MC MARISOL CASTILLO

MORALES
 Cromatografía
Método usado para la separación de los componentes
de una muestra.

Técnica Fase Móvil

Cromatográfic Interacción separación
Fase
a Estacionaria

Ciencia de las separaciones.

Cromato= color/ Grafos= Escritura

 Antecedentes

En los tiempos de Aristóteles

se utilizaban los efectos
absortivos de distintas tierras
para tratar el agua de mar.

Sin embargo fue documentada

por primera vez por el
científico Ruso Tsweet en
1903-1906.
En el cual los componentes son distribuidos entre
dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra es móvil. La fase
estacionaria puede ser un sólido o un líquido
soportado en un sólido o en un gel (matriz).
Mientras que la móvil es un solvente.
 M o d o s d e c r o m a t o g r a f

G a s F lu id o S u p e r c L r í qt i cu oi d o

S ó l i d L o í q u i d So ó l i d L o i q u i d So ó l i d L o í q u i d
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

C r o m a t o g r a f í a
d e L í q u i d o s

C o l u m n a P l a n a r

S ó l i d Fo a s e u I n n t i . d I aó nE i x c c o l u Cs ia ó p n a F P i na pa e

F a s e F a se E x c l u P s e i ó r mn e a c i ó n
N o r m aR l e v e pr so a r T a mp o a r ñ Go se l
Los métodos cromatográficos son de
dos tipos fundamentales:
Cromatografía en columna:
La fase estacionaria se mantiene
dentro de un tubo angosto y la fase
móvil se hace pasar por el tubo con
presión o por gravedad
Cromatografía plana
La fase estacionaria esta sujeta por
una placa plana en los poros de un
papel. En este caso la fase móvil se
mueve a través de la fase
estacionaria por acción capilar por
la influencia de gravedad.
las retenciones mencionadas pueden
tener su origen en dos fenómenos de
interacción que se dan entre las dos
fases y que pueden ser :
 La adsorción
 La absorción
 Adsorcion
 La adsorción, que es la retención de
una especie química por parte de los
puntos activos de la superficie de un
sólido quedando delimitado el fenómeno
a la superficie que separa las fases o
superficie interfacial.
 El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase
móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una
mezcla de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con
otra fase, las sustancias se concentran más o menos en la superficie
de la otra fase; esto se llama adsorción.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LÍQUIDO-GAS:
La fase fija es un liquido y la fase móvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-GAS:

La fase fija es un sólido y la móvil un gas.

o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO:

La fase fija es un sólido y la móvil un líquido. Es la mas usual, se puede
hacer en columna o en capa fina.
 ABSORCION
 2. La absorción, que es la retención de
una especie química por parte de una masa,
y debido a la tendencia que esta tiene a
formar mezcla con la primera, absorción
pura, o a reaccionar químicamente con la
misma, absorción con reacción química,
considerando ambas como un fenómeno
másico y no superficial.
 METODOLOGIA
Algunos de los métodos cromatográficos
son:

Cromatografía en papel
Cromatografía de capa fina

La cromatografía en
capa fina se basa en la
preparación de una
capa, uniforme, de un
adsorbente mantenido
sobre una placa de
vidrio u otro soporte.
Cromatografía de intercambio iónico

Utilizan este método para separar

isótopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
Cromatografía de gel-filtración

Fodin y Porath en
1958 descubren
que usando como
fase estacionaria
geles se consigue
separar polímeros
sintéticos de alto
peso molecular.
Cromatografía de afinidad.

Ideada por Porath en

1967, usando como
fuente un péptido o
proteína unida
covalentemente a un
ligando y se utiliza para
la separación de
moléculas proteicas.
 Cromatografía de gas.

Es una de las técnicas más

utilizadas e importantes,
de forma que ha
revolucionado el campo de
la química analítica.
 APLICACIÓN

La cromatografía es un medio muy eficaz para

responder a las mas variadas preguntas que
tengan relación con las mezclas químicas.
En 1906 Tswett :
Método en el cual los componentes de una mezcla son
separados en una columna adsorbente dentro de un
sistema fluyente.
I.U.P.A.C :
Método usado principalmente para la separación
de los componentes de una muestra, en el cual
los componentes son distribuidos entre dos
fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra es móvil. La fase
estacionaria puede ser un sólido o un líquido
soportado en un sólido o en un gel (matriz). La
fase estacionaria puede ser empaquetada en una
columna, extendida en una capa, distribuida
como una película, etc...
Esta versión instrumental de la
cromatografía convencional
resulta más ventajosa debido a
los pequeñísimos volúmenes que
se necesitan para el estudio en
cuestión y los resultados se
obtienen en un tiempo mínimo.
Estos aspectos la hacen preferida
entre las técnicas de separación.
 APLICACION
Se ha convertido en una de las
herramientas más poderosas para
el químico analista en muy
diversos campos de aplicación.
 ¿Qué es H P L C ?

High High
Pressure Performance
Liquid Liquid
Chromatograp Chromatograp
hy hy

Avance de la instrumentación
Inicios de la instrumentación
 ¿Qué es H P L C ?

Técnica que realiza la separación

física de una mezcla de
compuestos a través de la
interacción selectiva entre los
solutos, una fase estacionaria y
una fase móvil, haciendo uso de
instrumentación automatizada de
alta resolución.
SISTEMA CROMATOGRAFICO
La cromatografía de líquidos de alta resolución ( HPLC )
es un método fisicoquímico de separación, basado en el
principio de la PARTICIÓN.

PARTICIÓN: es el reparto o distribución de los componentes

de una muestra entre dos fases: una móvil que es un líquido
y una fija que puede ser un sólido o un líquido.

FASE MÓVIL MUESTRA FASE FIJA

líquido sólido o líquido
 Columna
 Es un tubo ordinario de acero
inoxidable de diámetro interno
uniforme.
Empaque
 TIPOS DE COLUMNAS
 ANALITICAS
Long. 5-30 cm.
Diámetro interno 2 a 10 mm
Tamaño de partículas 2 a 10µm

 Preparativas
Long. 50 – 100 cm
DI desde 5cm
Tipos de empaque
  CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA:
La fase estacionaria es apolar, y la fase móvil polar.
Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo
reaccionar químicamente los centros silanoles activos
de la sílice con un trialquilclorosilano.
La retención se produce en esta especie de capa líquida
depositada químicamente como consecuencia de la
distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria
( apolar) y la fase móvil (polar).
Los compuestos más retenidos son los más apolares. La
retención y selectividad se controlan
fundamentalmente con la composición de la fase móvil.
Para obtener una fase móvil de fuerza de elución
óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano en agua.
  CROMATOGRAFIA EN FASE NORMAL
En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase
estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias
se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros
silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano.
La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en
esa especie de capa líquida depositada químicamente, como
consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase
estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito
menos polar será el primero que se eluye y el más polar el
último en eluir.
 PARTICION
 Es el reparto o distribución de los
componentes de una muestra entre dos
fases: una móvil que es un líquido y
una fija que puede ser un sólido o un
líquido

MUESTRA FASE
FASE MÓVIL ESTACIONARIA
sólido o líquido
Contribución de la columna

0.009"

0.040" 0.020"
 BOMBA
 Requisitos
6000 psi (lb/in2)
Flujo sin pulsaciones
Caudal 0.1 a 10 mL/min
Reproducibilidad del caudal
Componentes resistentes a la corrosión
Teflón, rubí, zafiro, cerámica, Tefzel
 TIPOS DE BOMBAS
 BOMBA RECIPROCA

 Bomba de
desplazamiento

 Bomba neumática
 Sistemas de inyección
 Manual

 Automática
 DETECTORES

DETECTORES
GENERALES SELECTIVO
INDICE DE REFRACCION UV
FRESNEL
DEFLEXIÓN
FLUORESCENCIA
INTERFEROMETRICO ELECTROQUIMICO
 REGISTRO
 REGISTRADOR
Señal en un grafico X-Y
 INTEGRADOR
Incluye tratamiento matemático
 COMPUTADORA
Software que incluye grafico, cálculos y
almacenamiento de datos
En el proceso cromatográfico se obtienen
señales o picos:
 CROMATOGRAMA
Parámetros
principales
Respuesta del detector

tr

Inyección
t’r
tm

tr= Tiempo de retención Tiempo

t’r= Tiempo de retención ajustado
tm= Tiempo de retención de un soluto no
retenido
 tR
t R ’ = t R - tM
SINAL

tM

TEMPO tr= Tiempo de retención

t’r= Tiempo de retención ajustado

tm= Tiempo de retención de un soluto no
retenido
 h = altura del pico

Inyección
W1/2 = ancho del pico a la media altura

Wb= Ancho del pico en su base

 t −t 2 * ∆t 1.176 * ∆tr
Re solución = R = r2 r1 = r =
1 (W + W ) (W + W ) Wb1 + Wb 2
2 b1 b2 b1 b2 1/ 2 1/ 2
Resolución
CROMATOGRAMA
Parámetros principales:Platos teóricos

tr

Inyección W1/2
t’r
tm
Wb

2 2
 tr   tr 
Platos Teóricos = N = 16  = 5.554 
 Wb   W1/ 2 
Lc
HETP = Altura eqivalente a un plato teórico = H =
N
Lc = Longitud de la columna
CROMATOGRAMA
Parámetros principales:Platos teóricos

Ecuación Maestra de la Resolución:

 k   α −1 N
RS =  * *
1+ k   α  4

Capacidad Selectividad Eficiencia

Factor Factor Platos
de retención de separación Teóricos
 El Proceso Cromatográfico

¿Cómo identificar cada compuesto cuando se tiene una serie

de picos en un Cromatograma?

Yo lo sé por el Tiempo de
Retenciónde los picos de
Estándares puros

Tiempo
 El Proceso Cromatográfico

¿Cómo sé qué cantidad está presente en la muestra?

Yo lo sé por el área y altura

de los picos
 Cuantificació
n
 Medición del área o altura del pico
 Cálculo de la concentración del analito
– Normalización Interna
– Estándar interno
– Estándar externo
– Estándar agregado
 Estándar externo

 Es el método de cuantificación más utilizado

en HPLC. Consiste en la preparación de
estándares de concentración semejante al
analito en la muestra y en el ensayo
cromatográfico de ambas, muestra y
estándar en las mismas condiciones
operativas. Su exactitud depende de
manera importante de la calidad del
estándar utilizado.
 P = (Am Cs / As) D * 100
– Am = Area de la Muestra
– Cs = Concentración del estándar
– As = Area del Estándar
– D = Factor de Dilución
 GLOSARIO
 Electronegatividad  Fase normal
 Polaridad  Fase reversa
 Cromatografia  Exclusion de
 Tipos de tamaño
cromatografias  quiralidad
 Fase movil  Parámetros
 Fase estacionaria cromatograficos
 Bombas  Rs. Rt, Vo, To, N, etc
 Columnas