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Practica1crecimientolevaduras 120319142451 Phpapp02
Practica1crecimientolevaduras 120319142451 Phpapp02
MATERIAL.
Medio de extracto de malta
Glucosa
Agua destilada
Levadura seca
Solucin de azul de metileno 0.01%
Solucin de DNS
METODOLOGIA.
Medio de cultivo.
1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta
2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta
3.- Preparacin del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g de
glucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada.
4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada
4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor.
Suspensin de levadura.
1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo de
ensaye, mezclar hasta obtener una suspensin uniforme.
2.- Realizar conteo en cmara de Neubauer
3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el nmero de clulas por mL.
Incubacin.
1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete
como fermentacin y coloque en una incubadora a 30C.
2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete como
respiracin y coloque en una agitadora a 30C y 200 rpm.
3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz y
gurdelos en refrigeracin.
4.- Determine el nmero de levaduras para cada muestra.
5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra.
Conteo de levaduras.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en el hematocitmetro y
realice el conteo al microscopio. En el apndice 1 encontrar informacin acerca del uso
del hematocitmetro o de la cmara de Neubauer.
1. Verifique que el microscopio est alineado, y en su caso haga la correccin necesaria.
2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz.
3. Realice el clculo del nmero de clulas/mL.
Determinacin de glucosa.
La determinacin de glucosa se realiza utilizando el mtodo del DNS (apndice 2).
1) Diluir la muestra, calculando que la concentracin de glucosa se encuentre en el rango
de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin.
2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso
3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar
4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.
7) Interpolar lectura en la curva patrn para determinar la concentracin de glucosa.
CUESTIONARIO
1.- Cul es el papel del azul de metileno en la tincin de levaduras?
2.- Qu es fermentacin desde el punto de vista bioqumico?
3.- Cuntas y cules son formas de reproduccin tiene Saccharomyces cerevisiae?
4.- Explique cmo se coloca la muestra para el conteo en la cmara de Neubauer
5.- Qu es respiracin celular?
6.- Dnde se obtiene mayor biomasa, en la respiracin o en la fermentacin? Explique
por qu
7.- La tcnica del DNS es til para cuantificar sacarosa, por qu
8.- Qu es la gluclisis?
9.- Qu es el catabolismo?
10.- Durante los experimentos que desarroll, Saccharomyces cerevisiae realiz
anabolismo, explique.
REPORTE.
Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la prctica, objetivo, introduccin
breve, metodologa, resultados, discusin, conclusin, bibliografa. Como gua puede
utilizar el formato de cualquier artculo cientfico.
Despus de contar las clulas se procede a calcular el nmero de clulas por unidad de
volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido en
el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara
y la laminilla de cuarzo. La cmara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y su
profundidad es de 0.1 mm.
Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las clulas u
otras partculas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Para
clulas pequeas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm2 y el cuadro del centro.
Por ejemplo, si se cuentan 187 clulas en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tiene
un rea de 1/25 mm2, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de
(0.04x0.1 = 0.004) 0.004 mm3. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de
0.02 mm3. Por lo tanto, se tienen 187 clulas en 0.02 mm3, que equivale a 9350
clulas/mm3. Hay 1000 mm3 en 1 cm3, por lo que la cuenta es de 9 350 000 cluals/mL.
Para fines prcticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente:
Clulas/mL = Total de clulas contadas * 50000
Para determinar el nmero de clulas en la muestra original hay que multiplicar
por la dilucin.
METODOLOGIA.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en la cmara de Neubauer
y realice el conteo al microscopio.
MATERIALES.
DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico)
Fenol
Sulfito de sdio
Hidrxido de sodio
Agua destilada
2 Vasos de precipitado de 600 mL
1 Matraz aforado de 100 mL
1 Matraz aforado de 1 L
Tubos de ensaye
Espectrofotmetro
Pipetas volumtricas de 1 mL
Pipeta volumtrica de 2 mL
Pipeta volumtrica de 5 mL
PROCEDIMIENTO.
Preparacin de la solucin de DNS.
1) Pesar 1 g de hidrxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matraz
Erlenmeyer con agitacin. CUIDADO EL HIDRXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL.
2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solucin de hidrxido de sodio con
agitacin, para lograr una disolucin rpida y completa.
3) Esperar a que la solucin se enfri a temperatura ambiente
4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solucin anterior con agitacin.
5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solucin anterior con agitacin.
6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a un
matraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solucin.
Concentracin Glucosa
(mg/mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
mL de
Solucin
Estndar
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
mL de
agua
destilada
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0