UNIDAD 3

INTERACCIONES ANTGENO - ANTICUERPO (Ag-Ac).

GENERALIDADES:


Los anticuerpos por medio de sus sitios de unin o paratopos, se unen
entre una multitud de determinantes antignicos o eptopos a aquellos que
le son complementarios, en una reaccin denominada antgeno-anticuerpo,
este fenmeno se puede dar tanto in vivo como in vitro.

Como consecuencia de la reaccin antgeno-anticuerpo, las molculas del
antgeno pierden su carcter txico o bien los microorganismos con
molculas antignicas son destruidos o son ms fcilmente fagocitados.

A la regin del antgeno reconocida por un anticuerpo se le denomina
eptopo o determinante antignico. Un antgeno puede presentar un nmero
variable de eptopos de estructura nica o repetitiva. La complejidad
estructural de las protenas favorece que stas presenten por lo general un
nmero elevado de eptopos distintos, mientras que los cidos nucleicos y
los polisacridos, dada su repetitividad estructural, poseen un nmero
escaso de eptopos diferentes. El nmero de eptopos presentes en los
antgenos determina la valencia del Ag. Generalmente una molcula de Ag
tiene varios eptopos por lo que es multivalente.

En el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tienen solo 2
paratopos (bivalentes), la IgM cuenta con diez paratopos (decavalente) y la
IgAs secretoria cuenta con 4 paratopos tetravalente).



Existen diferentes tipos de reaccin antgeno-anticuerpo:

Como resultado de la reaccin se pueden observar diferentes fenmenos lo
que permite clasificar las reacciones antgeno-anticuerpo en:

Reaccin de precipitacin; cuando los antgenos son
macromolculas solubles con varios epitopos multivalentes, los
anticuerpos por lo menos bivalentes, al unirse a ellos, forman complejos
tridimensionales insolubles que precipitan.








Reaccin de aglutinacin; se produce al reaccionar los
anticuerpos con molculas de antgenos cuyos eptopos situados en la
superficie de bacterias o de otras clulas, dan como resultado que las
clulas formen agregados que sedimentan con facilidad. A estos antgenos
se les denomina aglutingenos, tambin llamados antgenos formes o
particulados y a los anticuerpos aglutinas.

Reaccin de neutralizacin; van dirigidas a la deteccin de
anticuerpos capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno, se
efecta principalmente en los virus y consiste en la disminucin de la
capacidad infectante del virus cuando se unen los anticuerpos con los
determinantes antignicos de la cpsula vrica, tambin de toxinas.

Reaccin de opsonizacin; los microorganismos y partculas
antignicas se fagocitan ms vidamente si existen anticuerpos en su
superficie. La unin de los anticuerpos produce un aumento de la
adherencia del complejo antgeno-anticuerpo a la superficie de los fagocitos
para su fagocitosis. Los microorganismos recubiertos de anticuerpos estn
opsonizados.

Reacciones de citlisis con fijacin de complemento; se basa
en la capacidad del complemento para unirse a los complejos antgeno-
anticuerpo que estn en la superficie de clulas o bacterias, dando como
resultado la lisis de estas.

Reacciones de floculacin.

Reacciones con reactivos marcados

Caractersticas de la reaccin antgeno-anticuerpo:

Especificidad
Capacidad del anticuerpo de unirse al antgeno (a su eptopo) que lo
estimul. La unin dada por la especificidad es muy precisa y permite
distinguir entre grupos qumicos con diferencias mnimas a pesar de su
similitud.
Rapidez
La velocidad con que ocurre la primera etapa de la reaccin Ag-Ac es del
orden de milsimas de segundo, y est limitada nicamente por la difusin.
La segunda etapa, que es ms larga, incluye todas las manifestaciones que
se presentan como consecuencia de la interaccin, tales como precipitacin,
aglutinacin, neutralizacin, etc.








Espontanea
La reaccin Ag-Ac no requiere energa adicional para efectuarse.

Reversibilidad
Dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en
consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la
proporcin de Ag-Ac, el pH y la fuerza inica.


Requisitos para que la reaccin antgeno-anticuerpo se produzca:

En la interaccin in vitro de un antgeno con un anticuerpo se distinguen
dos etapas:

1.La reaccin primaria, no observable que depende de la adecuada
complementariedad de encaje, podrn unirse a los anticuerpos solo aquellos
antgenos con epitopos que se ajusten al sitio de combinacin o paratopo
del anticuerpo.

La distancia entre Ag y Ac es muy pequea en el punto de unin, lo que
incrementa la fuerza de esa unin. Eptopo y paratopo han de tener
estructuras complementarias que encajan entre s. Una vez que se forma el
complejo antgeno-anticuerpo, las fuerzas que lo mantienen unido
interacciones no covalentes, son interacciones interatmicas dbiles que
mantienen al antgeno y al anticuerpo en un contacto muy cercano, capaz de
desarrollar fuerzas que estabilizan la unin del complejo y entre ellas estn:
puentes de hidrgeno, electrostticas dbiles (no inicas), de van der Waals
e hidrofbicas, lo que hace posible disociar un complejo ya formado.

La asociacin y disociacin del complejo antgeno-anticuerpo se rige por la
ley de accin de masas:

K1
Ag +Ab AgAb

K2

K = k1/k2 = AgAb
___________
Ab Ag









Donde:
Ag = antgeno
Ab = anticuerpo
K1 = constante de asociacin
K2 = constante de disociacin
K = constante de equilibrio o afinidad intrnseca de la reaccin y refleja la
fuerza de unin entre el antgeno y el anticuerpo.

Mientras mayor sea K la velocidad de asociacin de la reaccin ser mayor,
es decir, sern mayores las cantidades que se formarn del complejo
antgeno-anticuerpo y la velocidad de disociacin ser ms lenta.

La constante de equilibrio K en la reaccin se afecta por las concentraciones
de antgeno y anticuerpo, y por condiciones fisicoqumicas tales como pH,
temperatura, fuerza inica y tiempo de incubacin. La alteracin de estas
ltimas condiciones puede producir aumento o disminucin de la
sensibilidad de esta reaccin.

AFINIDAD:

La afinidad de un anticuerpo (Ac) concreto (p. ej., cuando usamos un
anticuerpo monoclonal) por un epitopo (H) es la suma de todas las fuerzas
atractivas y repulsivas entre un paratopo del anticuerpo y el correspondiente
epitopo. Por lo tanto es la fuerza de reaccin entre un solo determinante
antignico y un solo sitio de reconocimiento de un anticuerpo.



AVIDEZ: El total de fuerzas de unin entre un Ag y un anticuerpo. Dicho de
otra forma es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag
multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de
los determinantes individuales de ese Ag, su valor es mucho mayor que la
suma de afinidades.
Cintica de la reaccin Ag-Ac Durante la maduracin de la respuesta
humoral de produccin de Ac se produce no slo una seleccin de Ac con
mayor afinidad (seleccin termodinmica), sino con mayor rapidez
(seleccin cintica).

Esta primera etapa de la reaccin antgeno anticuerpo denominada:
Reconocimiento y recombinacin de Ag y Ac , en ella los Ag y Ac se unen
rpidamente (casi instantneamente) formando complejos primarios, que
an siguen siendo solubles. Dentro de ciertos lmites, casi no se ve







influenciada por factores tales como la temperatura, pH, fuerza inica y la
concentracin de los reactantes.


2.La reaccin secundaria, caracterizada por la agregacin de los complejos
no visibles formando puentes entre ellos para crear una estructura de
enrejado que da lugar a fenmenos visibles cuyas caractersticas dependen
en gran parte de las caractersticas fsicas del antgeno, pero tambin de la
clase de inmunoglobulina que participa en la reaccin y de la concentracin
de Ag y Ac.

Esta segunda etapa de la reaccin antgeno anticuerpo se denominada:
AGREGACIN, los complejos primarios se van agregando, aumenta el
peso molecular y entonces se observara el resultado dependiendo si el
antgeno es soluble o partculado como precipitacin o aglutinacin,
formndose un enrejado tipo cristal en donde cada molcula de Ag y Ac
ocupa un lugar determinado. Esta 2 etapa es mas tardada puede durar de
minutos a horas y es muy dependiente de la temperatura, pH, fuerza inica y
concentracin de Ag y Ac.

Puede ocurrir solo la fase 1 y no la 2, debido a variaciones cuantitativas. La
etapa 2 solo se presenta cuando la concentracin de Ag y Ac son
equivalentes.



In vivo la reaccin Ag-Ac puede generar reacciones terciarias, como es el
caso de la necrosis en la reaccin de Arthus, los fenmenos vasgenos de la
anafilaxia por la liberacin de histamina, etc, los cuales son fenmenos
biolgicos colaterales.


FACTORES QUE AFECTAN Y MODIFICAN LA REACCION ANTIGENO
ANTICUERPO:


pH: De este factor depende el estado inico de grupos importantes que
participan en la interaccin, como son los radicales amino (-NH3) y carboxilo
(-COO). Aunque la reaccin Ag-Ac la podemos observar en un intervalo
amplio de pH, se considera que el ptimo est entre 6.8 a 8.6, en la prctica
las tcnicas de rutina deben trabajarse a un pH alrededor de 7,0.








Temperatura: acelera la reaccin debido a un incremento de la difusin y el
movimiento de las molculas. Se considera que esto es vlido hasta los
56C, ya que a mayor temperatura comienza a haber desnaturalizacin.
Los anticuerpos de la clase IgM son ms reactivos a bajas temperaturas (4-
27 C), mientras que los de la clase IgG lo son a 37 C. Por este motivo, las
tcnicas de deteccin de anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 22-
37 C 30-37 C.
Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de
37 C, no se consideran clnicamente significativos. Algunos anticuerpos de
la clase IgM pueden activar el complemento a temperaturas por debajo de 30
C. Los anticuerpos clnicamente significativos son aquellos que tienen
actividad in vivo que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 C.

Fuerza inica (): Corresponde a la concentracin de iones presentes en el
medio de reaccin (electrolitos) los cuales son necesarios. En una solucin
salina normal los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las molculas de
antgeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas opuestas. Este
recubrimiento dificulta la unin del anticuerpo con el antgeno y se reduce al
disminuir la fuerza inica del medio donde tiene lugar la reaccin, por lo
general cuando la concentracin salina del medio de reaccin disminuye, la
velocidad de captacin del anticuerpo aumenta. Se requieren bajas
(intervalo ptimo 0.01 0.1), a altas los grupos inicos son neutralizados y
por tanto se reduce la afinidad.

Tiempo de incubacin: los anticuerpos de los diversos grupos sanguneos
tienen diferentes tiempos para alcanzar el equilibrio, en esto interviene de
manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en que se une
con su antgeno especfico.
Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solucin salina han
demostrado que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan,
aproximadamente el 25 % lo hace en los primeros 15 minutos y el 75 %
restante lo hace durante la primera hora. La adicin de varios agentes
potenciadores, por ejemplo disminucin de la fuerza inica, puede aumentar
la cantidad de anticuerpos fijados durante los primeros 15 minutos, y con
esto disminuir el tiempo de incubacin necesario para alcanzar el equilibrio.

Concentracin de antgeno y anticuerpo: la velocidad de formacin del
complejo antgeno-anticuerpo vara con el nmero de molculas de
anticuerpo presentes en el medio y con el nmero de sitios antignicos
presentes en cada antgeno. La concentracin de Ag y Ac deben ser
equivalentes para que la reaccin pueda llevarse a cabo hasta la segunda
etapa.







Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENMENO DE
ZONA, donde el antgeno y el anticuerpo no estn en concentraciones
equivalentes, por lo tanto no se puede llegar a la agregacin de los
complejos primarios.

El efecto de la concentracin puede ser observado si se hacen reaccionar
cantidades variables del Ag con una concentracin constante de Ac y
graficando el producto formado, se aprecia que en la zona de equivalencia
todos los epitopos estn ocupados con todos los paratopos disponibles:


[Ac] = constante












Exceso de Ac concentracin Exceso de Ag
equivalente
Ag-Ab

PREZONA EQUIVALENCIA POSTZONA


Las zonas correspondientes a la pre-zona y post-zona no se encuentran en
concentraciones equivalentes, por lo tanto solo hay formacin de complejos
primarios no visibles y solo en la zona de equivalencia los antgenos y
anticuerpos estn en concentraciones equivalentes donde ya se agregaron
los complejos primarios para dar paso a la formacin del producto se puede
observar un precipitado o una aglutinacin.

CONSIDERACIONES PRCTICAS GENERALES.

Debe considerarse que la formacin de agregados es una consecuencia de
la bivalencia de los Ac y de la multivalencia de los Ag, por lo tanto, los Ag o
haptenos simples que slo tengan un determinante antignico NO dan
reacciones secundarias; as mismo, el Ag y el Ac deben estar en
[pp]
[Ag]








proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos lleva a la
solubilidad del agregado y la no formacin de los agregados.




REACCIONES DE PRECIPITACIN

Cuando se utiliza un antgeno en solucin, como lisados bacterianos,
toxinas, extractos de tejidos heterlogos, extractos vegetales, protenas
humanas o de otras especies, al estar en presencia de sus Ac especficos
forman complejos Ag-Ac que posteriormente se insolubilizan, dando como
resultado una reaccin de PRECIPITACIN. Esta propiedad tiene muchas
aplicaciones para la investigacin y valoracin de Ag y Ac


Ag soluble + Ac Ag - Ac (PRECIPITADO)



DEFINICIN:
Cuando se mezclan en cantidades adecuadas un Ag soluble con su Ac
correspondiente (principalmente de clase IgG) se forma un
inmunoprecipitado.



El efecto de no precipitacin producido por falta de concentraciones
equivalentes de antgeno o anticuerpo (fenmeno de zona) puede ser
disminuido o evitado haciendo diluciones seriadas del reactivo desconocido
(generalmente el Ag), o realizando la reaccin en el seno de un gel de agar
por difusin del Ag y/o el Ac.

Las reacciones de precipitacin pueden ser cualitativas, semicuantitativas o
cuantitativas y se pueden realizar en medio lquido y semislido.

Hay varias tcnicas para realizar este tipo de reacciones:
La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar
La formacin de capas estratificadas (tcnica del anillo de interfase o
Ascoli)
La difusin simple unidimensional en gel de agar (tcnica de Oudin)
La doble difusin unidimensional en agar (modificacin a la tcnica de
Oudin)







La difusin radial simple en agar (RID) (tcnica de Mancini, Carbonara y
Hermans)
La doble difusin radial en gel de agar (DDR) (tcnica de Ouchterlony)

Y las tcnicas que combinan difusin en geles de agar con procedimientos
electroforticos como:
La inmunoelectroforesis (IEF) (tcnica de Grabar y Williams)
La electroinmunodifusin (EID) (tcnica de Laurell).
La electroforesis bidimensional








PRCTICA No. 1
CURVA DE PRECIPITACIN CUANTITATIVA EN CAPILAR.


MARCO TERICO
La precipitacin en medio lquido se puede realizar en tubos de ensayo o
capilares, mezclando el Ag soluble con su Ac especfico y la cantidad de
precipitado formado vara segn la proporcin de los reactivos. Si se dispone una
serie de tubos conteniendo una cantidad constante de anticuerpo y cantidades
crecientes del Ag soluble, se puede observarse que al ir aumentando la cantidad
de ste el precipitado formado alcanza un mximo y posteriormente comienza a
disminuir aunque la cantidad de Ag aumente.
De manera semicuantitativa se puede estimar la cantidad de precipitado formado
expresndolo en milmetros lineales. Si los resultados se grafican, colocando en el
eje de las abscisas la cantidad de Ag agregado y en el de las ordenadas la
cantidad de precipitado (en mm), se obtiene una curva, generalmente en forma de
campana, que se puede dividir en tres zonas:
A. Zona de exceso de anticuerpo: Las molculas de Ag estn saturadas y no
hay agregacin, en esta zona el sobrenadante contiene Ac libre.
B. Zona de equivalencia: el precipitado es mximo, el sobrenadante no
contiene ni Ag ni Ac libres.
C. Zona de exceso de antgeno: Solo hay formacin de complejos primarios
pero no agregados por falta de Ac; el sobrenadante contiene Ag libre.


A. PREZONA (Exceso de Ac)

B. ZONA DE EQUIVALENCIA

C. POSTZONA (Exceso de Ag)


Un anlisis cuantitativo se puede realizar determinando el N proteico en el
precipitado cuando el Ag es un polisacrido. Si el antgeno es proteico pero tiene
un grupo qumico que sirve como marca, como el DNP-ASB (dinitrofenol-albmina
srica bovina) se puede determinar la cantidad de Ac en el precipitado por lectura
espectrofotomtrica a 360 nm para el Ag y a 280 nm para la cantidad total de
protena. La cantidad de Ac se obtiene mediante la siguiente operacin:
Cant. de protena Cant. de Ag = Cant. de Ac.
A
B
C
pp
[Ag]
[Ac] = cte







S el Ag es proteico y no tiene alguna marca, por ejemplo ovoalbmina, la cantidad
de Ac en el precipitado se puede determinar haciendo los clculos con valores
obtenidos en la zona de equivalencia:
Protena en pp Ag aadido = Ac en pp.

MATERIAL:
1 ml Solucin de Ag de concentracin conocida: Albmina srica humana
(ASH) 1 000 mg/dl
0.6 ml Ac especfico: Suero anti-ASH
5 ml Solucin salina isotnica (SSI)
12 Tubos capilares de 100 x 1.6 mm
10 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm
2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
3 Pipetas de 1 ml (1/10)
1 Gradilla par tubos de ensaye
1 Gradilla de plastilina para capilares
Papel absorbente
Lpiz graso o marcador indeleble

TCNICA:
1. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador.
2. En los tubos de ensayo debidamente rotulados (2 a 10), realizar diluciones
seriadas (2X) de la solucin de antgeno (ASH) con SSI: 1:2, 1:4, 1:8,
1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 y 1:512. Para ello:
Colocar 0.5 ml de SSI en cada uno de los tubos
Al tubo 2 agregar 0.5 ml de la solucin de ASH, mezclar con la misma
pipeta (dilucin 1:2).
Pasar 0.5 ml del tubo al tubo 3. Mezclar. (dilucin 1:4).
Repetir el procedimiento hasta el tubo 10 (diluciones 1:8 a 1:512)
3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de antisuero
(anti-ASH) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y
manteniendo el dedo ndice en el extremo del capilar, limpiar la parte
externa con papel absorbente.
4. Quitando el dedo ndice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad
la solucin de antgeno sin diluir (1:1) de tal manera que el volumen total
llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte
externa del capilar con papel absorbente.
5. Tapando con el dedo ndice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las
soluciones por inversiones repetidas o moviendo el lquido de un lado al
otro y rotando el capilar simultneamente varias veces.
6. Con el dedo ndice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el
lquido dentro del capilar y, colocando el dedo ndice en un extremo.







7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos
mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalizacin de
los reactivos por contacto con sta.
8. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para cada uno de los
capilares correspondientes a las otras diluciones de Ag (de 1:2 a 1:512).
9. Incluir los siguientes testigos:
a) Un capilar llenado hasta la segunda marca con solucin de Ag sin diluir.
b) Un capilar llenado hasta la segunda marca con antisuero.
10. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente 48 h en refrigeracin.
11. Medir la cantidad de precipitado en milmetros en cada capilar. Si el
precipitado es difuso o est fraccionado, centrifugar los capilares 1 min a
1000 rpm colocndolos dentro de los tubos de ensayo de 13 X 100 mm o
en una centrfuga para hematocrito.
NOTA: Cuidar que al sacar cada uno de los capilares de la plastilina
queden tapados con la misma en su parte inferior.

RESULTADOS:
Con los datos obtenidos complementar la siguiente tabla y construir la curva de
precipitacin, graficando concentracin de Ag (abscisas) contra la cantidad de
precipitado formado, expresado en mm (ordenadas).

CAPILAR DILUCION DEL Ag [Ag] mg/dl PRECIPITACIN
(mm)
1 1:1
2 1:2
3 1:4
4 1:8
5 1:16
6 1:32
7 1:64
8 1:128
9 1:256
10 1:512
11 Control de Ag 1.1
12 Control de Ac 0
[ASH] = 1000 mg/dl







PRCTICA No. 2
MEZCLA DE ANTGENO Y ANTICUERPO
Prueba de Identidad a Sueros de Uso Teraputico
Determinacin del Origen de Manchas de Sangre


MARCO TERICO.
La precipitacin por simple mezcla de Ag y Ac puede llevarse a cabo en capilar o
en tubos de ensayo, cuando se utilizan estos ltimos suele acelerarse la reaccin
con temperatura (50 55 C). Las ventajas que ofrece la metodologa es la
economa, la facilidad de interpretacin y el poco equipo requerido, y la desventaja
principal es el riesgo de caer fcilmente en fenmeno de zona cuando no se
prueban diluciones.

Entre las aplicaciones de esta tcnica se pueden mencionar las pruebas de
peritaje para la identificacin de manchas de sangre y de semen, as como en
alimentos en la determinacin de la especie de que proceden las carnes y
derivados, as como en la investigacin del origen de sueros inmunes y para
estudiar las relaciones filogenticas de las especies y la zoofilia y antropofilia de
vectores.

Esta tcnica ser ejemplificada con la investigacin del origen de muestras de
antitoxinas, determinacin que se realiza como prueba de Identidad a sueros
inmunes o con la identificacin del origen de manchas de sangre.

MATERIAL:
100 l Muestras de antitoxina tetnica o papel filtro con manchas de sangre.
50 l De cada suero antiespecie: anti-equino, anti-humano, anti-bovino, etc.
2 4 Tubos capilares 1 x 9 mm
1 Gradilla de plastilina
Papel absorbente

TCNICA:
Para la prueba de identidad de sueros de uso teraputico llevar a cabo todos los
pasos incluyendo los incisos (a) del paso 1 y 8. Para la identificacin de manchas
de sangre tambin realizar todos los pasos pero ahora incluir los incisos (b) del
paso 1 y 8.
1a. Si es necesario, eliminar partculas en suspensin de los sueros y las
muestras por centrifugacin a 2000 rpm, 2 min.
1b. Colocar pequeos fragmentos de la mancha de sangre en un tubo de
ensayo y extraer con 2 ml de solucin salina isotnica.
2. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador.







3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de suero
(anti-humano) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y
manteniendo el dedo ndice en el extremo del capilar, limpiar la parte
externa con papel absorbente para no contaminar la muestra problema.
4. Quitando el dedo ndice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad
un volumen igual de la muestra de antitoxina problema o del extracto de la
mancha de sangre, de tal manera que el volumen total llegue hasta la
segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del
capilar con papel absorbente.
5. Tapando con el dedo ndice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las
soluciones por inversiones repetidas o moviendo el lquido de un lado al
otro y rotando el capilar simultneamente varias veces.
6. Con el dedo ndice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el
lquido dentro del capilar y, colocando el dedo ndice en un extremo.
7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos
mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalizacin de
los reactivos por contacto con sta.
8a. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para el otro capilar pero
ahora utilizar como Ac el suero anti-equino.
8b. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para los otros capilares pero
ahora utilizando los otros sueros antiespecie.
9. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente 48 h en refrigeracin.

RESULTADOS:
Leer los resultados observando en cual de los capilares se observa precipitacin.
Determinar el origen de la muestra de antitoxina utilizada o la especie de donde
procede la mancha de sangre.








PRCTICA No. 3
DOBLE DIFUSIN EN PLACA (OUCHTERLONY)
Identificacin de fracciones antignicas presentes en suero humano


MARCO TERICO.
Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles. Esta difusin
est limitada por la concentracin del gel, as como por el peso molecular y
tamao de las molculas de Ag y Ac. Empleando soportes que tienen como base
agar disuelto en una solucin amortiguadora, los antgenos y/o anticuerpos
pueden migrar y al encontrarse en concentraciones equivalentes, formar el
inmunoprecipitado, evitando as el efecto indeseable del fenmeno de zona. La
velocidad de la difusin de ambas molculas es directamente proporcional a la
concentracin e inversamente proporcional al peso molecular (Ley de Fick). Otros
soportes que pueden ser utilizados son: pectinas, alginatos, poliacrilamida y tiras
de acetato de celulosa gelatinizado.

En la tcnica de Ouchterlony, el Ag y el Ac se colocan en pozos hechos en una
placa de gel de agar, a partir de ellos ambos reactivos difunden radialmente y al
encontrase en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de
precipitacin dependiendo del nmero de sistemas Ag-Ac presentes.

Cuando se prueba un Ag constituido por una mezcla de fracciones antignicas
frente a una mezcla de Ac, se forman varias bandas y cada una corresponde a
una fraccin antignica diferente.

Aumentando el nmero de perforaciones se pueden probar varios sistemas
simultneamente y segn las formas de las bandas obtenidas se puede
determinar si los antgenos analizados son idnticos (cuando las lneas de
precipitacin confluyen), diferentes (cuando las lneas se cruzan) relacionados
(cuando las lneas se unen parcialmente) (ver esquema).






IDENTIDAD IDENTIDAD NO IDENTIDAD
PARCIAL


Esta tcnica es muy til para determinar la homogeneidad de antgenos y
anticuerpos purificados, as como para buscar impurezas en un sistema.
Ag Ag

Ac
Ag

Ag

Ac
Ag

Ag

Ac










MATERIAL:
Antgenos: Suero humano (SH), Albmina srica humana (ASH), IgG
humana purificada, suero bovino (SB), suero murino.
Anticuerpo: Suero antihumano,
1 Tubo de 13 x 100 mm con 3 ml de agar noble al 1.5% en SSI
1 Tubo de 13 x 100 mm con 2 ml de agar noble al 0.3% para sellar
1 Portaobjetos
1 Hisopo
1 Nivelador de gota
1 Placa de vidrio
1 Cmara hmeda (caja Petri con papel filtro hmedo)
1 Vaso de precipitado de 250 ml
1 Tripi con tela de alambre
1 Mechero
1 Horadador de 2 mm de dimetro
1 Plantilla de una horadacin central y seis perifricas.
5 Capilares
Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 ml adaptado
con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2
tramos de manguera para vaco de 30 cm.

TCNICA:
1. Barnizar los portaobjetos lavados y desengrasados con agar al 0.3%
fundido con ayuda del hisopo.
2. Colocar los portaobjetos barnizados sobre una superficie perfectamente
nivelada y verter sobre cada uno el contenido del tubo con agar al 1.5%
fundido (3 ml).
3. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente.
4. Con el horadador practicar 7 cortes en forma de roseta: uno central y 6
perifricos, usando la plantilla o un papel con el esquema de las
perforaciones debajo del portaobjetos. (ver el esquema)







5. Extraer el gel de agar de los cortes mediante el equipo de succin
haciendo un ligero vaco o con la aguja de una jeringa.
3
2 1
4 5
6







6. Colocar con un capilar en la horadacin central suero antihumano hasta
llenar el pocito, sin derramar su contenido.
7. Con capilares individuales tomar cada reactivo biolgico, colocar en los
pozos de la periferia ordenados en el sentido de las manecillas del reloj:
en los pozos 1 y 6 suero humano; en el 2 ASH, en el 3 suero bovino, en el
4 suero murino, en el 5 IgG humana purificada.

8. Introducir el portaobjetos en la cmara hmeda, cerrarla e incubar de 18 a
24 h a temperatura ambiente 48 h a 4 C.

RESULTADOS:
Leer los resultados, identificando bandas de identidad, no identidad e identidad
parcial.










PRCTICA No. 4
INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (RID)
(Mancini, Carbonara y Hermans)
Cuantificacin de Albmina Srica Humana

MARCO TERICO.
Este mtodo se aplica rutinariamente en Inmunologa Clnica para la cuantificacin
de antgenos, fundamentalmente de las fracciones plasmticas humanas, como
son la albmina srica humana (ASH), las inmunoglobulinas G, A y M, los
componentes C3 Y C4 del complemento, factores de coagulacin, etc.

Para llevarlo a cabo se emplea una placa de gel de agar purificado al que se
incorpora el suero especfico monovalente para la fraccin que se desea
cuantificar. En esta placa se practican horadaciones y en ellas se coloca un
volumen medido con exactitud tanto de un estndar en tres dilaciones de
concentracin conocida, como de los sueros problema. Al difundirse de manera
radial el Ag en el seno del agar que contiene el anticuerpo se va formando un halo
de precipitacin alrededor del pozo donde se coloc el Ag. El dimetro de la zona
de precipitacin es directamente proporcional a la concentracin del Ag y por lo
tanto los datos obtenidos en las reacciones de precipitacin de los estndares
sirven para trazar la curva de calibracin de la placa de donde se obtiene la
concentracin del Ag presente en los sueros problema. El anticuerpo incorporado
determina la sensibilidad de la placa.

Esta tcnica ofrece las ventajas de utilizar poca cantidad de reactivos, sencillez de
manipulacin e interpretacin, alta sensibilidad y la opcin de usar placas
disponibles comercialmente; aunque tiene como desventaja que el tiempo para dar
por terminada la prueba es largo.

MATERIAL:
1.0 ml Suero anti-ASH
0.2 ml Suero problema diluido 1:10
50 l Soluciones estndares de ASH
1 Gradilla
1 Matraz Erlenmeyer de 100 ml
1 Tubo de 16 x 100 mm con tapn de hule
1 Pipeta graduada de 1 ml
1 Nivelador de gota
1 Placa de vidrio de 20 x 20 cm
1 Placa de plstico con tapa para RID
1 Horadador de 2 mm de dimetro
1 Micropipeta de 20 l o capilares calibrados de 5 l
1 Plantilla de 12 horadaciones para RID







1 Regleta para medicin de halos para RID
Puntas para micropipeta
Platina calentadora con agitacin
Bao de agua a 56 C.
Equipo de succin constituido por: Matraz Kitasato de 500 ml adaptado
con tapn de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2
tramos de manguera para vaco de 30 cm

TCNICA:
1. Preparar una solucin de agar noble al 2% en amortiguador PBS pH 7.2,
fuerza inica 0.075. Fundir a ebullicin en la platina de calentamiento.
2. Pipetear 5 ml de la solucin anterior en un tubo de ensayo previamente
calentado en bao de agua a 56 C y mantener el tubo con gel a esa
temperatura un tiempo, hasta que se estabilice.
3. Manteniendo el tubo dentro del bao de agua a 56 C, incorporar al gel de
agar 1.0 ml de suero anti-ASH.
4. Tapar el tubo, sacarlo del bao y mezclar por inversin rpida, pero
suavemente para evitar que se forme espuma.
5. Secar el tubo y verter el agar sobre la placa de plstico para RID, la cual
ha sido previamente calentada al vapor sobre la platina caliente cubierta
con un trapo hmedo (para no daar la placa).
6. Homogeneizar con movimientos de rotacin suave y en seguida dejar
solidificar sobre la placa de vidrio perfectamente nivelada.
7. Haciendo uso de una plantilla, practicar 12 horadaciones en el gel con un
perforador de 2 mm de dimetro interno.
8. Depositar en cada pozo 5 l de las soluciones estndares y problemas. Es
conveniente que los 3 primeros pozos se ocupen con estndares y los
dems con problemas.










9. Permitir que difunda el antgeno 48 h.
10. Medir con la regleta para RID el dimetro del halo formado, esta regleta
tiene marcadas lneas convergentes-divergentes, las cuales deben quedar
dispuestas en forma tangente al halo y las marcas en lneas en cruz al
centro. La lnea vertical del centro del pozo da la medida del dimetro
2
.
12
10
11 1
2
3
4
5
6
7
8
9








RESULTADOS:
Construir una curva de calibracin con los resultados de los estndares de
concentracin conocida, graficando concentracin (abscisas) vs dimetro
2

(ordenadas), e interpolar los valores de dimetro
2
de las muestras problemas. La
recta formada no tiene origen en cero. Y el punto en que corta al eje de las
ordenadas es una constante para la placa y depende de tres factores: el dimetro
del pozo en que se colocaron los reactivos, la concentracin del Ac incorporado y
la altura del gel.

Obtener la concentracin de albmina de las muestras problema. Es importante
considerar el factor de dilucin de los sueros problema al momento de calcular la
concentracin de stos.

Comparar los cantidades obtenidos con los valores de referencia para albmina en
suero y determinar si se encuentran alterados.










NEFELOMETRA DE RAYO LASER.

MARCO TERICO.
La nefelometra es la medicin de la luz que se ha dispersado del rayo principal de
una fuente de transmisin de luz. No debe confundirse con turbidimetra, que es la
medicin de la disminucin de la luz que pasa a travs de una solucin semiopaca
o suspensin de material. En soluciones diluidas, la reaccin de precipitacin entre
el Ag y el Ac producen incremento en la reflexin que se puede medir por la
dispersin de una luz incidente. En turbidimetra la cantidad de luz absorbida es
medida por un espectrofotmetro, mientras que en nefelometra la cantidad de luz
dispersa es medida por un detector montado angularmente.

La determinacin nefelomtrica de los Ags se lleva cabo por la adicin de
cantidades constantes de antisuero especfico muy purificado a diversas
cantidades de Ag; los reactantes se colocan frente a un rayo de luz y el grado de
dispersin de la luz se mide como densidades pticas. La medicin precisa de los
Ags se debe hacer en la rama ascendente de la curva de pp, en donde existe una
relacin lineal directa entre la concentracin de Ag y D.O, por lo que para una
determinacin precisa de las soluciones con altas concentraciones de Ag las
muestras deben diluirse.

Los nefelmetros lser emplean un rayo lser de helio y nen como fuentes de luz
(es mucho ms potente) y diversos filtros electrnicos cerca del aparato de
deteccin, lo que asegura una alta relacin seal/ruido y un alto grado de
sensibilidad.

La nefelometra es un mtodo rpido y simple para la cuantificacin de Ags en
lquidos biolgicos, especialmente protenas plasmticas y componentes C3 y C4
de complemento, la desventaja es el alto costo del equipo y de los antisueros
especficos.


CUESTINARIO.
1. Menciona una situacin en la que sera conveniente colocar el Ag en el
orificio central de un sistema de Ouchterlony y los anticuerpos en los
orificios perifricos.
2. Cules son las concentraciones sricas de inmunoglobulinas en adultos
normales?
3. De 5 ejemplos de antgenos que pueden intervenir en reacciones de
precipitacin.
4. Cul es la razn de que concentraciones iguales de Ag y Ac no
necesariamente formen redes de precipitacin?







5. Cmo afecta la fuerza inica y el pH en la inmunoprecipitacin?

6. Qu relacin existe entre el halo formado en RID y la concentracin de
Ac en el gel?
7. Cmo esperara observar el halo de precipitacin en un paciente con
hipergammaglobulinemia al determinar la IgG y compararla con una
persona sana?
8. Cmo influye la clase de inmunoglobulina en la velocidad de difusin?








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