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Validacion 2 Pruebas de Sensibilidad A Los Antimicrobianos
Validacion 2 Pruebas de Sensibilidad A Los Antimicrobianos
Difusin en agar
- Inoculacin
- Incubacin
64 32 16
64 32 16
CIM = 16 g/mL
relacin inversa con la CIM. La principal ventaja de la difusin con disco es el bajo costo unido
a la simplicidad de la tcnica y esto incluye desde la realizacin, la lectura y en la mayora de
las ocasiones, la interpretacin.
incubacin
Discos conteniendo
antifngicos
Halos de inhibicin
Estndares de Referencia
El Instituto de Estndares Clnicos de Laboratorio, CLSI (Clinical Laboratory Standards
Institute), desarroll Estndares de Referencia que describen detalladamente los parmetros
experimentales para la correcta realizacin de ambos mtodos para lograr, de esta forma, una
mayor exactitud y reproducibilidad de los resultados.
Documento M27-A3: Mtodo de referencia para determinar la sensibilidad de las
levaduras a los antifngicos a travs del mtodo de dilucin en caldo.
Introduccin
El mtodo que describe este estndar est pensado para evaluar levaduras que causan
infecciones invasoras: todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Este
mtodo no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimrficos como
Histoplasma capsulatum. Para algunos hongos filamentosos se puede utilizar el mtodo de
dilucin cuyas directrices se encuentran descriptas en el documento M38-A.
Medio de cultivo
El medio recomendado es completamente sinttico: RPMI con glutamina, sin bicarbonato
y rojo fenol como indicador de pH.
Preparacin del inculo
1. Subcultivar todos los microorganismos en agar Sabouraud a 35C durante 24 horas
para Candida spp. y 48 horas para Cryptococcus neoformans. Hay que asegurarse de
su absoluta pureza y que los aislamientos no estn contaminados.
Intervalo (g/ml)
16 - 0,03
64 - 0,12
16 - 0,03
64 - 0,12
16 - 0,03
16 - 0,03
16 - 0,03
16 - 0,03
16 - 0,03
16 - 0,03
10
11
12
H
64
32
16
0,5
0,25
0,12
16
0,5
0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
10
0,06
0,03
11
12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
Incubacin
Candida spp. se debe de incubar, sin agitacin, en atmsfera normal, a 35C durante 24-48
horas y Cryptococcus neoformans, en las mismas condiciones durante 70-74 horas. Tras este
periodo de incubacin se procede a leer los resultados.
La CIM para la anfotericina B, se define como la concentracin ms baja que tiene una
puntuacin de 0 (pticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las equinocandinas
es la concentracin ms baja que tiene una puntuacin de 2 (disminucin prominente de la
turbidez).
Para aquellos aislamientos que producen grumos en el fondo, la dispersin de los mismos
pipeteando o agitando puede ayudar a la interpretacin de los resultados.
Antifngico
Anfotericina B
Fluconazol
Itraconazol
5-fluorocitosina
Voriconazol
Equinocandinas
Sensible
1
8
0,125
4
1
2
Sensible
dependiente de
la dosis
----16-32
0,25-0,5
----2
-----
Intermedio
Resistente
------------8-16
---------
>1
64
1
32
4
-----
Control de calidad
Los objetivos del programa de control de calidad son evaluar:
1. la precisin y exactitud del procedimiento de ensayo.
2. si los reactivos, las condiciones del ensayo y las instrucciones utilizadas en el
procedimiento fueron adecuadas.
3. el personal que realiza las tcnicas y lee los resultados.
Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su
estabilidad gentica y por su utilidad para controlar el mtodo que se est ensayando. Las
cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre que se
ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei 6258, los resultados
obtenidos deben estar dentro del rango recomendado
Microorganismo
Antifngico
Anfotericina B
Anidulafungina
Caspofungina
5-fluorocitosina
Fluconazol
Itraconazol
Ketoconazol
Posaconazol
Ravuconazol
Voriconazol
Anfotericina B
Anidulafungina
Caspofungina
5-fluorocitosina
Fluconazol
Itraconazol
Ketoconazol
Posaconazol
Ravuconazol
Rango CIM
0,25 2
0,25 2
0,25 1
0,06 - 0,25
0,5 4
0,125 - 0,5
0,03 - 0,25
0,06 - 0,25
0,016 - 0,12
0.016 - 0.12
0,5 2
0.03 - 0.12
0.12 1
4 16
8 64
0,12 1
0,12 - 1
0,06 - 0,5
0,06 - 0,5
Medio de cultivo
Es muy importante la eleccin del medio de cultivo ya que su composicin influye en el
tamao de la zona de inhibicin, en la actividad del antimicrobiano, en la velocidad de difusin
del antimicrobiano y en la velocidad de crecimiento del microorganismo. Debido a esto, se
acord que el medio de cultivo debe reunir las siguientes caractersticas:
1. La receta del medio debe especificar la composicin de productos
2. El medio debe permitir el crecimiento de la mayora de los patgenos.
3. El medio debe estar tamponado de forma que no se produzca un cambio
significativo en su pH cuando los microorganismos crezcan.
4. El medio no debe ser antagonista de ninguno de los antimicrobianos ensayados.
5. El medio debe ser isotnico con la sangre, de forma que se pueda aadir sangre
completa para permitir el crecimiento de microorganismos fastidiosos.
6. El medio debe producir resultados satisfactorios en los ensayos de sensibilidad con
las cepas de control de calidad.
7. El medio debe ser reproducible, es decir el uso de diferentes lotes debe producir
resultados similares.
Para los antibacterianos el medio recomendado es agar Mueller-Hinton, mientras que
para los antifngicos, se recomienda el uso de Agar Mueller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 g/ml
Azul de Metileno.
Las placas de Petri deben de tener una profundidad de 4 mm (1) . Para lograr esa
profundidad, si la placa es de 9 cm de dimetro se necesitan 25 ml de medio y si es de 15 cm,
60 ml. Es necesario secar la superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media
hora, en la estufa de 37C boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la
humedad se evapore.
Antifngicos
Los antifngicos pueden colocarse en distintos reservorios: pocillos en el agar, cilindros que
contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparicin del disco de papel de filtro
impregnado de antimicrobiano revolucion esta tcnica y en la actualidad es el reservorio de
eleccin para las pruebas de susceptibilidad. Las tabletas son tambin un mtodo muy utilizado
que se encuentra disponible comercialmente.
Interpretacin de resultados
Con el mtodo de difusin no se puede determinar una CIM ya que nicamente se mide el
dimetro del halo de inhibicin. Por tanto, se establecieron las siguientes categoras:
1. Sensible
2. Intermedio/ Sensible dependiente de dosis
3. Moderadamente sensible
4. Resistente
Estas categoras estn basadas en los puntos de corte que se establecieron mediante el
mtodo de dilucin en caldo, las concentraciones sricas que el antibitico alcanza en suero y
la distribucin de las CIMs para la especie estudiada.
Antifngico
Fluconazol
Anfotericina B
Itraconazol
Ketoconazol
Voriconazol
Concentracin
25 g
10 g
8 g
15 g
1 g
CIM (g/ml)
R*
S-DD*
64
16-32
4
2
1
0,25-0,50
0,5
0,25
4
2
S*
8
0,12
0,12
1
Candida albicans
ATCC 90028
28-39 mm
18-23 mm
21-30 mm
31-42 mm
31-42 mm
Candida parapsilosis
ATCC 22019
22-33 mm
20-26 mm
19-26 mm
26-35 mm
28-37 mm
17-23 mm
16-22 mm
22-29 mm
16-25 mm
Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para estos
antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio.
Problemas
Problema 1
Se determin la sensibilidad antifngica, por el mtodo de difusin en agar, de dos cepas
de Candida causantes de Candidiasis orofaringea aisladas de pacientes HIV positivo.
a)
Determine cules fueron los dimetros de los halos de inhibicin para los distintos
microorganismos frente a los antifngicos estudiados. Complete el cuadro.
Anfotericina
Fluconazol
Itraconazol
Halo
Halo
Halo
Interpret.
Interpret.
Cepa 1
22 mm
20 mm
18 mm
Cepa 2
20 mm
10 mm
8 mm
Cepa 3
24 mm
12 mm
17 mm
22 mm
15 mm
18 mm
20 mm
b)
Interpret.
20 mm
De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede afirmar
que el mtodo fue realizado de forma correcta?
c)
d)
En pacientes infectados con HIV la infeccin oral causada por C. albicans es un cuadro
recidivante que suele precisar tratamientos con azoles de larga duracin o de numerosos
ciclos para conseguir su remisin. El crecimiento de la poblacin con SIDA multitratada
con azoles ha dado lugar a un aumento notable de las descripciones de casos de
candidosis oral o esofgica que no responden al tratamiento con fluconazol. Qu
importancia tiene la determinacin de susceptibilidad antifngica en estos casos?
Problema 2
a)
b)
c)
Fluconazol
1
Itraconazol
3
10
11
12
H
64
32
16
0,5
0,25 0,12
16
0,5
Control de crecimiento
0,25 0,12
10
11
12
0,06 0,03
Control de crecimiento
Control de esterilidad
Control de esterilidad
Fluconazol
CIM
Itraconazol
Interpretacin
CIM
Interpretacin
Cepa 1
Cepa 2
Candida parapsilosis ATCC 22019
Candida krusei ATCC 6258
d)
Algunos autores consideran que se est produciendo un cambio en los agentes etiolgicos
de Candidiasis vaginales siendo cada vez es ms frecuente la implicacin de especies
menos sensibles a los azoles o que desarrollan fcilmente resistencia. Se piensa que
puede existir una relacin entre resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C.
albicans procedentes de mujeres inmunocompetentes, tratadas con fluconazol y la
recidivas de las vaginitis fngicas. Qu importancia tiene la determinacin de la
susceptibilidad antifngica en estos casos? A qu puede atribuir los resultados obtenidos
para la cepa 2? Qu antifngico utilizara en cada caso?