Seccin Microbiologa

de Alimentos
1.

Fecha emisin:
PROCEDIMIENTO ESTERILIDAD
1996
COMERCIAL EN CONSERVAS:
Revisin: 2
DETERMINACION MESOFILOS Y
TERMOFILOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS,
Fecha revisin:
NCh 2731 OF 2002
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OBJETIVO

Detectar clulas viables de microorganismos mesfilos y termfilos, aerobios y anaerobios en

conservas.
2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Este mtodo es aplicable a productos alimenticios contenidos en envases hermticamente

sellados que han sido sometidos a tratamiento trmico que garantiza su esterilidad comercial.
(Conservas)
3.

FUNDAMENTO

Para favorecer la deteccin de microorganismos viables, se incuban previamente los envases en

estufa a 35 y 55C durante 10 y 5 das respectivamente.
El control de esterilidad se realiza sembrando una alcuota del producto en medios enriquecidos
con la finalidad de permitir el desarrollo de clulas viables daadas.
Se utilizan medios de bajo potencial de xido reduccin para el desarrollo de anaerobios y
previamente se expulsa el oxgeno presente en el medio antes de realizar la siembra para el
desarrollo de anaerobios.
4.

REFERENCIAS

4.1

Norma Chilena Oficial NCh 2731.Of2002.

5.

TERMINOLOGA

5.1

Conservas: productos alimenticios envasados en contenedores hermticamente sellados

que han sido sometidos a tratamiento trmico que garantiza su esterilidad comercial.

5.2

Lote: conjunto homogneo de envases o unidades primarias, de peso, tipo y clase

similares, procesadas bajo condiciones semejantes, en una jornada de trabajo, las que se
identifican con una calve de produccin.

5.3

Microorganismos mesfilas y termfilos aerobios y anaerobios: bacterias que se pueden

desarrollar a temperatura de 35C y 55C, en presencia y ausencia de oxgeno,
respectivamente y que pueden estar presentes en productos en conserva. Su presencia
puede causar procesos alterativos en el productos alimenticio y/ o afectar a la salud del
consumidor.

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5.4

Muestra: conjunto de unidades representativas de un lote obtenidas mediante la aplicacin

de un plan de muestreo con el fin de realizar pruebas y anlisis microbiolgicos. Una
muestra est formada por 10 unidades.

5.5

Las conservas, segn el pH se dividen en dos grupos:

Conservas de baja acidez: alimentos con un pH mayor de 4.6.
Conservas cidas: alimentos con un pH menor de 4.6

6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

Materiales

6.1.1

Punzn estril.

6.1.2

Abrelatas bacteriolgicos estriles o abrelatas metlico esterilizable.

6.1.3

Propipetas.

6.1.4

Esptulas estriles o pinzas estriles.

6.1.5

Placas Petri.

6.1.6

Tubos de ensayo de 18mm x 150mm de tapa rosca.

6.1.7

Bandejas.

6.1.8

Porta y cubreobjetos de vidrio.

6.1.9

Algodn.

6.1.10 Cuchillos estriles.

6.1.11 Embudo de 15 cm de dimetro o mayor.
6.1.12 Pipetas bacteriolgicas estriles graduadas de 1 mL, 5 mL y 10 mL.
6.1.13 Asas de inoculacin de 3 mm.
6.2

Medios de cultivo y reactivos

6.2.1

Caldo Cerebro Corazn con Almidn o Caldo Dextrosa prpura de Bromocresol.

6.2.2

Caldo carne picada o caldo hgado o Cooked meat medium.

6.2.3

Agar al 2% o mezcla vaspar o agar azul de metileno.

6.2.4

Reactivos para tincin de Gram.

6.2.5

Reactivos para tincin de esporas.

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6.2.6

Solucin Hipoclorito de Sodio al 2% en buffer fosfato pH 6,2 o yodo al 2% en etanol al

70.

6.2.7

Buffer Fosfato pH 6,2.

6.3

Equipos

6.3.1

Gabinete microbiolgico o cmara de flujo laminar.

6.3.2

Incubadoras reguladas a 35C 1C y 55 1 C.

6.3.3

Medidor de pH de 0,1 unidad de pH a 25C.

6.3.4

Balanza de 0,1 g de resolucin.

6.3.5

Microscopio.

6.3.6

Termmetros de inmersin total, con graduacin de 0,1 C a 0,5 C.

7.

DESARROLLO

7.1

Recepcin de las muestras

7.1.1

Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el anlisis los ms pronto
posibles.

7.1.2

En el caso de ser necesario postergar el anlisis, se puede mantener a temperatura

ambiente.

7.1.3

Recepcin de las muestras (10 unidades conforman una muestra de la misma matriz y
mismo lote) que han sido registradas en el laboratorio de recepcin de muestras.

7.1.4

Remover la etiqueta y marcar los envases de conserva para identificarlos como muestra
de ensayo y registrar la muestra en el RG-712.00-062.

7.1.5

Revisar y anotar los detalles de alguna alteracin (dao fsico, xido, abolladura,
particularmente en el sello lateral y doble sello en el caso de envases que sean latas).

7.1.6

Conservar las etiquetas por un perodo de 3 meses.

7.1.7

Lavar los envases con detergente neutro, enjuagar bajo chorro de agua hasta sacar
totalmente el detergente del envase.

7.1.8

Secar uno por uno los envases con papel absorbente.

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Cuidar de no borrar la identificacin de clave y nmero con que es recibida en el

laboratorio.

7.1.10 Marcar el envase a la temperatura que se incubar.

7.2

Incubacin de las muestras

7.2.1

Incubar 5 envases de conserva en incubadora a 35 C durante 10 das para el desarrollo

de microorganismos mesfilos.

7.2.2

Incubar los otros 5 envases restantes de conserva en incubadora a 55 C durante 5 das

para el desarrollo de microorganismos termfilos.

7.2.3

Incubar los envases sobre un papel absorbente.

7.2.4

Revisar e invertir los envases incubados todos los das para detectar filtraciones o
abombamiento.

7.2.5

Los envases que se abomben o filtren durante la incubacin, deben ser excluidos del
anlisis y se dejar el registro correspondiente.

7.2.6

En el caso de abombamiento si es de inters conocer el origen del problema, puede

procederse a un anlisis bacteriolgico indicndolo en el informe de resultados,
siguiendo las instrucciones del punto 7.6 del procedimiento.

7.3

Preparacin de los medios de cultivo

7.3.1

Calentar en olla a bao mara con un poco ms del nivel del medio a 100 C durante 10
minutos, los tubos de Cooked meat medium, caldo carne picada o caldo hgado para
eliminar el oxgeno presente en el medio, soltando un poco la tapa de los tubos.

7.3.2

Enfriar rpidamente bajo chorro de agua corriente antes de utilizar cuidando de que no
caiga agua sobre la tapa de los tubos.

7.3.3

Todo tubo que se voltee o que entre agua debe ser eliminado.

7.3.4

Identificar los tubos con la temperatura de incubacin, nmero y clave que corresponda
segn identificacin de la muestra (dos tubos de caldo Cerebro Corazn con Almidn
para el desarrollo de microorganismos aerobios y dos tubos de Cooked meat medium
para el desarrollo de anaerobios).

7.4
7.4.1

Apertura de las muestras

Finalizado el perodo de incubacin, sacar los tarros de la incubadora.

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7.4.2

La apertura de los envases de la muestra de ensayo se debe realizar en un ambiente lo

ms asptico posible. Se recomienda el uso de una cmara de flujo laminar vertical.

7.4.3

Se debe manipular el producto con extrema precaucin, an cuando los envases no

presenten alteraciones, porque puede estar presente la toxina botulnica.

7.4.4

Esperar a que se disipe todo el gas contenido en la conserva, porque ste puede ser
txico.

7.4.5

Al inicio y durante el proceso de siembra, se debe efectuar un control del ambiente del
rea de trabajo segn IT-712.00-060.

7.5

Envases sin abombamiento

7.5.1

Dejar enfriar a temperatura ambiente.

7.5.2

Desinfectar los envases introducindolos en un a solucin desinfectante de hipoclorito

diluido al 2% en buffer fosfato pH 6,2 o yodo al 2% en etanol al 70 (para su
preparacin consultar gua Preparacin de Reactivos).

7.5.3

Los tarros deben permanecer en la solucin de 20 a 30 minutos. Introducirlos con la

identificacin de clave y nmero hacia arriba.

7.5.4

Retirar de la solucin desinfectante.

7.5.5

Dejar secar sobre el mesn de la cmara de flujo laminar u otro ambiente de

contaminacin controlada por unos 30 minutos o hasta que se seque.

7.5.6

Invierta el tarro de modo tal que la identificacin quede hacia abajo.

7.5.7

Abrir las latas utilizando un abrelatas bacteriolgico estril.

7.5.8

Usar un abrelatas estril para cada unidad de muestra.

7.6

Envases con abombamiento (slo cuando sea necesario y se dispongan de

condiciones de bioseguridad apropiadas)

las

7.6.1

Enfriar los envases en refrigerador.

7.6.2

Desinfectar, NUNCA FLAMEAR.

7.6.3

Colocar el envase en un recipiente suficientemente grande para recibir posibles

derrames.

7.6.4

Cubrir el envase con un embudo invertido de tamao suficiente para evitar salpicaduras.

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7.6.5

Colocar en el vstago del embudo un algodn que permita la introduccin de un punzn

y perforar el envase.

7.6.6

Abrir como una muestra normal y proceder al anlisis.

7.7

Siembra de muestras: Inoculacin e Incubacin

7.7.1

Abrir el tarro con el abrelatas estril verificando y confirmando que corresponda a los
tubos a sembrar.

7.7.2

Disponer para cada unidad de muestra de dos tubos de Caldo Cerebro Corazn con
almidn o Caldo Dextrosa triptosa con prpura de bromocresol, para el desarrollo de
microorganismos aerobios y dos tubos de Cooked meat medium, Carne picada o Caldo
hgado para el desarrollo de anaerobios.

7.7.3

El medio para anaerobios debe estar previamente regenerado como se indica en el punto
7.3.

7.7.4

Tomar con pinza, esptula o pipeta estril una alcuota de cada envase de la muestra de
ensayo, aproximadamente de 1 g en caso que sea slido o de 1 mL en los lquidos o
semilquidos.

7.7.5

Introducir tratando de no tocar las paredes del tubo con medio de cultivo, previamente
identificado con el nmero de muestra y temperatura de incubacin.

7.7.6

Inocular por cada unidad de muestra y temperatura de incubacin en los tubos con
medios de cultivo preparados como se indica en 7.7.2.

7.7.7

Despus de sembrados, taponar los tubos para anaerobios (Cooked meat medium) con 1
mL vaspar o agar al 2% para lograr la anaerobiosis. (El agar debe estar a 45C).

7.7.8

Incubar los tubos a la misma temperatura de incubacin del tarro e identificada en los
tubos con la siembra.

7.7.9

Para determinar la presencia de microorganismos mesfilas incubar los tubos inoculados

a 35 C por 4 a 5 das.

7.7.10 Para la determinacin de microorganismos termfilos, incubar los tubos inoculados a

55C durante 1 a 3 das.
7.7.11 Se recomienda incubar paralelamente un control de esterilidad de cada medio de cultivo.
7.7.12 Antes de eliminar el contenido del tarro sembrado medir el pH del contenido.
7.7.13 Registrar el pH de la conserva en RG-712.00-062.

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7.7.14 Observar los tubos cada da para detectar si hay cambios.

7.8

Disposicin o eliminacin de las muestras

7.8.1

Una vez obtenido el material a inocular, esterilizar los envases de la muestra de ensayo
con su contenido, durante 30 minutos a 121 C.

7.8.2

No guardar contramuestra del contenido una vez abierto el envase.

7.9

Lectura de los tubos

7.9.1

Transcurrido el perodo de incubacin, sacar los tubos de la incubadora.

7.9.2

Observar si hay desarrollo de microorganismos por turbidez y viraje del indicador en los
tubos con cultivo para aerobios.

7.9.3

Observar la turbidez con o sin formacin de gas (por desplazamiento del tapn de
mezcla vaspar o agar) en los cultivos para anaerobios.

7.9.4

Si los tubos de cultivo de anaerobios presentan desarrollo a la temperatura de 35 C y

los cultivos de aerobios no presentan desarrollo, extremar las precauciones de
manipulacin podra ser indicativo de presencia de Clostridium botulinum.

7.9.5

Registrar todas las lecturas en RG-712.00-062.

7.10 Pruebas de Confirmacin

7.10.1 Si se observa desarrollo en alguno de los tubos, exceptuando lo detallado en 7.9.4,
realizar subcultivos, inoculando un agota a un nuevo tubo con el mismo medio de
cultivo utilizado inicialmente. Incubar a la misma temperatura de incubacin del tubo
que origin el cultivo.
7.10.2 Leer a las 24 horas a 48 horas y registrar todos los antecedentes necesarios, como
presencia de gas, turbidez o ambos.
7.10.3 Efectuar una tincin de Gram y una tincin de esporas.
7.11 Interpretacin de los resultados e informe
7.11.1 Se considera que la muestra cumple con los requisitos de esterilidad comercial cuando
no se observa desarrollo microbiano en ninguno de los tubos inoculados. Informar que
no hubo desarrollo de microorganismos mesfilos y termfilos indicando por separado
aerobios y anaerobios.

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7.11.2 Se considera que la muestra no cumple con los requisitos de esterilidad comercial,
cuando se observa desarrollo en alguno de los tubos inoculados. Informar el desarrollo
de microorganismos mesfilos y termfilos, aerobios y anaerobios segn corresponda y
los resultados de la tincin de Gram y de esporas.
7.11.3 Agregar como, informacin adicional las alteraciones del envase observadas durante la
incubacin.

8.
8.1

REGISTROS
Registro control esterilidad comercial en conservas

9.

ANEXOS

Anexo N 1 Tabla resumen del procedimiento de anlisis

Anexo N 2 Reactivos

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ANEXO N 1
Resumen del procedimiento de anlisis

Tipo de muestra

Tipo de
microorganismo
a determinar

Mesfilos
(Envase
preincubados
a 35 c)

Aerobios

Termfilos
( Envases
preincubados
a 55C

N de tubos
inoculados en
CCC con
almidn o caldo
dextrosa triptosa
con prpura de
bromocresol

N de tubos
inoculados en:
caldo carne
picada, cooked
meat o caldo
hgado

T de incubacin
(C)

Tiempo de
incubacin
(Das)

35

4a5

35

4a5

55

1a3

55

1a3

Anaerobios

Aerobios

Anaerobios

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ANEXO N 2
REACTIVOS
1.- Mezcla Vaspar
Vaselina
Parafina slida
Fundir la parafina y mezclar con igual cantidad de vaselina lquida. Envasar en frasco de vidrio
dejando 1/3 libre del envase.
Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min.
Otra alternativa es utilizar parafina slida de punto de fusin 57 C a 60 C. En este caso slo es
necesario fundir y esterilizar.
2.- Agar azul de metileno
Glucosa
10 g
Agar
20 g
Azul de metileno
0,1 g
Agua destilada
1 L
Disolver los ingredientes en agua destilada por calentamiento. Agregue 10 mL de hidrxido de
sodio 0,1 N. Esterilizar en autoclave a 121C por 15 min.
Este agar es utilizado como sello para tubos de cultivo. El oxgeno atmosfrico causa un color azul
en la superficie, el que gradualmente difunde hacia el interior. La presencia de una decoloracin del
agar en la parte inferior del sello indica que las condiciones de anaerobiosis se mantienen.
3.- Reactivo para tincin de esporas
Solucin A
Verde de malaquita
10 g
Agua destilada
100 mL
Mezclar y filtrar para remover el precipitado insoluble.
Solucin B
Safranina O
Agua destilada
Mezclar hasta disolucin total.

0,25 g
100 mL