 2000; Gailly, 2002).

El Ca2+ y los IP3Rs en la clula muscular esqueltica El Ca2+ es un segundo mensajero verstil que juega un rol fundamental en la regulacin de variadas funciones en las clulas musculares esquelticas, tales como el acoplamiento excitacin-contraccin, el transporte a travs de membranas y la plasticidad celular (Berchtold y cols., 2000; Berridge y cols., 2003). Dos tipos de receptores, ambos canales de Ca 2+ los receptores de rianodina (RyR) y los IP3Rs, median los aumentos del Ca 2+ intracelular gatillados por la despolarizacin de la membrana plasmtica (Jaimovich y Rojas, 1994; Jaimovich y cols., 2000). En la fibra muscular esqueltica, la despolarizacin de la membrana celular, inducida por una elevada concentracin de K+ extracelular o por estimulacin elctrica, genera una elevacin del Ca 2+ intracelular que puede ser separada en dos componentes. Un componente rpido (seal rpida de Ca 2+), correspondiente al acoplamiento excitacin-contraccin, generado por la interaccin de los receptores de dihidropiridinas (DHPR), localizados en la membrana celular, que actan como sensores de voltaje, y los RyR localizados en la membrana del retculo sarcoplasmtico, a travs de los cuales se produce la salida de Ca2+ hacia el citosol (Berchtold y cols., 2000; Gailly, 2002). Segundos despus se genera la seal lenta de Ca2+, no relacionada con el acoplamiento excitacin-contraccin y dependiente del aumento intracelular de IP3 (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001; Eltit y cols., 2004). Esta seal lenta es producida por la activacin de una protena G an no identificada acoplada al DHPR y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), que activa la fosfolipasa C y la produccin de IP3 y diacilglicerol (DAG). El IP3 estimula los canales IP3Rs localizados en el retculo sarcoplasmtico y la envoltura nuclear, gatillando la liberacin de Ca2+ desde estos reservorios (Araya y cols., 2003; Eltit y cols., 2006).

Los IP3Rs corresponden a una familia de canales permeables al Ca 2+ compuesta de tres isoformas (IP3Rs tipos 1, 2 y 3) que difieren en su secuencia aminoacdica, afinidad por el IP3 y modulacin por Ca2+ (Patterson y cols., 2004). Los tres tipos de IP3Rs se expresan en clulas musculares esquelticas en cultivo primario y su localizacin intracelular est claramente establecida. Los tres tipos de IP3Rs estn distribuidos en el sarcoplasma, los tipos 1 y 2 asociados al retculo sarcoplasmtico, y el tipo 3 distribuido difusamente en el citosol; adems, los tipos 1 y 3 se localizan en los ncleos celulares, el tipo 1 asociado a la envoltura nuclear y el tipo 3 localizado en el nucleoplasma (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001; Crdenas y cols., 2005). La distribucin normal de los IP3Rs ha sido previamente estudiada en msculo esqueltico adulto de rata (Moschella y cols., 1995) y ratn (Salanova y cols., 2002; Powell y cols., 2003). En msculo esqueltico de rata se describi la expresin diferencial de los IP3Rs en fibras de tipo oxidativo (Moschella y cols., 1995). En msculo esqueltico de ratn se localiz al IP3R tipo 1 en retculo sarcoplasmtico, clulas satlites y componentes de la unin neuromuscular (Salanova y cols., 2002; Powell y cols., 2003). Se han identificado sitios especficos de unin de IP3 en lneas celulares de msculo esqueltico humano normal y distrfico (Liberona y cols., 1998). Pero hasta el momento no ha sido publicado ningn reporte sobre la distribucin de los IP3Rs en msculo esqueltico humano adulto. La seal lenta de Ca2+ es dependiente de IP3 y mediada por los IP3Rs, se propaga a travs de los ncleos celulares (Jaimovich y cols., 2000; Crdenas y cols., 2005) y est relacionada con la regulacin de la expresin de genes tempranos (c-fos, c-jun, egr-1; Araya y cols., 2003; Carrasco y cols., 2003) y tardos (IL-6, troponina I; Jureti y cols., 2006 y 2007). La seal lenta de Ca2+ tambin ha sido identificada en las clulas satlites, que constituyen la poblacin de reserva proliferativa del tejido muscular (Powell y cols., 2003). Esta evidencia sugiere que

las seales de Ca2+ dependientes de IP3 podran jugar un rol en la diferenciacin y regeneracin de las clulas musculares. Los tipos de fibras musculares esquelticas y los IP 3Rs El msculo esqueltico humano est compuesto por un conjunto heterogneo de fibras musculares. Los distintos tipos de fibras pueden ser descritos utilizando caractersticas fisiolgicas, morfolgicas, histoqumicas o bioqumicas. Un mtodo de tipificacin de fibras utilizado es la identificacin inmunohistoqumica de las isoformas lentas y rpidas de las cadenas pesadas de la miosina (MHCs, myosin heavy chains). La miosina es un filamento grueso constituyente del sarcmero. Corresponde a un heterohexmero conformado por dos cadenas pesadas, dos cadenas livianas esenciales o alcalinas, y dos cadenas livianas regulatorias o fosforilables (Schiaffino y Reggiani, 1996). En el msculo esqueltico humano se expresan tres isoformas de MHCs: I (isoforma lenta), IIA y IIX (isoformas rpidas). La identificacin de estas isoformas permite caracterizar, al menos, dos tipos de fibras musculares: tipo I (fibras lentas) y tipo II (fibras rpidas) (Scott y cols., 2001). Como se mencion, existe un reporte que describe una distribucin diferencial de los IP3Rs en los distintos tipos de fibras musculares esquelticas (Moschella y cols., 1995). Rol del Ca2+ en la patogenia de la DMD Observaciones tempranas, incluso previas al descubrimiento de la ausencia de distrofina, indicaron aumentos del Ca2+ intracelular en fibras musculares distrficas (Bodensteiner y Engel, 1978; Bertorini y cols., 1982). Posteriormente, estudios en distintas preparaciones de clulas musculares deficientes en distrofina han confirmado el hallazgo de la acumulacin intracelular de Ca2+ bajo variadas condiciones. En estos estudios ha quedado establecido que

clulas musculares carentes de distrofina presentan un elevado flujo de entrada de Ca 2+ y altas concentraciones de Ca2+ intracelular, lo que genera efectos dainos sobre los miocitos (Turner y cols., 1988; Turner y cols., 1991). Una alteracin en la va de los IP 3Rs en miotubos derivados de ratones mdx, ha sido implicada en un incremento anormal del calcio subsarcolemal inducido por un estmulo nicotnico (Basset y cols., 2004). Sin embargo, hasta la fecha son variados los mecanismos propuestos que regularan la homeostasis anormal del Ca2+, as como los canales o receptores que operaran el flujo aumentado de Ca 2+ (Gailly, 2002; Ruegg y cols., 2002; Constantin y cols., 2006). Aparentemente, las protenas involucradas en el acoplamiento excitacin-contraccin (subunidades 1, 2 y del DHPR, RyR tipo 1), as como la isoforma rpida de la Ca 2+ATPasa del retculo sarco(endo)plasmtico (SERCA1), estn expresadas normalmente en el msculo esqueltico deficiente en distrofina (Culligan y cols., 2002). Por otro lado, la cantidad de IP3Rs as como la masa total de IP3 estn aumentadas en una lnea celular derivada de msculo esqueltico distrfico de ratones mdx, comparada con lneas celulares derivadas de msculo esqueltico murino normal (Liberona y cols., 1998). Adems, la cantidad basal de IP 3 est aumentada y el incremento en la masa de IP 3 inducido por despolarizacin es de mayor duracin en una lnea celular distrfica humana, comparada con clulas normales (Liberona y cols., 1998). En estos modelos las vas de sealizacin relacionadas con IP 3 parecen ser responsables del aumento del Ca2+, pero no hay informacin de cmo estas vas interaccionan con la distrofina y el DGC. Los procesos de diferenciacin y regeneracin celular, probablemente relacionados a las seales de Ca 2+ dependientes de IP3 en mioclulas, estn alterados en las distrofias musculares. Asimismo, los perfiles de expresin gnica se encuentran modificados en distrofias (Chen y cols., 2000, Haslett y cols., 2003), permaneciendo an poco claros los mecanismos subyacentes a estas alteraciones. 10

Basados en esta evidencia y con el propsito de agregar informacin que permita relacionar las alteraciones en la homeostasis intracelular del Ca2+ dependiente de los IP3Rs y la ausencia de distrofina en msculo esqueltico, estudiamos la distribucin y localizacin intracelular de los tres tipos de IP3Rs en msculo esqueltico humano adulto normal y distrfico.

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HIPTESIS Los IP3Rs presentan una distribucin diferencial segn el tipo de fibra en el msculo esqueltico normal. Este patrn de distribucin est alterado en el msculo esqueltico distrfico.

OBJETIVO GENERAL Describir los patrones de distribucin de los IP3Rs en msculo esqueltico humano normal y distrfico.

OBJETIVOS ESPECFICOS 1. Determinar mediante inmunofluorescencia la presencia, distribucin y localizacin intracelular de los tres tipos de IP3Rs en cortes de msculo esqueltico humano normal. 2. Determinar mediante inmunofluorescencia la presencia, distribucin y localizacin intracelular de los tres tipos de IP3Rs en cortes de msculo esqueltico distrfico. 3. Comparar la distribucin y localizacin de los IP 3Rs entre el msculo esqueltico humano normal y distrfico.

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MATERIALES Y MTODOS Se realiz una descripcin cualitativa de la distribucin de los tres tipos de IP 3Rs, mediante inmunofluorescencia, en cortes histolgicos de msculo esqueltico humano normal y distrfico. Se evalu su patrn de distribucin en relacin a los tipos de fibras musculares, caracterizados por la identificacin inmunohistoqumica de las MHCs I (fibras tipo I, lentas) y II (fibras tipo II, rpidas), adems de su localizacin intracelular. Se caracteriz el patrn de distribucin en el msculo esqueltico normal y se compar con el msculo distrfico. Muestras de tejidos Se obtuvo muestras de tejido muscular esqueltico normal (msculos cudriceps femoral y sartorio), de tres pacientes adultos voluntarios sometidos a ciruga ortopdica, no relacionada con miopatas, en el Hospital Clnico Universidad de Chile. El consentimiento informado de los pacientes fue obtenido mediante un cuestionario previamente aprobado por el Comit de tica del Hospital. Las muestras fueron recibidas en pabelln sobre gasa humedecida con suero fisiolgico, mantenida en fro en placa Petri sobre hielo, y transportadas rpidamente (en menos de 30 min.) al Laboratorio de Fisiologa Celular de Msculo, Centro de Estudios Moleculares de la Clula, Facultad de Medicina. Se las someti a congelacin rpida (30 seg.) en isopentano enfriado en nitrgeno lquido, de acuerdo a como ha sido descrito previamente (Dubowitz, 1985; Loughlin, 1993), y fueron almacenadas a -70C hasta su uso. Biopsias de msculo cudriceps de tres pacientes peditricos, de entre 6 y 7 aos, con el diagnstico clnico de DMD y tres controles normales de la misma edad fueron enviadas desde el Instituto de Investigaciones Neurolgicas, Fundacin para la Lucha contra las Enfermedades Neurolgicas de la Infancia (FLENI), Buenos Aires, Argentina. Cortes de

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biopsias de msculo cudriceps de tres nios entre 6 y 7 aos con el diagnstico de DMD y tres controles pareados por edad, se obtuvieron desde el Departamento de Anatoma Patolgica, Pontificia Universidad Catlica de Chile, Santiago, Chile. El diagnstico histopatolgico de DMD fue realizado por un patlogo experimentado de cada institucin; la ausencia completa de distrofina fue demostrada por inmunohistoqumica. Las muestras peditricas normales y distrficas, de Argentina y Chile, se obtuvieron de archivos de tejidos congelados, se realizaron cortes en criostato en su lugar de origen y fueron enviadas en conjuntos de 6 cortes transversales seriados de 10 m de espesor por caso, adheridos a portaobjetos, y se las almacen a -70C hasta su uso. Slo se complet el procesamiento y anlisis de resultados de las muestras procedentes de Argentina (controles, n = 3; casos DMD, n = 3); no se complet el anlisis de las muestras obtenidas en Chile. Es de inters completar el estudio de estas muestras en una prxima etapa de la investigacin, para ampliar el nmero de controles y casos, y evaluar una posible influencia de variables preanalticas (obtencin, conservacin y transporte de las muestras) en los resultados. Reactivos Los anticuerpos primarios utilizados en el estudio inmunohistoqumico fueron los siguientes: anticuerpo policlonal producido en conejos dirigido contra un pptido correspondiente a los residuos 1829-1848 del IP3R tipo 1 humano (1:100, PA1-901; Affinity Bioreagents, Golden, CO, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos, purificado por afinidad, dirigido contra los 19 residuos del extremo carboxilo-terminal del IP3R tipo 1 de ratn (1:500, PCD6; Research Genetics, Huntsville, AL, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos dirigido contra un pptido del IP3R tipo 1 (1:100, CC1; Department of Physiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en cabras

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dirigido contra un pptido del extremo carboxilo-terminal del IP3R tipo 2 humano (1:25, C-20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos dirigido contra un pptido del extremo amino-terminal del IP3R tipo 2 (1:25, CC2N; Department of Physiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos dirigido contra un pptido correspondiente a los aminocidos del extremo carboxilo-terminal (CRRQRLGFVDVQNCMSR) del IP3R tipo 3 de rata, proporcionado por el Dr. G. A. Mignery (1:50, T3NH; Loyola University Chicago, Maywood, IL, EE.UU.); anticuerpos monoclonales dirigidos contra las MHCs I y II (1:100; Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). En resumen, se dispuso de tres anticuerpos diferentes para el IP3R tipo 1 (PA1-901, PCD6 y CC1), dos para el IP3R tipo 2 (C-20 y CC2N), y uno para el IP3R tipo 3 (T3NH). Los anticuerpos PA1-901, C-20 y T3NH fueron ampliamente probados en experimentos de inmunofluorescencia, en miotubos en cultivo primario (Powell y cols., 2001; Crdenas y cols., 2005) y msculo adulto de ratn (Powell y cols., 2003). Anticuerpos conjugados con Alexa 488 dirigidos contra inmunoglobulinas G de conejo y cabra, y anticuerpo conjugado con Alexa 633 dirigido contra inmunoglobulina G de ratn (1:500; Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.), fueron utilizados como anticuerpos secundarios. Medio de montaje hidrfilo, no adhesivo, preservador de fluorescencia (Vectashield), se obtuvo de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE.UU.). Otros reactivos utilizados fueron de calidad proanlisis.

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Inmunofluorescencia El procedimiento inmunohistoqumico se realiz como ha sido descrito previamente (Barbier y cols., 2004), con algunas modificaciones. Cortes transversales seriados y longitudinales de msculo adulto normal, de 10 m de grosor, fueron obtenidos en criostato, adheridos a portaobjetos limpios y almacenados a -70C hasta su uso. Para el anlisis de inmunofluorescencia, los cortes fueron fijados en paraformaldehdo al 4% p/v disuelto en tampn fosfato salino (phosphate-buffered saline, PBS: Na2HPO4 0,1 M, Na2H2PO4H2O 0,1 M, NaCl 0,88% p/v, pH 7,3), por 20 min. a temperatura ambiente. Luego fueron permeabilizados en solucin de Triton X-100 al 0,05% v/v en PBS, por 15 min. a temperatura ambiente. El bloqueo de uniones inespecficas se realiz incubando los cortes en albmina srica bovina (bovine serum albumin, BSA), disuelta al 1% p/v en PBS (solucin bloqueadora), durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cortes fueron incubados toda la noche a 4C con los anticuerpos primarios diluidos en solucin bloqueadora. Para experimentos de doble marcaje, los dos anticuerpos primarios fueron mezclados juntos y utilizados como se describi ms arriba. Luego de tres lavados con PBS de 5 min. cada uno, se realiz la incubacin con los anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos en solucin bloqueadora, por 1 hora a temperatura ambiente. Se lav los cortes con PBS, tres veces por 5 min., fueron montados en Vectashield y sellados para su examen microscpico. Se llev controles negativos paralelos incubando cortes con los anticuerpos secundarios en ausencia de los anticuerpos primarios, en su lugar se us solucin bloqueadora.

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Examen microscpico y adquisicin de imgenes El examen microscpico y la adquisicin de imgenes se realiz en un microscopio lser confocal Carl Zeiss LSM 5 3.2, Axiovert 200 (Carl Zeiss, Jena, Alemania), usando el software de captura y anlisis de imgenes Pascal 5. Se utiliz el lser argn de 488 nm y el lser helionen de 633 nm para excitar los fluorforos Alexa 488 y Alexa 633 respectivamente. Imgenes de experimentos de doble marcaje fueron adquiridas en el modo multicanal. En el canal 1 se registr la fluorescencia de Alexa 488, con longitudes de excitacin/emisin (exc/em) = 488/505-530 nm, y en el canal 2 se registr el Alexa 633, exc/em = 635/>650 nm. Imgenes de experimentos en que se aplic slo un anticuerpo por corte fueron capturadas en el modo de canal nico. Se asegur que la intensidad de la fluorescencia (I) adquirida no estuviera saturada y que el fondo de la imagen fuera ligeramente superior a cero. Para eso se ajust la potencia del lser, la ganancia del detector y el offset (punto de calibracin de I). Con el objetivo de comparar las imgenes obtenidas se mantuvieron constantes las siguientes variables: potencia del lser, ganancia del detector, grosor ptico y ajuste de brillo/contraste. Anlisis de cuantificacin de fluorescencia Cortes transversales seriados de msculo cudriceps normal, fueron inmunomarcados con anticuerpo dirigido contra el IP3R tipo 1 (PCD6), se utiliz un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488. Series de imgenes confocales fueron adquiridas en el microscopio descrito, utilizando un objetivo Plan-Neofluar 40x/1.3 Oil DIC. Las series de imgenes fueron capturadas en el modo de canal nico (Alexa 488), exc/em = 488/505-530 nm. Se obtuvo series de 10 cortes de 0,3 m de grosor, para deconvolucionar las imgenes. Las imgenes fueron deconvolucionadas con el programa Huygens Scripting (Scientific Volume Imaging,

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Hilversum, Holanda). El procesamiento de imgenes se realiz sobre la base del Interactive Data Language, IDL (ITT, CO, EE.UU.), perteneciente al Laboratorio de Anlisis de Imgenes Cientficas, ICBM (www.scian.cl). Se delimitaron los bordes de las fibras musculares mediante segmentacin manual, utilizando como molde la imagen de luz trasmitida, excluyendo los espacios intercelulares y ncleos. Se midi la intensidad de fluorescencia del citoplasma de las fibras y el valor se dividi por la superficie respectiva (I/m2), para normalizar la fluorescencia por rea. Se compar la diferencia de intensidad de fluorescencia citoplasmtica entre fibras tipos I y II (identificadas con anticuerpos para MHC I y II). Los resultados, expresados como promedio error estndar (E.E.), fueron analizados utilizando la prueba t de Student para datos pareados, considerando un valor de p < 0,01 como estadsticamente significativo.

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RESULTADOS Como se indic en Materiales y Mtodos, se cont con tres anticuerpos diferentes para el IP3R tipo 1 (PA1-901, PCD6 y CC1), dos para el IP3R tipo 2 (C-20 y CC2N), y uno para el IP3R tipo 3 (T3NH). Se utiliz distintos anticuerpos, porque los anticuerpos disponibles para los IP3Rs, especialmente los comerciales, son de difcil manejo, pudiendo en no pocas ocasiones ser dificultosa la obtencin de las inmunotinciones. Esto es particularmente vlido para el anticuerpo C-20 (Santa Cruz Biotechnology), que gener las mayores dificultades para su estandarizacin. Idealmente, todas las muestras de que se dispuso podran haber sido probadas con todos los anticuerpos disponibles, aunque esto no se realiz, se prob cada tipo de IP 3R con alguno de los anticuerpos disponibles en todas las muestras, tanto adulto y nio control, como distrfico. Distribucin y localizacin intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en msculo esqueltico humano normal La presencia, distribucin y localizacin intracelular de las tres isoformas de los IP3Rs, fue investigada mediante inmunofluorescencia indirecta y examen con microscopia confocal en criocortes de msculo esqueltico humano normal, de nios y adultos, utilizando anticuerpos especficos dirigidos contra los tipos 1, 2 y 3 de los IP3Rs. Cortes transversales seriados de msculo cudriceps obtenido de un sujeto adulto control, fueron inmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra el IP 3R tipo 1 (PCD6), y las MHCs I y II. La Figura 1 muestra que el IP3R tipo 1 est presente en msculo esqueltico humano normal, en un patrn de distribucin diferencial del tipo mosaico o tablero de ajedrez, con un predominio de la marca en las fibras musculares de tipo II. Se observa una marca intensa en

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todas las fibras de tipo II, positivas para MHC II, y una marca dbil en las fibras de tipo I, positivas para MHC I. El IP3R tipo 1 presenta una localizacin citoplasmtica en fibras tipo II, organizado en un patrn moteado o punteado. Adems, el IP3R tipo 1 se localiza en estructuras situadas en la periferia de las fibras musculares, tanto las de tipo I como las de tipo II, que podran corresponder a ncleos celulares. En adelante, se identificar los tipos de fibras musculares con uno u otro anticuerpo para las MHCs. En el msculo normal estos anticuerpos discriminan completamente ambos tipos de fibras, en los tejidos normales estudiados no se identificaron fibras que fueran positivas para ambos anticuerpos simultneamente. La Figura 2 muestra una serie de cortes transversales de msculo sartorio de un adulto control, teidos con los mismos anticuerpos de la figura 1 contra el IP3R tipo 1 (PCD6) y MHC II, con el objetivo de evaluar el patrn descrito en un msculo alternativo. Se observa un patrn similar de distribucin y localizacin intracelular del IP3R tipo 1, al observado en cortes de cudriceps. Igualmente, todas las fibras tipo II expresan intensamente el IP 3R tipo 1 en su citoplasma. Para objetivar la expresin diferencial del IP3R tipo 1 entre fibras tipo I y II, se realiz un anlisis de cuantificacin de intensidad de la fluorescencia citoplasmtica en cortes transversales de msculo cudriceps normal, inmunomarcados para el IP 3R tipo 1 (PCD6). En la Figura 3 se grafican los resultados de este anlisis. Se cuantific un total de 102 fibras musculares, 47 fibras tipo I y 55 fibras tipo II, segn se detall en Materiales y Mtodos. La intensidad de fluorescencia, expresada en unidades arbitrarias por rea (I/m2), fue en promedio de 1,32 en fibras tipo I (E.E. = 0,034) y de 4,8 en fibras tipo II (E.E. = 0,142). La intensidad de la fluorescencia citoplasmtica del IP3R tipo 1 fue 2,63 veces mayor en las fibras

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de tipo II que en las de tipo I, correspondiente a una diferencia de 72,5%, que fue estadsticamente significativa. En la Figura 4 se presenta una serie de cortes transversales de msculo cudriceps de un control adulto, en que se realiz doble marcaje con anticuerpos dirigidos contra el IP 3R tipo 1 (CC1, distinto al de las figuras 1 y 2), o el IP3R tipo 2 (CC2N), y un anticuerpo contra la MHC I. El patrn de distribucin del IP3R tipo 1 es similar al descrito con el anticuerpo PCD6 (mosaico en fibras tipo II, localizacin citoplasmtica en patrn moteado, adems de localizacin en la periferia de las fibras). El IP3R tipo 2 se expresa en msculo cudriceps, tambin en un patrn de distribucin diferencial predominante en las fibras tipo II, pero aparentemente presenta una mayor marca relativa en las fibras tipo I, comparado con el IP 3R tipo 1. Su localizacin intracelular es citoplasmtica, dispuesto en un patrn moteado similar al IP3R tipo 1. Pero a diferencia de ste, el IP3R tipo 2 no presenta una clara localizacin en la periferia de las fibras. La Figura 5 muestra un anlisis de co-tincin de los IP3Rs tipos 1 y 3, con los anticuerpos PA1-901 y T3NH, y la MHC I, en criocortes de msculo sartorio de un control adulto. Se observa el mismo patrn de distribucin ya descrito para el IP 3R tipo 1. El IP3R tipo 3 tambin est presente en msculo sartorio, principalmente en las fibras tipo II. Present una localizacin citoplasmtica, organizado en un patrn ms homogneo que los otros tipos de IP3Rs. Similar al IP3R tipo 1, present localizacin perifrica, posiblemente nuclear, en ambos tipos de fibras. Se evalu la distribucin de los IP3Rs tipos 1, 2 y 3 en msculo esqueltico de tres nios normales, controles de las muestras de msculo distrfico. En la Figura 6 se muestra una imagen representativa de los tres controles estudiados. En los paneles A-C se observan cortes seriados de msculo cudriceps de un nio control de 7 aos, en los que se realiz co21

inmunotincin con los anticuerpos dirigidos contra los IP3Rs tipo 1 (PA1-901) y tipo 2 (C-20), y anticuerpo contra la MHC II. En los paneles D y E se observa un rea distinta de la misma serie, marcada con anticuerpos para el IP3R tipo 3 (T3NH) y la MHC II. La Figura muestra que los tres tipos de IP3Rs estn presentes en msculo esqueltico de nios control. La marca de los IP3Rs se presenta en todas las fibras musculares, siendo ms intensa en las fibras de tipo II, positivas para MHC II. Los tres tipos de IP3Rs se distribuyen en un patrn diferencial del tipo mosaico o tablero de ajedrez, con un predominio de la marca en las fibras musculares de tipo II. Los tres tipos de IP3Rs presentan una localizacin citoplasmtica en fibras tipo II, en un patrn moteado o punteado. En la periferia de las fibras, para los IP3Rs tipos 1 y 3, se identifica marca en estructuras que podran corresponder a los ncleos celulares. En cortes de msculo de nios control teidos con anticuerpos para los IP3Rs y la MHC I, se observ marca para los tres tipos de receptores, de mayor intensidad en las fibras tipo II, que no se tieron con el anticuerpo para las MHC I (datos no mostrados). En resumen, la inmunofluorescencia de los IP3Rs en cortes transversales mostr las tres isoformas en msculo esqueltico humano normal, de adultos y nios, presentndose en un patrn de distribucin de mosaico, con un predominio de la marca en las fibras musculares de tipo II, las que fueron identificadas por presentar tincin positiva con anticuerpos dirigidos contra la MHC II y ausencia de coloracin con anticuerpos dirigidos contra la MHC I. Los tres tipos de IP3Rs presentaron una localizacin intracelular en el citoplasma de las fibras musculares, mostrando una potente marca en las fibras de tipo II y una marca dbil, pero no ausente, en las fibras de tipo I. La marca citoplasmtica para los IP 3Rs tipos 1 y 2 se distribuy en un patrn granular. El IP3R tipo 3 present un patrn de localizacin citoplasmtica ms homogneo que las otras dos isoformas. Los IP3Rs tipos 1 y 3 tambin se localizaron sobre estructuras ubicadas en la periferia de las fibras musculares, que pudieran corresponder a 22

ncleos celulares. Esta marca perifrica se distribuye en ambos tipos de fibras musculares. El IP3R tipo 2 no mostr una localizacin perifrica evidente. La localizacin intracelular de los IP3Rs tambin fue evaluada mediante inmunomarcaje de cortes longitudinales de msculo sartorio de un adulto control, con los anticuerpos PA1-901, C-20 y T3NH. En la Figura 7 se observa que los tres tipos de IP3Rs desplegaron un patrn estriado de localizacin intracelular, altamente sugerente del aspecto del retculo sarcoplasmtico. Los IP3Rs tipos 1 y 3 presentaron una localizacin perifrica, compatible con la localizacin de los ncleos celulares. Esta localizacin perifrica no fue tan clara para el IP3R tipo 2. Distribucin y localizacin intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en msculo esqueltico humano distrfico Se estudi la presencia, distribucin y localizacin intracelular de las tres isoformas de los IP3Rs, mediante inmunofluorescencia indirecta y examen con microscopia confocal, en criocortes de msculo esqueltico de nios con distrofia muscular de Duchenne, utilizando los anticuerpos PA1-901, C-20 y T3NH, especficos contra los tipos 1, 2 y 3 de los IP 3Rs respectivamente, los mismos anticuerpos utilizados en los nios control. Se realiz ensayos de doble inmunomarcaje con anticuerpos dirigidos contra la MHC I. Se estudi tres casos distrficos con anticuerpos para los tres tipos de IP 3Rs y MHC I. En la Figura 8 se muestran imgenes representativas de cortes de msculo cudriceps de los tres casos. Cada tipo de IP3R se muestra en un corte de cada caso. Las alteraciones distrficas se evidencian por la desorganizacin arquitectural del tejido: gran variabilidad en el dimetro de las fibras, de bordes redondeados, y aumento del espacio interfibrilar, correspondiente a tejido conjuntivo endomisial aumentado. La coloracin para MHC I mostr una poblacin

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heterognea de fibras musculares, con reas en que no fue posible identificar los tipos de fibras. Las imgenes seleccionadas corresponden a regiones donde se logr identificar claramente dos poblaciones de fibras, tipo I y tipo II. En estas reas en que se preserv el patrn en mosaico de la MHC I, se observa que la distribucin de la marca de las tres isoformas de IP3Rs no muestra el patrn diferencial asociado al tipo de fibra identificado en el msculo esqueltico normal. En el msculo distrfico, la marca para los tres tipos de IP 3Rs se distribuy de manera similar en ambos tipos de fibras. Se mantiene la localizacin intracelular de los IP3Rs comparada con el msculo normal, las tres isoformas se localizan en el citoplasma, IP3Rs tipos 1 y 2 con un patrn moteado, IP3R tipo 3 con una distribucin ms homognea. Los IP3Rs tipos 1 y 3 tambin presentan una localizacin en la periferia de las fibras.

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Figura 1. Distribucin del IP3R tipo 1 en msculo esqueltico normal. Cortes seriados de msculo cudriceps de un sujeto adulto control, inmunoteidos con anticuerpos

dirigidos contra MHC II (A), IP3R tipo 1 (B) y MHC I (C). I: fibra tipo I (lenta), II: fibra tipo II (rpida). Asteriscos (*) indican la misma fibra muscular en cada corte. Puntas de flecha () indican sitios de localizacin perifrica, probablemente nuclear. Barra en B: 50 m.

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Figura 2. Distribucin del IP3R tipo 1 en msculo esqueltico normal. Cortes seriados de msculo sartorio de un sujeto adulto control, inmunoteidos con anticuerpos dirigidos contra el IP3R tipo 1 (A) y MHC II (B). I: fibra tipo I (lenta), II: fibra tipo II (rpida). Asteriscos (*) indican la misma fibra muscular en cada corte. Flechas () indican sitios de localizacin perifrica, probablemente nuclear. Barra en B: 100 m.

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Figura 3. Cuantificacin de intensidad de la fluorescencia citoplasmtica del IP 3R tipo 1. La intensidad de la fluorescencia citoplasmtica normalizada por rea (I/m 2) del IP3R tipo 1 es 2,63 veces mayor en las fibras tipo II que en las tipo I, correspondiente a una diferencia de 72,5%. Se cuantific un total de 102 fibras musculares, 47 fibras tipo I y 55 fibras tipo II. * p < 0,01. Valores corresponden a promedios E.E.

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Figura 4. Distribucin de los IP3Rs tipos 1 y 2 en msculo esqueltico normal. Cortes seriados de msculo cudriceps de un sujeto adulto control, comarcados con anticuerpos dirigidos contra IP3R tipo 1 (A), IP3R tipo 2 (B) y MHC I (C). I: fibra tipo I (lenta), II: fibra tipo II (rpida). Asteriscos (*) indican la misma fibra muscular en cada corte. Puntas de flecha () indican sitios de localizacin perifrica, probablemente nuclear. Barra en C: 50 m.

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Figura 5. Distribucin de los IP3Rs tipos 1 y 3 en msculo esqueltico normal. Criocortes de msculo sartorio de un adulto control comarcados con anticuerpos dirigidos contra MHC I (A y D), IP3R tipo 1 (B) o IP3R tipo 3 (E). C: superposicin de los paneles A y B. F: superposicin de los paneles D y E. Puntas de flecha () indican sitios de localizacin perifrica, probablemente nuclear. Barra en F: 50 m.

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Figura 6. Distribucin de los IP3Rs tipos 1 y 2 en msculo esqueltico peditrico normal. Cortes seriados de msculo cudriceps de un nio normal de 7 aos comarcados con anticuerpos dirigidos contra MHC II (A, D), IP3R tipo 1 (B), IP3R tipo 2 (C) e IP3R tipo 3 (E). Asteriscos () indican la misma fibra muscular en paneles A-C. En paneles D y E se delimit las fibras tipo II, que presentan una marca ms intensa para el IP 3R tipo 3. Barra en E: 50 m.

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Figura 7. Localizacin intracelular de los IP 3Rs en cortes longitudinales de msculo esqueltico normal. Cortes longitudinales de msculo sartorio de un adulto normal inmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra los IP3Rs tipos 1 (A), 2 (B) y 3 (C). Flechas () indican estructuras compatibles con ncleos celulares. Barra en C: 10 m.

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Figura 8. Distribucin de los IP3Rs en msculo esqueltico de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Criocortes de msculo cudriceps de tres nios con distrofia coinmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra MHC I (A, D y G), y los IP3Rs tipo 1 (B), tipo 2 (E) y tipo 3 (H). C, F e I: superposicin de paneles de la izquierda. Asteriscos ( ) indican fibras musculares positivas para MHC I, pero negativas para IP3R. Cruces (+) indican fibras musculares positivas tanto para MHC I, como para IP3R. Barra en I: 50 m.

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DISCUSIN Los IP3Rs presentan una distribucin diferencial en el msculo esqueltico humano normal En este estudio hemos reportado, utilizando inmunofluorescencia, que los tres tipos de IP 3Rs estn abundantemente expresados en msculo esqueltico humano. Las tres isoformas de IP3Rs se distribuyen de una manera organizada tanto en el nivel tisular, como celular. La distribucin tisular de los IP3Rs est diferenciada segn el tipo de fibra muscular, las tres isoformas de receptores se expresan preferentemente en las fibras tipo II. Todas las fibras musculares tipo II, identificadas por la presencia de MHC II, expresan las tres isoformas de IP3Rs. En cuanto a la localizacin intracelular, los tres tipos de IP 3Rs fueron identificados en el citoplasma de las fibras musculares, en un patrn que sugiere una ubicacin en el retculo sarcoplasmtico. Adems, los IP3Rs tipos 1 y 3 presentan una localizacin en la periferia de las fibras musculares, compatible con las regiones de los ncleos celulares. La localizacin intracelular de los IP3Rs qued planteada en trminos de sugerencia, puesto que se propone por ubicacin y morfologa de las marcas, pero no se confirm realizando anlisis de colocalizacin con marcadores especficos de las estructuras celulares propuestas. La probable localizacin nuclear de los IP3Rs pudo ser mostrada utilizando una contratincin fluorescente del DNA nuclear con, por ejemplo, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) o Hoechst 33342. Mostrada la localizacin nuclear, el anlisis de colocalizacin de los IP3Rs con un marcador especfico de la membrana interna de la envoltura nuclear, como LAP2 (lamin-associated polypeptide 2), entregara informacin si estos se ubican en envoltura nuclear o nucleoplasma. Para identificar la proporcin de la probable localizacin nuclear que corresponde a mioncleos o ncleos de clulas satlites, se debe utilizar algn marcador

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especfico de estas ltimas, como la protena PAX7. La probable localizacin citoplasmtica de los IP3Rs en el retculo sarcoplasmtico, sugerida por los patrones citoplasmticos identificados tanto en cortes transversales (moteado) como longitudinales (estriado), tambin debe ser confirmada por ensayos de colocalizacin con marcadores especficos de este organelo, por ejemplo, SERCA1 o calreticulina (protena tampn de Ca2+ localizada al interior de las cisternas del retculo). Eventualmente, podra avanzarse en la localizacin subcelular de los IP3Rs, en cortes longitudinales o fibras aisladas, con marcadores especficos de estructuras organizadas en un patrn estriado, como se ha descrito en cultivos primarios y en msculo de ratn: lnea Z (desmina, -actinina), banda A (MyHCs), cisternas terminales del retculo (SERCA1), tradas (subunidad 1 del DHPR, RyR). En forma preliminar, se utiliz los marcadores LAP2, calreticulina y -actinina para confirmar la localizacin intracelular de los IP3Rs, pero los datos disponibles an no son concluyentes. Al menos, es necesario mostrar la localizacin en retculo sarcoplasmtico y ncleos con ensayos de colocalizacin, lo que deber realizarse en una etapa prxima de la investigacin. Hasta la fecha no se han publicado reportes que describan la distribucin de los IP 3Rs en msculo esqueltico humano adulto. La presencia de los IP 3Rs en msculo esqueltico humano normal fue descrita en la lnea celular RCMH, originada de msculo cudriceps de un donante adulto, mediante ensayos de unin de 3H-IP3 (Liberona y cols., 1997). Reportes de la localizacin de los IP3Rs en msculo esqueltico adulto han sido realizados en rata (Moschella y cols., 1995) y ratn (Salanova y cols., 2002; Powell y cols., 2003). Moschella y cols. (1995) describieron mediante inmunohistoqumica, utilizando un anticuerpo policlonal purificado por afinidad que reconocera las tres isoformas de IP3Rs, la distribucin diferencial de los IP3Rs en fibras musculares esquelticas tipos I (lentas, oxidativas) y IIA (rpidas, oxidativo-glicolticas) de rata. Adems, mediante ensayos de unin de 3H-IP3 observaron una mayor cantidad de 34

IP3Rs en un msculo lento comparado con uno rpido. En msculo esqueltico de ratn no ha sido descrita la distribucin de los IP3Rs con relacin a los tipos de fibras musculares. Salanova y cols. (2002), en cortes longitudinales de msculo esqueltico de ratn, describieron la localizacin de los IP3Rs en un patrn estriado coincidente con las lneas Z, que correspondera a retculo sarcoplasmtico, similar a lo descrito previamente en miotubos (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001). Tambin en msculo esqueltico de ratn, Powell y cols. (2003) describieron que el IP3R tipo 1 se localiza en el citoplasma de las fibras, en estriaciones que se corresponden con las lneas Z. Adems, el IP 3R tipo 1 se identific en las clulas satlites y en componentes postsinpticos de las uniones neuromusculares. Por otro lado, la localizacin de las tres isoformas de IP 3Rs ha sido ampliamente descrita en clulas musculares esquelticas en cultivo primario (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001; Crdenas y cols., 2005), como fue indicado en la Introduccin. Recientemente se ha mostrado la localizacin intracelular de los tres tipos de IP3Rs en clulas RCMH (Crdenas y cols., 2008). El IP3R tipo 1 present una fuerte marca perinuclear, en un patrn longitudinal; el IP3R tipo 2 se localiz en la envoltura nuclear y en algunas estriaciones perinucleares, y el IP3R tipo 3 se concentr en el ncleo, con una marca dbil y difusa en el citoplasma. La localizacin intracelular sugerida en el presente trabajo es concordante con estos reportes previos. La distribucin diferencial de los IP3Rs en el msculo normal qued bien establecida en esta investigacin y permite proponer una hiptesis explicativa funcional para este patrn de distribucin, que se desarrolla a continuacin. En modelos celulares de msculo esqueltico, se ha establecido que los IP 3Rs participan en la generacin de seales de Ca2+ gatilladas por despolarizacin de la membrana plasmtica, que estn asociadas con la expresin gnica. Las seales intracelulares de Ca 2+ originadas en los IP3Rs regulan los factores de transcripcin CREB (cAMP/Ca2+-response element-binding 35

protein; Powell y cols., 2001; Carrasco y cols., 2003; Crdenas y cols., 2004 y 2005), AP-1 (activator protein-1) y NF-B (nuclear factor B; Jureti y cols., 2006; Valds y cols., 2007). La activacin de CREB es inducida a travs de protena quinasa C (PKC; Crdenas y cols., 2004). Al mismo tiempo, las seales de Ca 2+ dependientes de IP3 estn involucradas en la activacin transcripcional de los genes tempranos c-fos, c-jun y egr-1 (Araya y cols., 2003; Carrasco y cols., 2003), y regulan la expresin gnica de IL-6 y troponina I (Jureti y cols., 2006 y 2007). Adems, la seal lenta de Ca 2+ induce la activacin de las MAPK ERK1/2 (mitogen-activated protein kinase, extracellular signal-regulated kinase 1/2; Powell y cols., 2001; Carrasco y cols., 2003; Crdenas y cols., 2004), que tienen un rol como reguladores transcripcionales en programas de plasticidad celular (Schiaffino y cols., 2007). Recientemente, se ha descrito la seal lenta de Ca 2+ y la activacin de ERK1/2 asociada a ella en la lnea celular humana RCMH (Crdenas y cols., 2008). El msculo esqueltico adulto est compuesto de mltiples tipos de fibras que difieren en sus capacidades de contraccin y formas predominantes de metabolismo energtico. La frecuencia relativa de cada tipo de fibra en un msculo define sus capacidades funcionales globales. En respuesta a una variedad de estmulos ambientales, los msculos modifican sus caractersticas funcionales cambiando sus tipos de fibras, este es el fenmeno de plasticidad celular (Pette y Staron, 2001; Bassel-Duby y Olson, 2006; Schiaffino y cols., 2007). El msculo esqueltico es un tejido altamente plstico, pero los mecanismos moleculares responsables de la diversificacin de fibras permanecen poco claros. El perfil de tipos de fibras y la expresin gnica muscular son controlados por la actividad nerviosa, a travs de la modulacin de vas de sealizacin especficas, como las asociadas a las seales intracelulares de Ca 2+ (BasselDuby y Olson, 2006; Schiaffino y cols., 2007).

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En este contexto, se ha descrito en un modelo de fibras musculares de ave en cultivo primario, que el IP3R tipo 1 es ms abundante en fibras rpidas que lentas, que el bloqueo de su actividad por inhibidores selectivos induce la expresin de una isoforma lenta de MHC en fibras rpidas y la transicin del tipo de fibra, de rpido a lento (Jordan y cols., 2005). En el mismo modelo celular, se report que la sobrexpresin de PKC reprimi la expresin de MHC lenta y la inhibicin de PKC indujo la expresin de MHC lenta (DiMario, 2001). La actividad de la fosfata regulada por Ca2+ calcineurina ha sido asociada al mantenimiento de un fenotipo lento en fibras musculares esquelticas (Schiaffino y Serrano, 2002). En miotubos de rata en cultivo primario, se mostr que la activacin del factor de transcripcin NFAT (nuclear factor of activated T cells), efector final de la va de sealizacin de calcineurina, no est asociada a la regulacin por seales de Ca2+ dependientes de IP3 (Valds y cols., 2008). No obstante, en este mismo modelo celular, se observ que la expresin de troponina I, esqueltica lenta 1, protena sarcomrica de fenotipo lento, es regulada por la seal de Ca2+ generada por los IP3Rs (Jureti y cols., 2007). Por otro lado, recientemente se ha reportado una expresin diferencial de ERK1/2 en fibras musculares esquelticas de ratn y rata, siendo ms abundantes en fibras tipo II. ERK1/2 activadas son necesarias para preservar el fenotipo de fibra rpida y reprimir el fenotipo lento. La activacin de ERK1/2 estimul la expresin de genes de un programa rpido y su inhibicin indujo el fenotipo de fibra lenta (Shi y cols., 2008). La activacin de ERK1/2 en msculo esqueltico est asociada a la seal lenta de Ca 2+ dependiente de IP3, como se expuso anteriormente. Esta evidencia en su conjunto sugiere una participacin de las seales de Ca2+ generadas por los IP3Rs en la modulacin de la expresin gnica asociada a la plasticidad muscular, probablemente regulando la expresin de un programa transcripcional de fibra rpida. La 37

distribucin diferencial de los IP3Rs en distintos tipos de fibras musculares esquelticas, en el caso del msculo humano en fibras tipo II, permite sostener la hiptesis que pueden existir diferentes cinticas de la seal lenta de Ca 2+ en los distintos tipos de fibras. En fibras musculares esquelticas adultas de ratn tambin se ha descrito la seal lenta de Ca 2+ dependiente de IP3 gatillada por estmulo elctrico y una distribucin diferencial del IP 3R tipo 1, preferentemente en una subpoblacin de fibras tipo II (Casas y Jaimovich, 2008). Las probables cinticas diversas de las seales de Ca 2+ mediadas por los IP3Rs, podran tener un rol en la expresin de programas transcripcionales especficos relacionados con la diferenciacin del tipo de fibra muscular. La distribucin diferencial de los IP3Rs se pierde en el msculo esqueltico distrfico La expresin de las MHCs no es alterada por la distrofia, por lo que la conservacin del patrn en mosaico de la expresin de miosina lenta (MHC I), en reas mayoritarias de los tejidos distrficos, se interpret como indicador del buen estado de conservacin de los tejidos, as como marcador de preservacin de la identidad celular de las fibras musculares. Las reas en que no se observ el patrn en mosaico de la MCH I corresponderan a focos de fibras degenerativas y necrticas, sobre las que se produce un depsito artefactual de anticuerpos, y focos de fibras regenerativas, caracterizadas por su pequeo dimetro, con ncleo grande central. Esta poblacin de fibras regenerativas, que no se consider para el anlisis de distribucin de los IP3Rs en los casos distrficos (slo se consider reas en que se conserv el mosaico de la miosina), podra expresar tanto MHC I como MHC II, caracterstica que no fue evaluada, y este aspecto debe estudiarse con el uso de anticuerpos tanto para MHC I como MHC II. Asociada, podra realizarse una caracterizacin ms precisa de esta poblacin celular con, por ejemplo, marcadores de clulas satlites activadas, como el factor de transcripcin

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miognico MyoD. En cortes de msculo distrfico distrficos se prob algunos anticuerpos de distribucin conocida, como LAP2 (regin de la envoltura nuclear) y -actinina (lneas Z, patrn punteado grueso en corte transversal y estriado en corte longitudinal), observndose marca con ambos anticuerpos en los patrones esperados. Estos dos marcadores, junto a la miosina, dan cuenta de una buena conservacin de los tejidos y que la alteracin de la expresin gnica asociada a la distrofia pudiera no ser tan grave ni generalizada, al menos no para afectar la expresin de estos marcadores en particular. Otros marcadores cuya distribucin no es afectada por la enfermedad y que pudieron utilizarse son mioglobina y desmina, que daran cuenta del fenotipo muscular esqueltico conservado, de la viabilidad del tejido, y permitiran comparar con el msculo normal. En msculo esqueltico de pacientes con distrofia muscular de Duchenne, observamos una prdida de la distribucin diferencial de los IP3Rs observada en el msculo normal. Esta prdida del patrn normal de distribucin podra ser tanto causa como consecuencia de la distrofia, y las alteraciones en la expresin gnica y en la arquitectura celular que genera. La aproximacin experimental utilizada en esta investigacin no permite resolver esta interrogante. Pero s permite comentar que la modificacin observada en la distribucin de los IP3Rs pudiera no deberse a una mala conservacin del tejido o una alteracin extensa de la expresin proteica del msculo. Alternativamente, la alteracin en la distribucin de los IP3Rs pudiera tener un rol patognico, mediado por una desregulacin de las seales de Ca 2+ dependientes de IP3 y la consiguiente alteracin en la expresin gnica modulada por estas seales. Existe alguna evidencia que permitira construir una hiptesis orientada en este sentido. En la lnea celular RCDMD, derivada de msculo cudriceps de un nio con distrofia muscular de Duchenne (Caviedes y cols., 1994), los niveles basales de IP 3 estn aumentados y 39

el incremento en la masa de IP3 inducido por despolarizacin es de mayor duracin, comparada con su contraparte normal RCMH. Adems, la cantidad de IP 3Rs, medida por la unin especfica de 3H-IP3, y la masa de IP3 son mayores en clulas distrficas de ratn comparadas con clulas normales (Liberona y cols., 1998). En clulas RCDMD se ha descrito ltimamente una serie de alteraciones en los IP3Rs y los eventos regulados por las seales de Ca2+ dependientes de IP3, comparadas con clulas RCMH (Crdenas y cols., 2008). La expresin de IP3Rs se encuentra alterada, con un incremento del IP3R tipo 2 y una disminucin del IP3R tipo 3. Tambin se modifica la localizacin de los IP 3Rs: el tipo 1 cambia del perinuclear/retculo sarcoplasmtico al ncleo (envoltura nuclear y nucleoplasma), IP 3R tipo 2 aparece sobrexpresado y localizado en el nucleoplasma, e IP3R tipo 3 cambia del ncleo al retculo sarcoplasmtico. La seal de Ca 2+ dependiente de IP3, gatillada por estmulo elctrico, es ms rpida y de mayor amplitud en clulas RCDMD. La activacin de ERK1/2 observada en clulas RCMH no se produce en clulas RCDMD. Finalmente, el perfil global de expresin gnica inducida por despolarizacin est alterado en la lnea celular distrfica. No ha sido descrita una relacin directa entre los IP 3Rs y la distrofina, sin embargo, se ha reportado que la transfeccin de minidistrofina (una forma truncada de la protena distrofina) modula las seales de Ca2+ dependientes de IP3. La despolarizacin de la membrana plasmtica induce seales de Ca 2+, dependientes de IP3 y protena G, de mayor amplitud en clulas distrficas que en clulas transfectadas con minidistrofina (Balghi y cols., 2006a). Adems, la cantidad de sitios de liberacin de Ca 2+ intracelular en reposo es mayor en clulas distrficas comparadas con clulas que expresan minidistrofina. El nmero de estos sitios de liberacin se redujo al inhibir la va del IP 3 (Balghi y cols., 2006b). Estos datos dan cuenta de una sobre-regulacin de las seales de Ca2+ mediadas por IP3Rs en clulas distrficas, tanto en reposo como bajo estimulacin, y de un efecto inhibitorio de la minidistrofina sobre ellas. 40

La liberacin de Ca2+ desde el retculo sarcoplasmtico y las seales de Ca 2+ generadas en los IP3Rs podran tener un rol central en la desregulacin del Ca 2+ intracelular, descrita como evento patognico fundamental en la distrofia muscular de Duchenne. Se ha propuesto que la distrofina constituye la base de un complejo andamiaje molecular y de sealizacin en que estn insertos los canales de Ca2+. La ausencia de distrofina generara la prdida de esta asociacin molecular y la alteracin en la homeostasis del Ca 2+ (Constantin y cols., 2006). La prdida del patrn de distribucin normal de los IP3Rs en el msculo distrfico y las modificaciones descritas en las clulas RCDMD, sugieren que las alteraciones de las seales de Ca2+ dependientes de IP3 y de la expresin gnica modulada por ellas participaran en la patogenia de la enfermedad.

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