Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida.

La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos bioqumicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hace que estos mtodos se empleen ampliamente. Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin Ag-Ac (Tabla 1). As tenemos:

Tcnicas

de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgeno se encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.

Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se le une un istopo radiactivo, siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida.

Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos y anticuerpos especficos.

Tcnicas de precipitacin
Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo AgAc. Existen diferentes modalidades, siendo las principales: 1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha. 2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony. 3. Tcnica de

inmunoelectroforesis. 4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini. Tcnica de precipitacin

El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la (Figura 1) se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un antisuero. La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reaccin no es muy utilizado, al requerirse grandes formado. Tcnica de difusin radial doble de concentraciones para poder de medir antgeno el y de anticuerpo precipitado

Ouchterlony Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo, preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difundan, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente, que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado. La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas. Tcnica de Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac, visible en forma de lneas de precipitacin con un que pueden ser estudiadas (Figura utilizarse 3). por En comparacin sistema estndar

Inmunologa clnica, esta tcnica puede identificacin de las protenas de mieloma.

en la

Tcnica de difusin radial simple de Mancini Esta tcnica se basa en la difusin de un antgeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo especfico. Este anillo de precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones antignicas estn en relacin directa con el rea del crculo de precipitacin.

Al difundir el antgeno se genera un gradiente de concentracin desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentracin del antgeno es la adecuada (zona de equivalencia) el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin (Figura 4).

Tcnicas aglutinacin
En estas tcnicas se

de
hacen

visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte, glbulos etc. o partculas de ltex. Hemaglutinacin directa La presencia de antgenos en la superficie de los glbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinacin producida cuando se aade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antgenos. Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada anti-Rh se le aaden los antisueros cuando los correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos negativos). Habr aglutinacin glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 2). De igual manera se procede con o se rojos, ha unido artificialmente, a la superficie de plaquetas, se utilizan leucocitos, partculas de ltex, Normalmente glbulos rojos ( hemaglutinacin)

antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos grupos Rh. Hemaglutinacin indirecta Se basa en el principio de la inhibicin de la hemaglutinacin. Para su realizacin se precisan glbulos rojos, a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 5). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia, se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la hemaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotropina corinica (HCG) para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.