RNA de interferencia:

el silencio de los genes

Toms Lpez, Daniela Silva, Susana Lpez y Carlos Arias

El camino a todas las cosas grandes pasa por el silencio

Friedrich Nietzsche

Uno de los avances ms importantes en la biologa de las ltimas dcadas ha sido el descubrimiento de molculas de RNA que regulan
la expresin de genes. La principal funcin que
se le ha reconocido al RNA es como parte de la
maquinaria de produccin de protenas. Los RNA
mensajeros (mRNA) son los intermediarios en la
expresin de genes, transmitiendo informacin
entre el DNA y la maquinaria de sntesis de protenas. Los RNA de transferencia (tRNA) son el
elemento decodificador que permite traducir de
un lenguaje de nucletidos (el que tiene el DNA y
el mRNA) a un lenguaje de aminocidos (el de las
protenas), y los RNA ribosomales (rRNA) son parte de la maquinaria que produce las protenas.
El silenciamiento por RNA es un mecanismo
altamente conservado en la naturaleza en el que
molculas de RNA de doble cadena (dsRNA) regulan la expresin de genes. El fenmeno fue inicialmente descubierto en 1990, cuando botnicos
que se encontraban trabajando con petunias intentaron sobre-expresar a la enzima que produce
el color prpura (llamada chalcona sintasa). Para
ello introdujeron varias copias del gen que codifica para esta enzima esperando encontrar que
las plantas que sobre-expresaran a la chalcona
sintasa fueran prpuras. Sin embargo, descubrie-

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ron que se generaban flores sin color o con parches blancos. Al analizar los niveles de la enzima
encontraron que eran 50 veces menores a los de
las plantas originales. Esta observacin implicaba
que los genes que introdujeron no se estaban
expresando, pero tambin que el gen natural de
la planta dejaba de expresarse, por esta razn al
fenmeno se le llam co-supresin. Un fenmeno equivalente fue descrito dos aos despus
en un hongo conocido como Neurospora crassa;
a este fenmeno le llamaron quelling (detener
abruptamente). Estas observaciones fueron
mejor entendidas en 1998 gracias a Andrew Fire
y Craig Mello, quienes por su trabajo recibieron
el premio Nobel de medicina 2006. Ellos descubrieron que tras la inyeccin de dsRNA dentro del
nemtodo Caenorhabditis elegans se produca un
silenciamiento de la expresin de genes que era
especfico de secuencia, es decir, que la expresin
del gen que presenta la misma secuencia que el
dsRNA se inhiba. Este fenmeno explicaba tanto
la co-supresin como el quelling y fue denominado interferencia de RNA (RNAi).
El mecanismo de la RNAi fue descrito in vitro
utilizando extractos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Estos estudios revelaron
que molculas largas de dsRNA eran cortadas
en fragmentos pequeos con una estructura

109

Biologa del RNA de interferencia

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110 | RNA de interferencia: el silencio de los genes

especfica: dos cadenas de 21 a 25 nucletidos

interaccionado en forma de dplex, donde 19
nucletidos se encuentran formando RNA de
doble cadena y dos nucletidos sin aparearse
en los extremos (figura 1). Estas molculas fueron denominadas RNA interferentes pequeos
(siRNA) y se demostr que son las mediadoras
del proceso de interferencia.
Hasta el ao 2000, la RNAi fue una herramienta que se utiliz para apagar la expresin
de genes en varios organismos, pero no en mamferos. Esto debido a que las molculas grandes de dsRNA (de ms de 30 pares de bases)
inducen en clulas de mamfero una respuesta
que generalmente desencadena la muerte de
la clula. Sin embargo, ese ao el grupo de Tom
Tuschl describi que cuando se utilizan directamente los siRNA, es posible inducir el proceso
de interferencia en clulas de mamfero sin que
despierte la respuesta que conduce a la muerte celular. Este descubrimiento abri la posibilidad de utilizar la interferencia de RNA como
una herramienta en la investigacin enfocada
a clulas de mamferos.

El silenciamiento: biognesis
y mecanismos de interferencia
Se han descrito varias clases de molculas pequeas de RNA que desencadenan el proceso de
silenciamiento por interferencia, las ms ampliamente los RNA interferentes pequeos (siRNA) y
los microRNA (miRNA).
siRNA
Estas molculas tienen un tamao de 21 a 25
nucletidos y son producidas a partir de precursores de RNA de doble cadena que pueden
variar de tamao y origen (figura 1). Estos precursores son procesados por miembros de la
familia de enzimas que degradan RNA, conocidas como la familia de la RNAsa tipo III. En particular, la enzima que degrada los precursores
de dsRNA hasta siRNA se conoce como dicer. Los
siRNA resultantes son incorporados a un complejo denominado siRISC (RNA-induced silencing
complex). Este complejo est compuesto por

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numerosas protenas celulares. La incorporacin del siRNA al siRISC est acoplada a la separacin de las dos cadenas en cadenas sencillas,
slo una de las cuales, conocida como cadena
gua, se mantiene asociada al complejo y sirve
para identificar el mRNA con la secuencia complementaria. Cuando las molculas de mRNA
complementarias son encontradas, la interaccin entre el siRNA y este mRNA desemboca en
el corte del mRNA y su posterior degradacin.
En plantas, los siRNA pueden ser transportados al ncleo e inhibir la sntesis del mRNA a
partir del gen correspondiente, fenmeno que
se conoce como silenciamiento transcripcional.
Otro fenmeno importante que ocurre en
varios organismos, pero no en mamferos, es
que los mediadores de la interferencia pueden
viajar desde las clulas en que se producen hasta otras clulas del organismo. De esta manera
es posible lograr que se silencie la expresin de
un gen en el organismo completo, aunque la
induccin original haya sido solamente en una
parte. En este tipo de organismos, como el gusano C. elegans, el silenciamiento es heredable.
microRNA
Aunque presentan mucha similitud con los
siRNA, los microRNA son producidos por una
va de sntesis diferente. Los precursores de los
microRNA son transcritos a partir de genes celulares, tal y como se producen los mRNA. A esta
primer molcula de RNA se le denomina microRNA primario (pri-microRNA) y es procesada en el
ncleo por otra enzima de la familia RNAsa tipo
III denominada drosha. El resultado del corte de
drosha es una molcula de RNA de entre 70 y 100
nucletidos con una estructura compleja. Partes
de la molcula forman una estructura de doble
cadena de RNA unida por una seccin de cadena
sencilla. A este tipo de estructura le llamamos
de tipo tallo-asa (figura 1). A esta molcula de
RNA se le llama el precursor del microRNA (premicroRNA), el cual posee mltiples burbujas y
una serie de missmatches (zonas dentro de las
regiones de doble cadena que no pueden unirse
entre s) (figura 1). El pre-microRNA es posteriormente exportado del ncleo al citoplasma por

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Figura 1.
Va del RNA de interferencia. Las dos vas de procesamiento se indican con los nmeros 1 y 2. Los pasos de cada va
se sealan con letras. 1. Biognesis de microRNA: a) procesamiento por drosha en el ncleo, b) exportacin de
la molcula pre-microRNA del ncleo al citoplasma por
exportina-5, c) segundo procesamiento por dicer, d) identificacin y desnaturalizacin del microRNA por miRISC, e)
seleccin asimtrica de una de las cadenas del microRNA,
f) apareamiento con el mRNA blanco y represin de la
traduccin. 2. Biognesis de los siRNA: a) presencia de un
RNA de doble cadena en el citoplasma, b) procesamiento
por dicer, c) identificacin del dplex de 19 a 12 pares de
bases por siRISC, d) seleccin asimtrica de una de las cadenas del dplex, e) apareamiento con el RNAm blanco y
subsiguiente degradacin.

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una va que depende de la protena exportina-5.

Esta permite y regula el paso de molculas entre el ncleo y el citoplasma. Ya en el citoplasma, el pre-microRNA es cortado hasta adquirir la
estructura del microRNA maduro; es decir, una
molcula de dsRNA lineal de entre 21 y 24 nucletidos en donde de los extremos 5 sobresalen dos nucletidos. Este ltimo procesamiento
es realizado, al igual que en el caso de los siRNA,
por dicer. Los microRNA maduros se incorporan
a un complejo ribonucleoprotenico (miRNP o
miRISC) que es similar, y posiblemente idntico,
al siRISC. Una vez que estas molculas de RNA se
encuentran ensambladas en el miRISC, el complejo dirige el silenciamiento gentico.
Una diferencia importante entre la va de
los siRNA y los microRNA es el mecanismo por
el cual estas molculas silencian la expresin de
los genes. En general, los microRNA de animales reprimen la expresin gentica bloqueando
la traduccin de los mRNA, esto es, evitando la
sntesis de protenas; en este caso el mRNA no
es degradado, pero ya no se puede utilizar para
fabricar protenas. Otra diferencia importante
radica en el hecho que el apareamiento entre el
blanco y el microRNA no es perfecto.

Para qu utilizan las clulas

la interferencia de RNA
El mecanismo de interferencia est presente en
todos los eucariotes en los que se ha buscado;
esto sugiere que es un mecanismo muy antiguo
que apareci temprano en la evolucin y que
tiene un papel importante en el mantenimiento del funcionamiento celular. Una de las ideas
ms aceptadas que explican su persistencia es
que funciona como un sistema inmune a nivel
celular. Es decir, que le permite a la clula distinguir informacin gentica que le es propia, de la
que no lo es, la cual actuara como un parsito
molecular, aprovechando la maquinaria celular
para reproducirse y causando dao a la clula.
La informacin gentica que puede estar en
la clula y que pudiera actuar como un parsito
molecular tiene dos fuentes, los llamados elementos transponibles y los virus. La mayor parte

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de las familias de virus conocidos generan estructuras de dsRNA durante su replicacin, las
cuales pueden disparar el proceso de interferencia de RNA, que la clula utilizara para destruir
al RNA invasor.
Si la interferencia de RNA funcionara como
un mecanismo de proteccin contra la infeccin
por virus, se esperara que se cumplieran tres
condiciones. La primera es que el virus indujera la
aparicin de molculas de siRNA dirigidas contra
la secuencia del propio virus. La segunda condicin es que cualquier bloqueo del mecanismo de
interferencia favorecera la replicacin del virus.
Finalmente, sera de esperar que, si la interferencia de RNA fuera un mecanismo antiviral, los
virus, a su vez, adquirieran durante la evolucin
mecanismos para combatir esta interferencia.
Las tres condiciones mencionadas con anterioridad se cumplen para el caso de plantas y
de invertebrados. Sin embargo, en mamferos
no es claro el papel de la interferencia de RNA
como un sistema de defensa antiviral que opere naturalmente. A pesar de esto, ha sido demostrado ampliamente que la maquinaria de
la interferencia persiste en clulas de mamfero
y puede ser utilizada como un mecanismo antiviral inducido exgenamente utilizando siRNA.
La segunda funcin importante que se reconoce al sistema de interferencia es la de regular
la expresin de genes durante el desarrollo. Algunos de los ejemplos mejor estudiados fueron
descubiertos estudiando Arabidopsis thaliana.
En esta planta, cuando se pierde parcialmente
el gen dcl1 (el cual codifica para una de las protenas dicer), se generan alteraciones en el desarrollo, que incluyen un florecimiento tardo, prdida de sus meristemos y desregulacin en sus
clulas madres meristemticas (el meristemo lo
forman las clulas de la planta que le permiten
seguir creciendo). La prdida completa de este
mismo gen en C. elegans, genera un defecto en
el cambio de fase celular durante el desarrollo
post-embrinico, generando un arresto embrionario, por lo que el nemtodo no puede completar su desarrollo. En ratones, al anular el gen
que codifica para dicer se generan embriones
sin clulas madre o troncales.

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El nmero de genes que codifican para microRNA encontrados en diferentes animales

vara de 0.5 a 1% del nmero total de genes en
sus genomas. En el genoma del nematodo Caenorhabditis elegans y en el de la mosca de fruta
Drosophila melanogaster se calcula que hay entre 100 y 140 genes para microRNA, mientras
que los humanos tienen entre 200 y 255 genes.
Al menos 0.2% de los genes en Arabidopsis thaliana codifican para microRNA. La representacin relativa de los genes de microRNA (0.2-1%)
es comparable a las familias de otros genes reguladores, tales como factores transcripcionales (el grupo de protenas que se encarga de regular la transcripcin de los genes). Casi el 30%
de los microRNA son altamente conservados
y tienen sus equivalentes en genomas de vertebrados e invertebrados. Esto pudiera sugerir
que una fraccin significativa posee funciones
biolgicas evolutivamente conservadas.

La interferencia de RNA es un mtodo

eficiente para inhibir la expresin
de genes
Una de las principales estrategias utilizadas en
la investigacin cientfica para el estudio de los
distintos mecanismos celulares se denomina
prdida de funcin. Este concepto se refiere
a la eliminacin especfica de la funcin de una
protena en la clula para despus evaluar los
cambios y as definir el papel que juega dicha
protena. Por ejemplo, si se tratara de una protena que se requiere para promover la replicacin celular, al anular su funcin encontraramos que las clulas ya no se replican.
Esta estrategia ha sido extensamente utilizada desde hace tiempo. La anulacin de la
funcin se puede hacer de varias maneras.
Una de las estrategias ms antiguas es la de
inducir un cambio (denominado mutacin) en
el gen que genera la protena de inters; esta
mutacin debe ocasionar la prdida de funcin
de la protena. Una segunda tcnica es lo que
denominamos noquear el gen (KO), en este
caso el gen que genera la protena de inters ya
no es expresado en la clula. Estas estrategias

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requieren de modificar la informacin a nivel

del DNA, es decir, del gen. Regularmente estos
enfoques requieren de entrenamiento especializado y de mucho trabajo.
La interferencia de RNA ha demostrado ser
una herramienta muy eficiente para reducir
la expresin de un gen. Adems, resulta fcilmente utilizable por laboratorios sin experiencia previa. El diseo de los efectores de esta
va (siRNA o microRNA) est muy avanzado,
existen sin costo los programas para su diseo,
y la produccin comercial de siRNA se ha extendido. Actualmente existen compaas que
tienen disponibles siRNA contra virtualmente
todo el genoma de algunos organismos (por
ejemplo humano y ratn).
La interferencia de RNA ha demostrado su
enorme potencial, lo que se refleja en el creciente nmero de artculos cientficos que la
refieren como estrategia experimental. Una
bsqueda sencilla en el principal buscador de
artculos cientficos (el PubMed del National
Center for Biotechnology Information) arroja
ms de diez mil referencias bibliogrficas; igualmente, en buscadores como Google hay ms de
dos y medio millones de entradas. Estos datos
demuestran la importancia de esta herramienta, comparable con otras metodologas igualmente potentes como lo fue el desarrollo de la
reaccin en cadena de la polimerasa, PCR. No es
coincidencia que el premio Nobel de medicina
2006 fuera otorgado a los doctores Andrew Fire
y Graig C. Mello, los que originalmente describieron que fragmentos de dsRNA tienen la capacidad de inhibir la expresin de genes.

Estrategias para el uso efectivo

de la interferencia de RNA
En general hay dos tipos de ensayos: los transitorios, donde la expresin del gen se interfiere
slo temporalmente) y los estables (las clulas o
el organismo permanentemente interferidos).
En el primer caso suelen utilizarse los siRNA
sintetizados qumicamente; para el segundo se
requiere que la clula incorpore a su genoma los
elementos necesarios para fabricar una mol-

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cula de RNA de doble cadena que llegue hasta

el citoplasma. Esto se logra a partir de vectores
que producen shRNA (small hairpin RNA) o microRNA. Los shRNA son molculas que forman
una estructura del tipo tallo-asa (similar pero
ms sencilla que la de un microRNA), los cuales
son procesados por dicer y forman siRNA. El uso
de microRNA resulta muy eficiente porque se
utilizan molculas producidas naturalmente en
la clula; de esta manera se genera un proceso
de silenciamiento ms eficaz. Cuando se utiliza
microRNA es comn que se ocupe una secuencia
equivalente al pre-microRNA, en donde el tallo
que formar el microRNA maduro es cambiado
por la secuencia del gen que se desea interferir.
La sntesis de los siRNA puede hacerse por varias vas. En el caso de plantas e invertebrados,
se pueden utilizar molculas grandes de dsRNA
(que sern procesadas a siRNA dentro de la clula). En vertebrados no se pueden utilizar molculas de ms de 30 pares de bases, por lo que es
necesario producir directamente molculas de
siRNA o bien shRNA ms cortos. La fuente ms
comn es la sntesis qumica del dsRNA.
Si lo que se desea es utilizar shRNA o microRNA, entonces hay que seguir otra estrategia. Primero hay que fabricar un fragmento
de DNA a partir del cual se pueda sintetizar el
shRNA o miRNA. Regularmente se disea para
que se produzca una molcula de RNA que
adoptar la estructura de tipo tallo-asa. Para
poder introducirlo en la clula y que pueda producirse a partir de la maquinaria celular, se requiere de un vector. Regularmente este vector
ser un plsmido diseado para este propsito.
Una de las ventajas de esta estrategia es que se
pueden seleccionar las clulas en las que este
vector se integre al genoma de la clula; en este
caso todas las clulas hijas tendrn integrado el
vector y, por lo tanto, toda la poblacin estar
permanentemente silenciada.
Otro elemento importante a considerar es
el mecanismo para introducir el siRNA o el vector. Aqu tambin hay diferencias fundamentales entre organismos. Por ejemplo, en insectos
es posible simplemente sumergir al organismo
en una solucin con el dsRNA y ste penetrar

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en la clula, ya que en los insectos existen trasportadores de dsRNA (molculas que permiten
tomar el dsRNA del medio extracelular e introducirlos a la clula). En el caso del nematodo C.
elegans se puede alimentar al gusano con bacterias que produzcan el dsRNA. Otra estrategia
es la de microinyectar a la clula, sin embargo
esta tcnica es muy especializada (requiere de
utilizar una aguja extremadamente delgada
para inyectar el dsRNA al citoplasma celular).
En los vertebrados la tcnica ms comnmente utilizada es la de transfectar las clulas. La
transfeccin consiste en introducir material gentico al interior de una clula. La forma ms
comnmente utilizada de transfeccin es la lipofeccin (transfectar utilizando lpidos). En el
mercado existen una gran cantidad de lpidos
que pueden utilizarse para introducir RNA o
DNA. Una alternativa a la lipofeccin es el uso
de vectores de origen viral que permitan introducir el shRNA a la clula blanco.
Tal y como podemos utilizar un plsmido
como vector para la expresin del shRNA o el
microRNA, tambin se puede utilizar un virus. A
diferencia de la transfeccin, con un vector viral
es posible alcanzar eficiencias del 100% (infectar todas las clulas). Se han desarrollado varios vectores virales, en particular derivados de
adenovirus, retrovirus y lentivirus. Una segunda
ventaja de los vectores virales es que pueden
ser utilizados en organismos completos, lo cual
es indispensable cuando se piensa en el potencial teraputico de la interferencia de RNA.

Genes en silencio: prctica

experimental, una promesa
para la medicina del futuro
Son mltiples las investigaciones en las que se
utiliza la interferencia de RNA para establecer
la funcin de un gen en particular. La otra gran
aplicacin est en el rea de la medicina. En
general, cualquier patgeno utiliza la maquinaria celular para replicarse; sin embargo, los
elementos importantes para cada patgeno
pueden ser particulares. Un enfoque interesante consiste en eliminar de la clula los elemen-

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tos que son esenciales para el patgeno, ya sea

virus, bacteria o parsito.
Otra aplicacin es anular la funcin de protenas que estn involucradas en enfermedades
humanas. En particular, el cncer es uno de los
padecimientos que podra llegar a ser tratado
con interferencia de RNA. El principio del tratamiento se basa en el hecho de que las clulas
cancerosas crecen constantemente; los productos de los genes que se requieren para este
crecimiento podran ser anulados con RNAi y as
evitar el crecimiento de las clulas cancerosas.
Otro enfoque en la bsqueda de alternativas teraputicas es el de interferir la expresin
de genes de patgenos. En el caso de los virus, la
lista de ejemplos en los que se ha utilizado la interferencia es amplia y crece continuamente. Se
ha demostrado que es posible reducir la replicacin de muchos de estos virus en la clula utilizando siRNA dirigidos contra el genoma viral.
El uso de la interferencia de RNA para combatir el cncer o la infeccin de virus como el de
la inmunodeficiencia humana (VIH) o el de la
hepatitis C (VHC) depender de dos elementos.
El primero es elegir los blancos adecuados, y el
segundo el direccionamiento e introduccin
del mediador de la interferencia (siRNA, shRNA
o microRNA) a las clulas blanco adecuadas.

efectos que tiene la infeccin de rotavirus es la

destruccin de los enterocitos. Se ha sugerido
que, al menos en parte, es por la destruccin
de estas clulas que se produce la diarrea. No
existen medicamentos para inhibir especficamente la replicacin de rotavirus, por lo cual
el tratamiento mdico para los nios que han
sido infectados y que presentan diarrea est
ms enfocado a evitar la deshidratacin.
Los rotavirus se definen por una serie de
caractersticas estructurales. Como primer particularidad son virus no envueltos (no tienen
membrana lipdica rodeando a la partcula viral).
Segundo, su genoma est compuesto por once
molculas independientes de RNA de doble cadena, cada una de las cuales representa un gen
y codifica para una protena (a cada una de estas
molcula le llamamos segmento o gen). Tercero,
la partcula est formada por tres capas concntricas de protenas. La capa ms interna se llama
core (ncleo) y est formada principalmente por
la protena VP2. La capa intermedia est formada por la protena VP6. La capa ms externa est
formada por dos protenas, VP7 y VP4. A la partcula completa con las tres capas se le conoce
como TLP (triple-layered particle).

Silenciar el ciclo replicativo de rotavirus

Rotavirus: un problema de salud global
Los rotavirus son la causa ms importante de
gastroenteritis severas en infantes. Generalmente la enfermedad desaparece en el transcurso de unos cuantos das. Sin embargo, dado
lo intenso de la deshidratacin producida por
las evacuaciones y el vmito, los nios pueden
llegar a morir. En el mundo se calculan 600 000
muertes de infantes al ao ocasionadas por estos virus.
Los virus infectan unas clulas muy especializadas localizadas en las puntas de las
vellosidades del intestino delgado, llamadas
enterocitos maduros. Estos enterocitos son las
clulas encargadas de absorber los nutrientes
que se encuentran en los alimentos que han
pasado por nuestro tracto digestivo. Uno de los

Biotecnologia V14 CS3.indd 115

Las primeras interacciones del virus con la clula

hospedera involucran a las dos protenas de superficie del virus, VP4 y VP7, as como al menos 5
molculas celulares (receptores y co-receptores)
diferentes, que estn presentes en la superficie
de la membrana plasmtica de la clula. Como
resultado de estas varias interacciones, la partcula viral entra a la clula a travs de un mecanismo complejo, no bien caracterizado.
Durante el proceso de ingreso del virus a la
clula, ste pierde la capa ms externa de protenas, generndose partculas conocidas como
DLP (double-layered particles). Las DLP dirigen la
sntesis de los mRNA del virus. Estos mRNA son
utilizados por la clula para producir las protenas del virus y tambin son la fuente a partir de
la cual se produce el genoma para la descendencia del virus. Tanto las protenas virales como el

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116 | RNA de interferencia: el silencio de los genes

RNA se acumulan en estructuras llamadas viroplasmas. El viroplasma es el lugar en donde se arman los virus, hasta generar DLP. La ltima capa
del virus se adquiere en el retculo endoplsmico,
cuando la DLP gema hacia el interior del retculo,
y durante este proceso de maduracin adquiere
las protenas VP4 y VP7, para convertirse as en
una TLP. Finalmente, el virus destruye la clula,
permitiendo que las nuevas TLP sean liberadas
al medio extracelular en busca de una nueva clula para infectar y repetir el ciclo.
En el proceso de replicacin e induccin
de la muerte celular, es muy importante un
conjunto de protenas del virus que no estn
presentes en la partcula pero s en la clula infectada. Este tipo de protenas se conocen como
protenas no estructurales. En el caso de rotavirus
hay seis de estas protenas, denominadas NSP1 a
NSP6. Cada una de estas protenas se produce
a partir de un segmento de RNA diferente (con
excepcin de NSP5 y NSP6 que se producen a
partir del mismo segmento). Entender el papel
de cada una de estas protenas puede brindar
nuevas oportunidades para buscar medicamentos que bloqueen la replicacin del virus.
Uno de los enfoques que ms se utiliza en la
investigacin con virus para determinar la funcin de sus protenas, es el que llamamos gentica reversa. Este enfoque se basa en generar
mutaciones especficas en alguna parte de la
informacin gentica del virus. Posteriormente
se reintroduce el gen modificado a partculas
virales y se evala el efecto de las mutaciones
introducidas sobre la capacidad del virus para
replicarse. Sin embargo, este enfoque no haba
podido utilizarse en el caso de los rotavirus,
donde es muy difcil conseguir que las mutaciones que se generan en su informacin gentica puedan ser incorporadas en el virus (slo
hasta hace muy poco tiempo se ha reportado
un mtodo para lograrlo, pero que funciona de
manera muy ineficiente).
Dada la dificultad para realizar gentica
reversa en rotavirus, en nuestro grupo hemos
enfocado la atencin en la interferencia de
RNA, la cual es una estrategia con tremendo
potencial para estudiar la funcin de protenas

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a travs de generar la prdida de su funcin.

Nuestro grupo fue el primero en demostrar
que la interferencia de RNA es aplicable para
anular la expresin de genes de rotavirus. Gracias a esta nueva herramienta, hemos podido
descubrir y confirmar mltiples actividades de
las protenas de este virus. La caracterizacin
de la funcin de la protena VP4 fue la primera
que abordamos utilizando la interferencia. Observamos que al interferir la expresin del gen
de VP4, las partculas fueron capaces de madura hasta el ltimo paso, esto es, el de perder la
envoltura de lpidos, adquiriendo la tercer capa
de protenas, aunque en este caso, al no expresarse VP4, slo se ensambl VP7. Por otro lado,
la inhibicin de la sntesis de VP7 por interferencia result en la acumulacin de partculas
envueltas con lpidos en el interior del retculo
endoplsmico, sugiriendo que VP7 es la responsable de la prdida de esta envoltura durante el
proceso de morfognesis del virus.

Una visin global de la biologa

de rotavirus utilizando
interferencia de RNA
Al conjunto de genes de un organismo le llamamos genoma, y genmica a la ciencia que estudia los genomas de los diferentes organismos.
Es una ciencia reciente con variedad de enfoques para estudiar cmo, dnde y cundo se
expresa la informacin del genoma, cmo interaccionan los productos de la informacin gentica entre ellos y en qu procesos biolgicos
estn involucrados. La disponibilidad de la informacin gentica en muchos organismos ha
permitido el desarrollo de herramientas genmicas que permiten el manejo de grandes cantidades de datos para el estudio de los sistemas
celulares. Actualmente, la utilizacin de este
tipo de estrategias en el estudio de la biologa
de sistemas se ha utilizado para indagar fenmenos biolgicos en varios organismos, como
levaduras, gusanos, moscas y mamferos.
Dentro de las preguntas que pretende contestar la genmica, una de las que ms interesa es la de la funcin de los genes. Cuando

11/14/07 5:00:29 PM

RNA de interferencia: el silencio de los genes | 117

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Figura 2.
Diseo experimental. 1) Empaquetamiento del plsmido
miR30 en partculas retrovirales utilizando clulas HEK293.
2) Transduccin de clulas MA104, modelo de clula hospedera, con los retrovirus recombinantes. 3) Infeccin con
rotavirus de las clulas transformadas. 4) Seleccin de clulas resistentes a la infeccin por rotavirus.

Biotecnologia V14 CS3.indd 117

11/14/07 5:00:30 PM

118 | RNA de interferencia: el silencio de los genes

Categora funcional

Genes totales

Cinasas
741
Fosfatasas
69
Ciclo celular
483
Seal de transduccin
2200
GPCR
544
Apoptosis
503
Metabolismo de ADN
252
Protelisis
249
Factores transcripcionales
616
Proteasas
360
Tomado de Paddison et al., en Nature 428:427, 2006.

se utilizan enfoques genmicos para estudiar

la funcin de los genes, decimos que se est
haciendo genmica funcional. La gran eficiencia y especificidad que tiene la interferencia de
RNA para anular la expresin de los genes, ha
desembocado en el desarrollo de procedimientos que permitan la aplicacin de esta tcnica
a gran escala; es decir, se puede interferir la
expresin de genomas completos. Por ello, la
principal estrategia para hacer genmica funcional es justamente la interferencia de RNA.
El primer paso para poder interferir un genoma es tener la secuencia de ese genoma. Posteriormente se requiere de tener los mediadores
de la interferencia para cada uno de los genes
del genoma (estos mediadores sern siRNA,
shRNA o microRNA). Al conjunto de estos mediadores de interferencia le denominamos bibliotecas. As, por ejemplo, podemos tener una
biblioteca de siRNA para anular la expresin de
cada uno de los genes del genoma de algn organismo. Finalmente, requerimos de un ensayo
que nos permita preguntar por una funcin en
particular. Los criterios para el diseo y la sntesis de estas bibliotecas son los mismos que
describimos en secciones anteriores, y lo mismo aplica en cuanto a la seleccin del tipo de
mediador de interferencia a elegir.
Cuando se utilizan bibliotecas de siRNA,
es muy importante ensayar el efecto de cada
siRNA por separado, ya que la inhibicin es
transitoria. Las bibliotecas se pueden construir
tambin con plsmidos que expresen shRNA o
microRNA. Una de las ventajas de usar este tipo
de bibliotecas es que los plsmidos pueden integrarse al genoma de la clula de manera permanente, por lo cual se puede usar la biblioteca

Biotecnologia V14 CS3.indd 118

Diseos totales

3 shRNA

1-2 shRNA

4088
227
1716
7147
1681
1644
839
709
1604
958

675
59
363
1470
360
333
189
172
329
201

66
10
120
730
184
170
63
77
287
159

con los elementos (shRNA) mezclados, y posteriormente, a travs de un mtodo de seleccin

positivo, obtener las clulas con el fenotipo deseado. Mltiples investigaciones han demostrado que las secuencias de este tipo pueden
ser usadas para estudios genticos a gran escala en mamferos y son una fuente viable para el
anlisis y descubrimiento de nuevas funciones
de genes.
In vitro, los virus inducen alteraciones estructurales y funcionales en la clula hospedera; sin embargo, poco se sabe de los mecanismos moleculares de la respuesta celular a una
infeccin viral. Un estudio sobre la variacin
en los niveles de expresin de genes celulares
subsecuente a la infeccin por rotavirus, result en la identificacin de 508 genes diferencialmente regulados; este anlisis global describe
un nuevo escenario en la respuesta celular a la
infeccin por estos virus. Con el fin de identificar y caracterizar la funcin de genes celulares
que participan en la infeccin por rotavirus, en
nuestro laboratorio estamos utilizando una biblioteca de microRNA (miR-30) (figura 2) que
contiene aproximadamente 231 000 secuencias verificadas contra 35 000 genes humanos.
sta se encuentra clonada en el vector viral
pMSCV y fue suministrada por el Dr. Stephen
J. Elledge, del Departamento de Gentica de la
Escuela de Medicina en Harvard. En la siguiente
tabla se presentan algunos de los genes representados en la biblioteca miR-30.
Con ayuda de esta biblioteca, podremos silenciar en ensayos individuales cada una de las
protenas celulares y descifrar cual de ellas participa en la replicacin y proliferacin del virus
en la clula hospedera.

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