Agrobiotecnologa.

Curso 2011
Sistemas de transformacin vegetal
Sistemas de transferencia gentica en plantas Transparencias 3-6 Antes de elegir un sistema de transformacin vegetal es importante establecer un protocolo de cultivo de te!idos " de regeneracin de las plantas. #ste protocolo es parte integral de la ma"ora de las estrategias de transformacin " es generalmente el aspecto m$s e%igente de las mismas. &a clave para integrar e%itosamente las t'cnicas de cultivo de te!idos dentro en una estrategia de transformacin es la obtencin de un sistema de regeneracin r$pido " eficiente. (o todos los protocolos de regeneracin son compatibles con todas las t'cnicas de transformacin. )ientras una gran variedad de estrategias de regeneracin " transformacin son aplicables a muc*os cultivos se re+uieren protocolos mu" particulares " especficos para la modificacin de determinadas especies. #n t'rminos generales algunos protocolos son claramente m$s eficientes +ue otros. ,or e!emplo la regeneracin de embriones maduros a partir de embriones som$ticos es el m'todo m$s adecuado para la regeneracin de especies monocotiledneas. ,or lo tanto establecer una buena estrategia de regeneracin " cultivo de te!idos es primordial antes de implementar una t'cnica de transformacin. &a transparencia - muestra un diagrama de flu!o orientativo para establecer un protocolo de transformacin. ,rimero *a" +ue identificar el te!ido o c'lulas de las +ue se puede regenerar una planta establecer los agentes de seleccin apropiados las *ormonas re+ueridas los medios de cultivos adecuados para desarrollar una regeneracin eficiente de plantas enteras " f'rtiles .recuadro superior de la transparencia -/. 0na ve1 establecidos estos par$metros *a" +ue reali1ar las construcciones gen'ticas " reci'n entonces determinar el sistema de m$s apropiado para la introduccin del material gen'tico " establecer los principales par$metros del procedimiento correspondiente .recuadro inferior/. &a transformacin de plantas se refiere al evento de introducir e integrar A2( for$neo en c'lulas vegetales " regenerar plantas transg'nicas. &a transparencia 6 enumera las diferentes t'cnicas de transformacin de plantas +ue se *an desarrollado con el ob!eto de *acer m$s f$cil " eficiente esta metodologa. &os sistemas de trasferencia pueden dividirse en dos grupos3 4istemas basados en vectores biolgicos3 Transferencia mediada por Agrobacterium Transferencia basada en virus vegetales. 4istemas de transferencia directa de A2( sistemas basados en transferencia fsica surgidos como alternativa para transformar especies monocotiledneas +ue no son *ospedantes naturales de Agrobacterium: Transferencia por bombardeo de partculas o biobalstica. Transferencia por cationes divalentes "5o electroporacin. Transferencia con whiskers de carburo de silicio. Transferencia por microin"eccin. &os m'todos de transformacin desarrollados permiten la e%presin transitoria o la e%presin estable del A2( introducido. &a e%presin transitoria ocurre durante un perodo corto de tiempo .pocos das/ o *asta culminar el ciclo de vida de la planta

pero no es *eredable por la progenie. &a e%presin estable permite la integracin del A2( for$neo al genoma vegetal " la consiguiente transmisin a las siguientes generaciones. Biologa de Agrobacterium tumefaciens Transparencias 6-17 ,ese al desarrollo de otros m'todos para la transferencia de genes el m'todo m$s difundido es la transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens es una bacteria del suelo gram negativa +ue ataca a un amplio rango de plantas dicotiledneas. )uc*as especies agronmicamente importantes *an sido transformadas usando esta bacteria del suelo .micrografa de la transparencia 8/ " la lista de especies susceptibles a la transformacin por Agrobacterium se incrementa continuamente. &a fotografa del panel inferior de la transparencia 8 muestra un tumor tpico causado por A. tumefaciens com9nmente denominado agalla del tallo. #l g'nero Agrobacterium ataca a un amplio rango de *u'spedes principalmente entre las especies dicotiledneas. Con ba!a eficiencia puede infectar tambi'n a varias especies monocotiledneas. &a transformacin mediada por Agrobacterium puede lograrse utili1ando e%plantos de te!ido mu" variados los +ue deben seleccionarse de acuerdo con las caractersticas de la especie vegetal o de la variedad con la +ue se traba!e. #n algunos casos .tabaco papa/ es posible utili1ar te!idos mu" diferentes con este fin. #n otros casos el e%planto de eleccin es sumamente especfico. &a tabla de la transparencia : presenta e!emplos de los e%plantos m$s com9nmente utili1ados. #l g'nero Agrobacterium inclu"e varias especies patog'nicas +ue presentan un amplio rango de *u'spedes " de sintomatologas. &a bacteria causa la formacin de tumores en la 1ona cercana al sitio de infeccin. #l desarrollo de estos tumores se debe a +ue Agrobacterium *a desarrollado la capacidad de transferir parte de su propio material gen'tico a la planta *ospedante. &a transparencia 7 muestra el ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens. &a formacin de tumores ocurre generalmente en el tallo de la planta inmediatamente sobre el nivel del suelo. &a formacin de estos tumores se debe a la transferencia de genes bacterianos +ue intervienen en la sntesis de fito*ormonas. &a bacteria transfiere tambi'n genes +ue participan de la sntesis de una serie de compuestos de con!ugacin denominados opinas los +ue son secretados al medio " utili1ados como fuente de carbono " nitrgeno en forma e%clusiva frente a otros microorganismos del suelo. 2ebido a +ue su sistema de patogenia se basa en redirigir gen'ticamente el metabolismo de la planta para su propio beneficio las distintas especies de Agrobacterium pueden considerarse ;coloni1adores gen'ticos<. &a transparencia 10 muestra los procesos celulares involucrados en las principales etapas de interaccin entre Agrobacterium tumefaciens " una planta susceptible. #stos procesos son3 A3 =econocimiento c'lula-c'lula. &a coloni1acin por Agrobacterium re+uiere la e%istencia de *eridas en las races de la planta. Agrobacterium se despla1a *acia el te!ido *erido siguiendo un gradiente de concentracin de se>ales +umicas establecido por e%udados del te!ido vegetal. ? C " 23 Corresponden a tres etapas consecutivas +ue involucran el procesamiento del A2( el empa+uetamiento de la *ebra T luego de su escisin " el transporte del comple!o T desde la c'lula bacteriana *acia la c'lula vegetal. &a transparencia

muestra una microscopa electrnica .C/ del comple!o T maduro compuesto por el A2( T de simple cadena " las protenas @ir# " @ir2. #ste comple!o es probablemente transportado a la c'lula *u'sped a trav's del pilus .se>alado por flec*as en 2/. #3 4e muestra la importacin del comple!o T maduro al interior del n9cleo de la c'lula vegetal. &a foto muestra acumulacin de protena @ir2 fusionada a AB, en el n9cleo la +ue se observa como fluorescencia verde. B3 &uego de la integracin " e%presin del A2( bacteriano al genoma vegetal se observa la formacin del tumor de agalla. #l te!ido indiferenciado prolifera desde el sitio de la *erida " secreta distintas opinas +ue son cataboli1adas especficamente por Agrobacterium. &a porcin de material gen'tico transferido desde la bacteria +ue se integra al genoma de la planta corresponde a una regin de un pl$smido residente en la bacteria denominado pl$smido Ti .transparencia 11/. &a regin +ue es transferida recibe el nombre de A2( o *ebra T .indicada en el es+uema como regin T/ " est$ flan+ueada por dos repeticiones directas denominadas borde derec*o .?2/ e i1+uierdo .?C/. &os pl$smidos Ti tienen un tama>o de entre 200 " 800 Dpb. &a regin T corresponde a una secuencia de A2( de entre 10 " 30 Dpb " comprende tanto los oncogenes .genes responsables de la sntesis de au%inas " cito+uininas/ como los genes involucrados en la sntesis " el transporte de opinas. &a regin de virulencia . vir/ comprende varios operones bacterianos +ue participan en la escisin de la *ebra T " en la formacin del intermediario de transferencia .comple!o T/. &a regin vir comprende unos -0 Dpb. Etros elementos importantes locali1ados en los pl$smidos Ti son los orgenes de replicacin " de transferencia .oriT implicado en el proceso de con!ugacin bacteriana/ " las regiones +ue contienen genes responsables del catabolismo de las opinas. Todos los pl$smidos Ti tienen una estructura similar. &as especies de Agrobacterium sinteti1an diferentes tipos de opinas " son referidas de acuerdo con ello. &a transparencia 12 muestra las regiones de *omologa entre los pl$smidos Ti de dos cepas comunes de Agrobacterium una de octopina .oct/ " otra de nopalina .nop/. 2ic*as regiones abarcan principalmente la regin T " la regin vir. 0na caracterstica del pl$smido Ti de octopina es +ue contiene tres regiones T cortas de 13 1 : " 6 8 Dpb los cuales son transferidos independientemente unos de los otros mientras +ue el de nopalina lleva un 9nico pl$smido Ti de 22 Dpb. #%isten muc*as otras opinas tales como manopina agropina agrocitopina etc. #n los pl$smidos representados en esta transparencia se muestran cuatro regiones de *omologa +ue contienen respectivamente a los genes +ue codifican protenas involucradas en la sntesis de au%inas " cito+uininas .regin A/ el origen de replicacin .regin ?/ los genes +ue codifican protenas involucradas en el catabolismo de octopinas " nopalinas .regin C/ " los genes de virulencia .regin 2/. &a transparencia 13 muestra una representacin es+uem$tica de la regin T. &a regin T est$ definida por dos repeticiones directas de 2: pb altamente *omlogas. Tanto el borde derec*o como i1+uierdo son importantes para el reconocimiento de las endonucleasas @ir215@ir22 +ue estaran involucradas en la liberacin de la *ebra T. 4in embargo el proceso de escisin tendra caractersticas polares como lo sugiere el *ec*o de +ue la protena @ir22 se une preferentemente al borde derec*o .e%tremo :F de la *ebra T/. Tambi'n se *an identificado secuencias pr%imas al borde derec*o +ue contribuiran a establecer la polaridad del proceso. #n los pl$smidos de octopina una de estas secuencias .overdrive/ incrementa el transporte del A2( T a la c'lula vegetal. &a protena @irC se une a esta secuencia favoreciendo el cliva!e del borde derec*o por la endonucleasa @ir21522. #l borde derec*o es re+uerido en forma absoluta para la patogenicidad de Agrobacterium tumefaciens mientras +ue el borde i1+uierdo es prescindible.

#ntre los bordes i1+uierdo " derec*o se encuentran los genes +ue codifican para la sntesis de au%inas cito+uininas " opinas. #n condiciones de alta concentracin de au%inas " ba!a de cito+uininas el te!ido vegetal se diferencia en races. 0na situacin inversa corresponde el desarrollo de tallos. &a sntesis no regulada de au%inas " cito+uininas induce el crecimiento indiferenciado del te!ido vegetal " conduce en el caso de una sntesis elevada de los dos tipos de *ormonas a la formacin de te!ido tumoral. &os oncogenes transferidos por Agrobacterium si bien son controlados por promotores de tipo eucariota no responden a los mecanismos de regulacin endgenos. Como consecuencia la integracin del A2( T en el genoma de la planta induce la desdiferenciacin del te!ido " el desarrollo de un tumor de agalla. #l es+uema de la transparencia 1- indica tambi'n la ubicacin de la regin overdrive .enhancer de la sntesis de la *ebra T/. &a coloni1acin gen'tica por Agrobacterium re+uiere la presencia de dos regiones locali1adas en el pl$smido Ti3 1/ el A2( de la regin T cu"a secuencia ser$ transferida al genoma de la planta " 2/ la regin de virulencia . vir/ compuesta por siete loci principales .virA, virB, virC, virD, virE, virG vir!/ +ue codifican la ma"or parte de la ma+uinaria proteica involucrada en la transferencia del A2( T. Adem$s de estas regiones se re+uiere de un grupo de genes de virulencia locali1ado en el cromosoma de la bacteria .genes chv/ +ue participan en los estadios tempranos de unin a las c'lulas de la planta. &as interacciones +ue tienen lugar durante la transformacin gen'tica mediada por Agrobacterium conforman un proceso +ue puede dividirse en oc*o pasos distintivos resumidos en la transparencia 1:. 1/ Agrobacterium reconoce " se une a la c'lula *u'sped. #sta unin es mediada por protenas codificadas en el cromosoma de la bacteria " por receptores especficos de la c'lula *u'spedG 2/ #l sistema de traduccin de se>ales de Agrobacterium reconoce se>ales +umicas especficas de la plantaG 3/ &a protena virG media la transduccin de se>ales " la activacin transcripcional de los genes virG -/ &a formacin de la copia de A2( T " del comple!o T inmaduroG :/ &a formacin del comple!o de transporte a trav's de las membranas de la bacteria " de la pared celular compuesto principalmente por las protenas de la familia @ir? " la protena @ir2- lo +ue permite la e%portacin de la *ebra T " de las protenas @ir22 " @ir#1 al citoplasma de la c'lula vegetalG 6/ &a formacin del comple!o T maduro formado por la *ebra T " las protenas @ir22 " @ir#2G 6/. &a importacin del comple!o T al n9cleo proceso +ue es facilitado por protenas de la planta entre las +ue se *a identificado a AtDA,a " @C,1G 8/ #l transporte dentro del n9cleo " la integracin del A2( T al genoma de la planta mediado por @ir225@ir#2 " por factores nucleares. 4e *a reportado +ue @ir22 es capa1 de unirse a las ciclofilinas =ocA =oc- " C"pA protenas +ue act9an como c*aperonas " contribuira a mantener la conformacin de @ir22. Etra protena vegetal +ue se une a @ir22 es una fosfatasa tipo 2C .,,2C/ es re+uerida para la acumulacin de @ir22 en el n9cleo. Binalmente @ir22 tambi'n interacciona con AtDApa. #sta protena participa en la importacin de protenas +ue contienen sitios (&4 al n9cleo. A diferencia de @ir22 @ir#2 no se une a AtDapa pero si lo *ace a otras dos protenas @C,1 " @C,2. &a protena @C,1 es capa1 de importar la protena @ir#1 al n9cleo en un sistema de levaduras. A su ve1 @C,2 no slo se une a @ir#2 sino tambi'n @C,1 en ensa"os de doble *brido. ,or lo tanto @C,1 @C,2 " @ir#2 pueden funcionar como un comple!o multiproteico facilitando " participando el transporte *acia el n9cleo de la protena @ir#2 " contribuir as a la integracin del comple!o T. Adem$s de AtDA,a " @C,1 se *a descripto +ue el comple!o =A( con actividad AT,asa es re+uerido para la importacin al n9cleo en otros sistemas sugiriendo +ue tambi'n participara en la importacin del comple!o T al n9cleo. &os an$logos de AT, no *idroli1ables blo+uearan la importacin al n9cleo de las protenas @ir#2 " @ir22 por in*ibicin de =A(.

#l reconocimiento " la unin de las c'lulas de Agrobacterium a la c'lula vegetal es esencial para el proceso de infeccin. &uego de un primer paso de unin la bacteria sinteti1a filamentos de celulosa +ue permiten el ancla!e de 'sta a la pared celular de la planta. 4e *an identificado varios genes cromosmicos . ChvA chvB "scA att/ +ue participaran del proceso de unin a la pared de la c'lula vegetal. 4in embargo este proceso est$ poco caracteri1ado " la funcionalidad de estos genes en el proceso de ancla!e no *a sido completamente dilucidada. Agrobacterium *a desarrollado un sistema regulatorio de dos componentes para reconocer la presencia de c'lulas *u'spedes susceptibles compuesto por una protena de membrana .@irA/ " una protena citoplasm$tica .@irA/. #stas protenas act9an como un par receptor5transductor frente a mol'culas provenientes de las *eridas en la planta " promueven la transcripcin de los genes vir .transparencia 16/. #l inductor me!or estudiado es la acetosiringona un compuesto fenlico. Algunos monosac$ridos tales como glucosa " galactosa tambi'n contribu"en a la e%presin de los genes vir. &a se>ali1acin se inicia a trav's de compuestos fenlicos secretados por la planta los +ue se unen a la protena @irA. 2os protenas codificadas por genes cromosmicos de Agrobacterium p10 " p21 contribu"en en este reconocimiento. &a primera se unira a los compuestos fenlicos " mediara directa o indirectamente la unin a @irA. #n cambio la induccin de los genes vir por a19cares es mediada por otra protena de origen cromosmico .C*v#/ +ue une glucosa5galactosa e interact9a con @irA. @irA funciona como una proten +uinasa " como fosfotransferasa. #n el primer caso ocurre una autofosforilacin en un residuo de *istidina situado dentro de su regin C-terminal la +ue tambi'n contiene el dominio +uinasa. &a protena @irA fosforilada se une a la protena @irA +ue es a su ve1 fosforilada en un residuo aspartato. &a forma fosforilada de @irA es muc*o m$s estable " posiblemente permita ma%imi1ar los niveles de induccin de los restantes genes vir. &a induccin de los genes vir ocurre cuando @irA fosforilado se une especficamente a los dominios vir una secuencia conservada de 12 pb locali1ada en la regin promotora de los genes vir. 0na ve1 inducidos los genes vir se produce la escisin de la *ebra T libre. #ste evento se inicia en el borde derec*o contin9a en direccin :F-3F " termina en el borde i1+uierdo de la *ebra antisentido. 0n comple!o de protenas denominadas @ir21522 +ue funcionan como endonucleasas especficas se une a la forma su"ercoiled del pl$smido Ti rela!an el pl$smido *ace un corte entre la tercera " cuarta base de los bordes derec*o e i1+uierdo en la *ebra antisentido de la regin T " liberan dic*a *ebra. &a reaccin de corte comprende la unin covalente de la protena @ir22 al e%tremo :F del borde derec*o. &uego la ma+uinaria de sntesis de A2( repara la brec*a entre los bordes derec*o e i1+uierdo de la *ebra antisentido. &a protena @ir22 permanece unida al A2(-T durante todo el tra"ecto *asta la c'lula *u'sped. &as protenas @ir22 " @ir#2 .una protena de unin a A2( de simple cadena/ !unto con la *ebra T constitu"en el comple!o T maduro. &a unin de @ir#2 ocurre antes de +ue la *ebra T sea transportada a trav's del canal de pasa!e a trav's de las membranas de la bacteria. Etra protena recientemente identificada la protena @ir#1 se une a @ir#2 facilitando la unin de @ir#2 al A2( pero no interviene en la e%portacin de la *ebra T a la c'lula de la planta. 0na ve1 formado el comple!o T maduro 'ste interact9a con distintos comple!os proteicos involucrados en su e%portacin al citoplasma de la c'lula vegetal. #l dispositivo de transporte del comple!o T contiene alrededor de 12 protenas +ue forman dos componentes funcionales3 un comple!o secretorio +ue transporta sustratos a trav's de la membrana celular " un pilus filamentoso. &a transparencia 18 muestra un modelo +ue da cuenta de la estructura de estos comple!os elaborado sobre la base de evidencia indirecta. #l comple!o secretorio est$ compuesto por la protena codificada por el gen virD# " por un con!unto de protenas codificado por el opern virB el +ue contiene once marcos abiertos de lectura. #l pilus est$ compuesto

ma"oritariamente por la protena @ir?2 " en menor proporcin por la protena @ir?:. #l pilus censara el contacto con la c'lula vegetal " traducira la informacin al comple!o secretorio para iniciar la e%portacin del comple!o T. 4e piensa +ue la protena @ir?1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradacin de los peptidoglicanos bacterianos. &as protenas @ir?3 " @ir?- promoveran el ensamblado del pilus. Adem$s de @ir2- @ir?- " @ir?11 poseen tambi'n actividad AT,asa. 4e asume +ue el transporte del comple!o T implica la *idrlisis de AT, " +ue por lo tanto se trata de un proceso de transporte activo. &a protena @ir?6 participara en la formacin del poro del comple!o secretorio de transporte. 4e desconocen a9n las funciones de las protenas @ir?6 8 7 " 10. &uego de pasar al citoplasma de la c'lula vegetal el comple!o T es transportado al n9cleo de la misma. A diferencia de los elementos gen'ticos transponibles el A2(-T no codifica protenas necesarias para su transporte e integracin. ,or lo tanto el A2(T no contiene secuencias especficas " cual+uier fragmento de A2( insertado entre los bordes de la regin T ser$ transferido e integrado al genoma vegetal. &as protenas @ir22 " @ir#2 +ue componen el comple!o T est$n directamente implicadas en el proceso de importacin al n9cleo vegetal. @ir22 contiene dos se>ales de locali1acin nuclear .(&4/ " @ir#2 contiene una. @ir22 " @ir#2 se uniran a protenas de la planta involucradas con la importacin e integracin del A2(-T. 4e *a reportado +ue @ir22 es capa1 de unirse a las ciclofilinas =ocA =oc- " C"pA protenas +ue act9an como c*aperonas " contribuira a mantener la conformacin de @ir22. Etra protena vegetal +ue se une a @ir22 es la "a mencionada fosfatasa tipo 2C .,,2C/ es re+uerida para la acumulacin de @ir22 en el n9cleo. Binalmente @ir22 tambi'n interacciona con AtDApa. #sta protena de la familia de carioferinas participa en la importacin de protenas +ue contienen sitios (&4 al n9cleo. A diferencia de @ir22 @ir#2 no se une a AtDapa pero si lo *ace a otras dos protenas @C,1 " @C,2. &a protena @C,1 como "a se di!o es capa1 de importar la protena @ir#1 al n9cleo en un sistema de levaduras e interactuar con @C,2. ,or lo tanto @C,1 @C,2 " @ir#2 conformaran un comple!o de protenas +ue posibilita el transporte *acia el n9cleo de @ir#2 " contribu"e as a la integracin del comple!o T. 0na ve1 en el n9cleo el comple!o T participa de la integracin de la *ebra T al genoma de la planta. 4e asume +ue tanto las protenas @ir22 " @ir#2 como otros factores nucleares proveen actividades +ue posibilitan este proceso. &a transparencia 17 ilustra un posible modelo del mecanismo involucrado. &a protena @ir22 tiene actividad ligasa in vitro lo +ue sugiere +ue podra participar en la ligacin del e%tremo :F del A2( T al A2( de la planta. A este paso seguira un paso de sntesis reparativa de la *ebra complementaria en +ue intervendra la ma+uinaria nuclear de la planta. 4in embargo otros estudios sugieren +ue la doble cadena se sinteti1ara previamente a la integracin al genoma vegetal. &a protena @ir22 tiene en su e%tremo C-terminal motivos presentes en la familia de las recombinasas. &a protena @ir#2 se re+uerira para la integracin del e%tremo 3F del A2( T. Tambi'n se *a sugerido una participacin de la *istona H2A en el proceso de integracin. #n resumen podemos dividir el proceso de transformacin mediada por Agrobacterium en cuatro tipos de interacciones diferentes3 a/ interacciones e%tracelulares b/ interacciones dentro de Agrobacterium c/ interacciones dentro de la c'lula vegetal " d/ interacciones en el n9cleo de la c'lula vegetal .ver Ane%o transparencias 10--106/. Cnteracciones e%tracelulares .transparencia 10-/3 &as protenas bacterianas C*vA C*v? ,scA " Att reconocen los receptores .protenas tipo vitronectina/ de la pared celular de la c'lula vegetal resultando en la unin de las agrobacterias a la c'lula *u'sped. C*v# interacciona con a19cares " transfiere la se>al a @irA o @irA

interacciona con compuestos fenlicos en forma directa o va p10 " p21. Ambas vas de se>ali1acin resultan en la autofosforilacin de @irA. &a transferencia del grupo fosfato de @irA a @irA transmite las se>ales de la planta a la c'lula bacteriana donde @irA activa la e%presin de los genes vir. Cnteracciones dentro de Agrobacterium .transparencia 10:/: #sta etapa comien1a con la activacin de los genes vir. &as protenas @ir?1 @ir?3 @ir?- @ir?6 @ir?6 @ir?8 @ir?7 @ir?10 @ir?11 " @ir2- se ensamblan formando un comple!o secretorio transmembrana +ue !unto con el pilus formado por @ir?25@ir?: funcionan como un canal +ue conecta la c'lula vegetal con la c'lula bacteriana. @ir21 " @ir22 forman un comple!o de endonucleasas +ue con la a"uda de @irC1 cortan la cadena antisentido en los bordes del A2( T. 2urante este proceso @ir22 se une covalentemente al e%tremo :F de la *ebra T generando un comple!o T inmaduro. #ste comple!o T puede madurar por dos mecanismos diferentes3 a/ el comple!o T inmaduro " @ir#2 unida a @ir#1 se e%portaran a trav's del canal de manera separada. #n la c'lula *u'sped @ir#2 " @ir#1 se desunen " @ir#2 se une a la cadena T formando el comple!o T maduro .A2( T @ir22 " @ir#2/G b/ @ir#2 se une al A2( T en el citoplasma bacteriano " el comple!o T maduro es luego e%portado. Cnteracciones dentro de la c'lula vegetal .transparencia 106 panel superior/3 2entro del citoplasma de la c'lula vegetal @ir22 interacciona con las ciclofilinas =ocA =oc- " C"pA para mantener su conformacin con la protena AtDA,a para importar el comple!o T dentro del n9cleo " posiblemente con ,,2C para regular esta importacin. @ir#2 interacciona con @C,1 para favorecer su importacin al n9cleo. &as interacciones @ir22-AtDA,a " @ir#2-@C,1 resultan en una eficiente importacin del comple!o T al n9cleo. Cnteracciones en el n9cleo de la c'lula vegetal .transparencia 106 panel inferior/3 0na ve1 en el n9cleo @C,1 " @C,2 podran participar en el transporte intranuclear del comple!o T gui$ndolo al sitio de integracin en el cromosoma de la planta. Binalmente factores nucleares act9an en forma concertada con @ir22 " @ir#2 para integrar la cadena T en el A2( cromosmico resultando en una transformacin gen'tica estable. Vectores basados en plsmidos Ti Transparencias 20-31 &a capacidad natural de Agrobacterium de introducir A2( en el genoma nuclear de la planta permiti desarrollar vectores basados en las secuencias del pl$smido Ti de Agrobacterium. 4e constat +ue si se remueven todos los genes comprendidos dentro de la regin T .oncogenes " genes de sntesis de opinas/ no se afecta la transferencia e integracin del A2( T. 4obre esta base se desarrollaron vectores de e%presin +ue permiten clonar genes de inter's dentro de la regin T. #%isten dos tipos diferentes de vectores de transformacin. &as partes A " ? de la transparencia 21 muestran los fundamentos de un vector de tipo cointegrativo. #l gen de inter's es introducido dentro de un pl$smido Ti mediante un paso de recombinacin simple a partir del llamado vector intermediario .un pl$smido com9n de traba!o para Escherichia coli/. #n este pl$smido Ti las secuencias comprendidas entre los bordes de la regin T *an sido reempla1adas por secuencias +ue permiten la cointegracin del vector intermediario. #ste pl$smido Ti conserva tambi'n todos los genes comprendidos en la regin v ir. &a parte C de la transparencia ilustra un sistema basado en un vector binario. #n 'ste el gen de inter's " los genes vir residen en dos replicones separados capaces de coe%istir " replicarse autnomamente en Agrobacterium. #l replicn +ue contiene el gen de inter's .en general de tama>o pe+ue>o/ se denomina vector binario. #l

replicn +ue contiene los genes vir se denomina pl$smido Ti desarmado .obs'rvese +ue la regin T *a sido completamente eliminada de 'ste elemento/. #l desarrollo de vectores binarios " la disponibilidad de un amplio rango de cepas de Agrobacterium +ue contienen pl$smidos Ti desarmados convirtieron a la transformacin basada en esta bacteria en un m'todo preferencial de transformacin vegetal. Cnicialmente el m'todo para introducir A2( for$neo en un pl$smido Ti cointegrado como el +ue se muestra en la transparencia 22 re+uera introducir un replicn de tipo Col#1 como p?=322 dentro de la regin T del pl$smido Ti. #l A2( +ue se integrable en la regin T se clonaba en un derivado de p?=322 +ue portaba un gen de resistencia a un antibitico. #ste pl$smido se introduca en la cepa de Agrobacterium " la cepa se seleccionada por resistencia a dic*o antibitico. Como el Col#1 no puede replicarse en Agrobacterium el pl$smido p?=322 deber$ cointegrarse al segmento p?=322 *omlogo de la regin T para acceder a una e%presin estable. &a desventa!a principal de esta t'cnica es +ue resulta engorrosa " poco accesible para laboratorios con poca e%periencia en microbiologa. &a venta!a principal es +ue este sistema permite mantener al gen for$neo en un ba!o n9mero de copias dentro de un pl$smido Ti de Agrobacterium. &a transparencia muestra un e!emplo basado en un vector cointegrativo tradicional. &os vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores cointegrativos debido a la f$cil implementacin de su uso en todo tipo de laboratorios. #stos vectores se basan en +ue la regin T " los genes vir se encuentran en dos replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium los productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la regin T procesando " transfiriendo el A2( T a la c'lula vegetal. #l pl$smido +ue contiene la regin T es denominado vector binario mientras +ue el replicn +ue lleva los genes vir se denomina pl$smido hel"er o pl$smido Ti desarmado. #n general el pl$smido hel"er contiene deleciones de la regin T " es incapa1 de generar tumores. #n la transparencia 23 se muestran cuatro tipos de pl$smidos binarios todos los cuales contienen genes con secuencias no *omlogas +ue confieren resistencia a Ianamicina. &os pl$smidos binarios son pe+ue>os " f$ciles de manipular tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium. Aeneralmente contienen sitios m9ltiples para en1imas de restriccin dentro de la regin T donde puede clonarse f$cilmente el gen de inter's. )uc*os de los primeros pl$smidos binarios tienen los genes de seleccin para plantas cerca del borde derec*o .por e!emplo p?C(17/. )$s recientemente los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de seleccin para plantas m$s cerca del borde i1+uierdo lo +ue asegura +ue el gen de inter's sea transferido antes +ue el gen selector .por e!emplo pAreen0027/. 2ebe recordarse +ue el borde derec*o precede borde i1+uierdo en la transferencia del A2(T. )uc*os vectores fueron dise>ados con propsitos especficos " contienen diferentes genes selectores promotores " se>ales de poliadenilacin. &a tabla de la transparencia 2- refle!a la optimi1acin gradual e%perimentada desde la introduccin de los primeros vectores. #llo *a permitido incrementar la fle%ibilidad de los sistemas de vectores para distintos usos en un amplio rango especies vegetales. &os genes selectores m$s com9nmente usados en bacterias son los de resistencia a Ianamicina gentamicina tetraciclina " estreptomicina "5o espectinomicina. Tambi'n *a ocurrido una progresiva reduccin del tama>o de los pl$smidos binarios. &os pl$smidos "$%$ poseen un origen de replicacin "&'( cu"a secuencia es considerablemente m$s corta +ue las de otros orgenes de replicacin como ")*+ o )i. ,or ello los vectores con orgenes de replicacin tipo p@41 tienen un tama>o menor comparado con los +ue poseen los orgenes de replicacin ")*+ o )i. #l "Green usa un locus de replicacin

"'a m$s pe+ue>o subdividido en el origen de replicacin "'a ori " el gen de la replicasa "'a .re" A/. #l gen de re" A proviene de un pl$smido ."sou"/ de Agrobacterium " permite la replicacin de "Green en trans. &os vectores binarios +ue *o" se utili1an proveen un amplio n9mero de genes selectores para plantas. #sta gama de genes permite as responder a re+uerimientos de las t'cnicas de cultivo de te!idos " e%pandir el rango de especies transformables. 2e esta forma se *an desarrollado en muc*os casos diversas versiones de un mismo vector binario. #l vector "Green por e!emplo permite reali1ar distintas combinaciones de genes selectores con el propsito de desarrollar protocolos de seleccin con uno o m$s marcadores. #ste grado de fle%ibilidad permitir$ tambi'n la incorporacin de nuevos genes selectores en el futuro. #n la ma"ora de los casos la seleccin se basa en el agregado de una sustancia t%ica para el te!ido no transformado al medio de cultivo .seleccin negativa/. Al e%presarse en las c'lulas transformadas el gen selector permite su supervivencia " la regeneracin de plantas a partir de las mismas. &os genes de resistencia a antibiticos *an sido frecuentemente utili1ados como selectores. #l m$s utili1ado de ellos es el gen n"t,, +ue confiere resistencia al antibitico Ianamicina. Etros genes ampliamente utili1ados son los +ue confieren resistencia a espectinomicina e *igromicina " los +ue confieren resistencia a *erbicidas como glufosinato " glifosato. #l uso de un determinado selector est$ vinculado con la susceptibilidad especfica de cada especie vegetal por lo +ue la transformacin de una especie nueva implica generalmente ensa"os con distintos selectores. #s conveniente disponer de m$s de un gen selector si se prev' la necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de inter's. #l debate sobre el uso de genes de resistencia a antibiticos en plantas transg'nicas comerciales promovi la b9s+ueda de selectores m$s aceptables para la percepcin p9blica +ue no poseen propiedades t%icas para el te!ido .seleccin positiva/. Asimismo se *an desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes selectores en el cultivo transg'nico. 0na opcin para evitar el uso de genes de resistencia a antibiticos u *erbicidas es el uso de genes de seleccin positiva llamados as por+ue permiten la proliferacin del te!ido transformado e in*iben la del te!ido no transformado el +ue sin embargo no muere. 0na de las estrategias m$s interesantes de seleccin positiva se basa en la utili1acin de las fuentes de carbono para las cuales se *an usado genes de origen bacteriano +ue permiten la modificacin de manosa o %ilosa .monosac$ridos +ue no pueden ser directamente utili1ados por las plantas/ como genes de seleccin en la transformacin de plantas. #l e!emplo descrito en la transparencia 26 corresponde a la seleccin mediada por el gen de la manosa-6, isomerasa .man A/ el +ue interviene en el pasa!e de manosa-6, a fructosa 6,. 4e compara la eficiencia de transformacin de la remolac*a utili1ando el gen n"t,, " el gen man A. &a parte A de la figura muestra la eficiencia .en porcenta!e/ de brotes transformados usando m'todos de seleccin positiva .manosa-6, isomerasa/ o negativa . n"t,,/. #n la parte ? se observa el porcenta!e de brotes capaces de enrai1ar usando uno " otro m'todo. #ste m'todo de seleccin positiva se *a utili1ado en otros cultivos como cebada tomate " girasol. ,ara evitar la presencia de marcadores resistentes a antibiticos se *an desarrollado varios m'todos +ue permiten su remocin del te!ido transg'nico. &a estrategia m$s sencilla es la co-transformacin de una misma c'lula con dos cepas de Agrobacterium portando construcciones diferentes una conteniendo el transg'n de inter's " otra el gen selector. &a base de esta estrategia consiste en +ue de producirse la cotransformacin ambos transgenes se insertar$n en diferentes regiones del genoma en forma no ligada por lo cual ser$ factible su segregacin posterior en la progenie de la planta transg'nica. Como una alternativa a la co-transformacin se *an desarrollado varios sistemas +ue utili1an elementos transponibles "5o sistemas de recombinacin

sitio-especfico. #stos sistemas re+uieren la e%presin simult$nea de transposasas o recombinasas +ue promueven la delecin especfica de la regin +ue debe ser eliminada. &a eliminacin del gen selector " de la transposasa5recombinasa se reali1a posteriormente por segregacin gen'tica. &a transparencia 28 muestra el dise>o de los dos principales tipos de vectores utili1ados con este propsito. &os de Tipo 1 contienen al gen de la transposasa " al gen selector en el mismo cassette de e%presin mientras +ue en los de Tipo 2 la transposasa es aportada en trans por un vector hel"er. #n los vectores de Tipo 1 las secuencias Ds sobre las cuales act9a la transposasa flan+uean al gen de inter'sG en los de Tipo 2 las secuencias Ds flan+uean al marcador de seleccin. #l gen de la transposasa se muestra como un componente integrante de los vectores de Tipo 1 mientras +ue en el caso de los de Tipo 2 debe ser introducido por cru1amiento a partir de plantas transformadas con una construccin independiente. 0na desventa!a de estos sistemas es +ue la eliminacin " seleccin posterior de las secuencias indeseables en la descendencia consumen tiempos considerables. #stas estrategias no son viables en plantas de propagacin vegetativa para las cuales se *an desarrollado m'todos alternativos. 0n sistema menos complicado como el +ue se muestra en la transparencia 27 implica la delecin de A2( mediante recombinacin de regiones intracromosmicas .CC=/ entre dos secuencias *omlogas. 2ado +ue la frecuencia de CC= es ba!a esto permite una eficiente aplicacin de este sistema. #l vector de transformacin dise>ado .EattE-CC= contiene dos regiones de 3:2 pb de la secuencia de unin .att,/ del bacterifago l +ue rodean al gen de resistencia n"t,, al gen G-$ " al gen tms+. A la i1+uierda del sitio att, se encuentra la secuencia booster de transformacin .T?4/ +ue favorecera el apareamiento de las secuencias att, evitando la recombinacin ilegtimaG tambi'n se encuentra el gen efector +ue ser$ integrado al genoma por el sistema att, .es+uema superior/. &a recombinacin *omloga entre las dos regiones att, permite delecionar un fragmento de :.7 Dpb " produce un transg'n +ue contiene el gen efector " la secuencia T?4 .es+uema inferior/. #l gen tms+ usado como selector codifica una en1ima +ue convierte (A) .naftaleno acetamida/ a la au%ina A(A .$cido naftalen ac'tico/. &as plantas +ue e%presan el gen tms+ producen altos niveles de au%ina +ue evitan el desarrollo de races e inducen la produccin de callos. ,or lo tanto cuando se elimina la regin entre las secuencias att, se *abilita el desarrollo de races " se pueden identificar las plantas positivas. #n la transparencia 30 se muestran resultados obtenidos utili1ando el sistema descrito. 0na construccin similar a la detallada previamente se introdu!o en de e%plantos de *o!as de tabaco " se seleccionaron callos resistentes a Ianamicina. 2espu's de tres a cinco meses se observ +ue varios brotes +ue se *aban desarrollado mostraban una coloracin blanca. Cuando se anali1aron estos brotes por ,C= se observ +ue *aban perdido el gen de resistencia a n"t,, " el gen tms+. ,ara seleccionar plantas de tabaco transg'nicas libres de marcador .panel A se desarrollaron brotes verdes " blancos en medio conteniendo Ianamicina/. #n el te!ido blanco +ue potencialmente *a perdido el marcador n"t,, se ensa" la actividad del gen tms+ .panel ?/. #n medio conteniendo (A) las races con actividad tms2 produ!eron abundantes callos en lugar de races .i1+uierda/ mientras +ue las races regeneradas a partir de te!ido blanco +ue *an perdido el gen n"t,,, debido a +ue tambi'n perdieron el gen tms+, producen races normales .derec*a/. #l sistema +ue se muestra en la transparencia 31 se basa en un sistema inducible por estradiol +ue permite la remocin de A2( en un sitio especfico en plantas transg'nicas de Arabido"sis denominado C&J .por sistema de remocin de A2( Cre.lo/$/. #ste sistema es controlado por otro sistema denominado J@#. Comparado con otros sistemas el sistema C&J puede ser finamente controlado " es altamente eficiente. #ste sistema puede usarse en todo tipo de regeneracin de e%plantos tanto

por organog'nesis como por embriog'nesis som$tica. #l sistema de e%presin inducible J@# se eligi para el sistema C&J. &a recombinasa Cre del bacterifago ,1 +ue reconoce especficamente los sitios lo/$ se ubic ba!o el control del sistema J@#. 2ado +ue el promotor Ele%A--6 tiene una e%presin basal en c'lulas bacterianas la secuencia +ue codifica Cre se interrumpi con un intrn para evitar su e%presin en las mismas. #l marcador de seleccin .gen n"t,,/ se ubic entre las unidades de transcripcin J@# " cre. #n este e!emplo el gen reportero G-$ es utili1ado como gen de inter's. &as tres unidades de transcripcin est$n flan+ueadas por los dos sitios lo/$, de tal forma +ue la recombinacin inducida por estradiol permite la remocin de todos estos componentes " la activacin del gen G-$ por el promotor A10-70. Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens Transparencias 32-36 &os protocolos de transformacin por Agrobacterium tumefaciens son en rasgos generales mu" similares. &a base de la t'cnica radica en poner en contacto el e%planto +ue se va a utili1ar para transformar con la cepa de Agrobacterium crecida en condiciones apropiadas. 2e acuerdo con la cepa utili1ada el re+uerimiento de antibiticos puede ser diferente. #n general las cepas de Agrobacterium se cultivan en medio &? suplementado con )g4E- en presencia de los antibiticos re+ueridos. #l Agrobacterium se cultiva toda la noc*e a 26-28 KC. #n el caso de la transformacin de *o!as de tabaco se cortan discos de *o!a .e%plantos/ de apro%imadamente 1 cm de di$metro. #l e%planto se coloca en una ca!a de ,etri +ue contiene medio )4 l+uido " el cultivo de Agrobacterium. 4e incuba unos minutos en presencia de la bacteria " luego se pasa a un medio )4 slido en presencia de las *ormonas A(A " ?A, para inducir la formacin de brotes. &uego los e%plantos se traspasan a un medio )4 slido suplementado con los antibiticos re+ueridos para seleccionar slo a+uellos brotes +ue *a"an incorporado el A2(-T " cefota%ime un bacteriost$tico +ue in*ibe el crecimiento de Agrobacterium. &os e%plantos se repican cada 3 semanas durante 2 meses. Cuando se obtienen los brotes estos se pasan a medio )4 slido suplementado con los agentes de seleccin pero en ausencia de *ormonas para favorecer el desarrollo de races " tallos. &as plantas +ue enra1an en medio con seleccin se pasan a tierra en invernadero. &a transparencia 33 ilustra este proceso. ,anel A3 control de seleccin3 e%plantos +ue no fueron incubados con Agrobacterium para confirmar +ue el agente selector est$ actuando. ,anel ?3 control de regeneracin3 para confirmar +ue las *ormonas est$n actuando dado +ue en ausencia de agente selector se observa regeneracin de brotes. ,aneles C 2 # " B3 transformantes en medio suplementado con *ormonas " agente selector. #n el panel B se observa +ue el brote es capa1 de enrai1ar en medio suplementado con el agente selector. &a transparencia 3- ilustra la transformacin de so!a a partir de cotiledones mediante Agrobacterium " usando *igromicina como agente selector. #l uso de *igromicina como agente selector disminu" el n9mero de escapes .plantas no transformadas/. A3 e%plantos obtenidos a partir de plantas de so!a de : das de edad. ?3 cotiledones incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C3 e%plantos incubados en medio de induccin de tallos durante 28 das los primeros 1- das en ausencia de *igromicina " los segundos 1- das en presencia de *igromicina. # B A3 evolucin de los e%plantos en medio selectivo conteniendo *igromicina durante - meses. H3 plantas seleccionadas in vitro de una altura de - cm. C3 plantas transferidas a tierra en condiciones de invern$culo. #l protocolo de transformacin de Arabido"sis thaliana por Agrobacterium es e%tremadamente simple " la eficiencia de transformacin radica fundamentalmente en

el buen estado fisiolgico de las plantas durante el proceso de transformacin " fecundacin. &a transparencia 3: muestra pasos de este protocolo. 0na ve1 +ue las plantas florecen .panel A/ se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens +ue lleva el gen de inter's en un vector binario. #l cultivo de Agrobacterium se resuspende en una solucin de sacarosa al :L " la planta se sumerge en la solucin de bacterias de!ando en contacto las flores durante unos segundos con agitacin suave .panel ?/. &uego las plantas se cultivan normalmente *asta la obtencin de semillas .panel C/. 0na ve1 obtenidas las semillas se recolectan se secan " se esterili1an usando $cido clor*drico. &as semillas transformadas se seleccionan durante 6 a 10 das en medio )4 slido en presencia del agente selector. #l panel 2 muestra las plantas potencialmente transformadas +ue crecieron en el medio selectivo. &a transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un protocolo de una transformacin est$ndar mediado por Agrobacterium tumefaciens. #stos tiempos son variables " dependen de la especie a ser transformada la variedad elegida el e%planto utili1ado " el protocolo elegido para la seleccin. Etro de los usos posibles de los sistemas basados en A. tumefaciens es la mutag'nesis por insercin con A2(-T insert$ndose 'ste tericamente al a1ar en cual+uier sitio de la eucromatina " representando un marcador molecular de secuencia conocida .tag/ en el sitio de insercin. ,ueden generarse as colecciones de mutantes estables para estudios de gen'tica inversa. Protocolo de transformacin mediante Agrobacterium rhizogenes Transparencias 38--2 Agrobacterium rhi0ogenes induce la formacin de races en forma de cabellera . hair roots ver transparencia 37/ en plantas dicotiledneas debido a la incorporacin del A2(-T contenido en el pl$smido =i al genoma de la planta *u'sped. 4e muestra el sobre crecimiento de races en discos de remolac*a transformadas con el pl$smido =i de A. rhi0ogenes. Cnicialmente se pens +ue la transformacin va Agrobacterium rhi0ogenes era un m'todo de eleccin dado la facilidad para rescatar plantas transformadas a partir de races inoculadas con esta bacteria en comparacin con las dificultades +ue implica el rescate a partir de tumores de Agrobacterium tumefaciens. 4in embargo una ve1 +ue el pl$smido Ti fue e%itosamente desarmado " estuvieron disponibles vectores no oncog'nicos la transformacin con Agrobacterium tumefaciens pas a ser rutina " la utili1acin de Agrobacterium rhi0ogenes se vio restringida a usos especficos. &as plantas transformadas con Agrobacterium rhi0ogenes pueden rescatarse a partir de pelos de e%plantos transformados .cada pelo representa un evento individual de transformacin/ mediante el uso de medios *ormonales adecuados. 4in embargo las plantas transformadas " sus progenies son morfolgicamente anormales .panel inferior de la transparencia -0/ " presentan el denominado fenotipo =i .entrenudos cortos *o!as retorcidas etc./. &a transformacin de races por Agrobacterium rhi0ogenes *a encontrado una importante aplicacin alternativa. &as races de las plantas en su estado natural son capaces de sinteti1ar una e%traordinaria diversidad de metabolitos secundarios " las races transformadas tienen el potencial de capitali1ar esta *abilidad. 2ebido a +ue las races son capaces de proliferar indefinidamente in vitro con altas tasas de crecimiento esta *abilidad podra ser usada para la produccin de altos niveles de metabolitos secundarios en cultivos en gran escala.

&a transparencia -1 resume el procedimiento utili1ado para la transformacin mediada por Agrobacterium rhi0ogenes. Cnicialmente se clona el gen de inter's en un vector intermediario +ue contenga el A2(-T del pl$smido =i. &uego se transforma Agrobacterium rhi0ogenes con este vector intermediario el +ue slo se va a poder replicar como un cointegrado con el pl$smido p=i. #l cultivo de Agrobacterium rhi0ogenes se co-cultiva con los e%plantos .en este caso tallos decapitados/ " 'stos se transfieren a un medio donde se induce la formacin de races transformadas. &uego las races se transfieren a un medio apropiado para inducir la formacin de tallos a partir de los cuales se regeneran plantas enteras. &as plantas gen'ticamente transformadas se transfieren a invernadero. Genes reporteros Transparencias -3-:2 &os genes reporteros son ampliamente usados en muc*os vectores de e%presin para medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Cdealmente un gen reportero debe ser f$cil de ensa"ar si es posible en condiciones no destructivas del te!ido. 4e re+uiere tambi'n +ue la actividad endgena asociada al gen reportero sea mu" ba!a o ine%istente en las plantas a transformar. Actualmente se cuenta con un pe+ue>o n9mero de genes reporteros de uso frecuente siendo los m$s utili1ados el de la glucuronidasa la protena de fluorescencia verde los de luciferasa " en menor grado el de cloranfenicol acetiltransferasa. &a transparencia -- enumera los orgenes " tipos de ensa"os +ue se utili1an para detectar las actividades asociadas con estos genes. &os genes reporteros *an utili1ados desde mu" temprano como indicadores de +ue la transformacin vegetal realmente *a ocurrido. #n general los genes reporteros son codificados por en1imas +ue act9an sobre sustratos +ue normalmente no est$n presentes en la c'lula *u'sped. 0no de los genes reporteros m$s com9nmente utili1ado en plantas es el gen de la -glucuronidasa .uidA/ de Escherichia coli. &a protena A04 es bastante estable " conserva su actividad a9n cuando est$ fusionada a otras protenas. &a actividad A04 puede detectarse a trav's de una sencilla reaccin *isto+umica usando una variedad de sustratos +ue est$n disponibles comercialmente. 2esafortunadamente la ma"ora de los sustratos son caros " la reaccin *isto+umica es destructiva por lo +ue este ensa"o no puede reali1arse en te!ido vivo. 4in embargo la deteccin de la actividad A04 es mu" sensible pudi'ndose detectar a nivel de unas pocas c'lulas. &a transparencia -: muestra la tincin de vulos sacos embrionarios " lculos enteros de Arabido"sis thaliana mediante la reaccin *isto+umica de la en1ima -glucuronidasa luego de la infiltracin con Agrobacterium tumefaciens. #n este caso el gen uidA est$ regulado por un promotor constitutivo " lo +ue se visuali1a son los te!idos inicialmente transformados por este m'todo. A3 fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos te>idos. ?3 Botografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vulos completamente te>idos " vulos no te>idos. C3 Tincin del embrin o saco embrionario en ve1 del vulo entero. 23 Cavidad del lculo completamente te>ido. &os genes reporteros son com9nmente usados para e%plorar la locali1acin espaciotemporal de la e%presin g'nica. ,ara ello las regiones reguladoras de los genes +ue se desea estudiar son ligadas al gen reportero " las construcciones as obtenidas son transferidas al genoma de la planta. #l panel de la parte superior de la transparencia -6 muestra la e%presin del gen reportero uidA mediada por el promotor te!ido especfico At"T+ en flores " frutos de Arabido"sis thaliana. 1/ #%presin del gen uidA en flores 2/ &a e%presin del gen uidA es confinada a la porcin entre la silicua " el

pecolo. 3 " -/. Cortes *istolgicos del fruto donde se observa la e%presin del gen uidA en c'lulas del estrato superior .3/ " en algunas c'lulas del te!ido vacuolar .-/. #l panel de la parte inferior de la transparencia muestra la e%presin del gen reportero uidA ba!o la regulacin de un promotor te!ido especfico At"T+ en races de 1icotiana tabacum. .:/ " .6/3 Botografas de las races completamente te>idas debido a la e%presin del gen uidA. .6/3 Corte transversal de ra1 mostrando la e%presin del gen uidA. &os genes reporteros se utili1an tambi'n para la puesta a punto " seguimiento de un sistema de transformacin. &a transparencia -6 muestra embriones cigticos inmaduros de %ea ma s co-cultivados con agrobacterias +ue portan una construccin en +ue el gen uidA es dirigido por un promotor constitutivo. #n el panel A se observa la distribucin de puntos a1ules .e%presin transitoria del gen uidA/ en embriones cigticos de ma1. #n el panel ? se observa la e%presin estable del gen uidA en callos +ue emergieron de un 9nico embrin. #l callo de la derec*a no muestra actividad A04 por+ue proviene de un embrin no transformado. #l panel C muestra un segmento de *o!a aislada de una planta transg'nica +ue e%presa el gen uidA. &a *o!a de la derec*a proviene de una planta no transg'nica .control negativo/. #l panel 2 muestra plantas transg'nicas de ma1 en invernadero e%presando el gen uidA. Ae2uorea victoria es una medusa con puntos luminiscentes en sus bordes .transparencia -8 panel inferior i1+uierdo/. &a lu1 proviene de una masa de te!ido amarillo +ue contiene entre 6.000 a 6.000 c'lulas fotog'nicas. #l citoplasma de estas c'lulas contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia. #stos componentes son una fotoprotena +ue se activa por Ca2M .ae+uorina/ +ue emite lu1 a1ul " verde " una protena accesoria la green fluorescent "rotein .AB,/ +ue acepta energa de la ae+uorina " re-emite esta energa como lu1 verde. &a fluorescencia intrnseca de la protena AB, se debe a una unin covalente a un cromforo +ue se forma por modificaciones postranscripcionales de la protena " +ue involucran el ciclado " la o%idacin de los residuos 6:-66 .4er-T"r-Al"/. #l A2(c de AB, fue clonado " e%presado en varios organismos procariotas " eucariotas como bacterias levaduras nematodos Droso"hila " mamferos. &a protena AB, tiene las caractersticas de un gen reportero deseable. 4u e%presin es autnoma e independiente de la locali1acin celular " se re+uiere solamente la presencia de lu1 0@ o a1ul " de o%geno para la emisin de la fluorescencia verde. Adem$s AB, permanece activa cuando otras protenas se fusionan a su e%tremo C- " (- terminal sin afectar tampoco la distribucin o compartimentali1acin de la protena fusionada. 4in embargo la e%presin de AB, en plantas presenta ciertos problemas +ue deben ser tenidos en cuenta3 a/ la fluorescencia endgena +ue puede presentar las plantas puede confundir la interpretacin de los resultadosG b/ la presencia de secuencias +ue codifican intrones crpticos puede llevar a la sntesis de una protena inactivaG c/ la obtencin de radicales libres debido a la fuerte e%presin de AB, puede resultar en muerte celular. ,ara evitar estos problemas se *an reali1ado varias modificaciones a la secuencia codificante de AB,3 a/ el uso de codones fue modificado para evitar el reconocimiento de intrones crpticos por la ma+uinaria de s"licing de la plantaG b/ la serina 6: se reempla1 por una treonina para aumentar la luminiscencia de la protena original " c/ se adicionaron se>ales de transporte +ue permitieron la e%presin de AB, en organelas donde los efectos t%icos pueden tolerarse me!or. &a transparencia -7 muestra la e%presin de AB, ba!o microscopio de epifluorescencia usando e%citacin de lu1 a1ul. #n los paneles A " ? se muestra la e%presin del gen de AB, utili1ando un promotor especfico de polen . 3AT45 de tomate/. #l polen e%presando AB, se desarroll como una *erramienta para rastrear el movimiento del polen transg'nico en el ambiente. &as fotos muestran polen de 1icotiana tabacum cv 6anthi +ue e%*ibe una segregacin mendeliana 131 .AG -00% de

aumento/ " polen segregante transg'nico " no transg'nico sobre los pelos de la pata de una abe!a .?G 100% de aumento/. &os paneles C " 2 muestran e%presin de AB, en plantas transg'nicas de Arabido"sis thaliana. #l panel C muestra cuerpos fusiformes dentro del retculo endopl$smico en c'lulas corticales del tallo. &a protena AB, *a sido dirigida al retculo por adicin de una secuencia de ancla!e H2#&. #l panel 2 muestra c'lulas epidermales de *o!a +ue e%*iben fluorescencia en los tonoplastos " sub-poblaciones de vacuolas dentro de una vacuola central. #l panel # muestra un cultivo de c'lulas en suspensin de la lnea ?N2 de tabaco transformadas con el gen G-$ en las +ue se observa acumulacin de la protena AB, dentro del retculo endopl$smico. &a transparencia :0 muestra plantas de tabaco transg'nicas +ue e%presan el gen gf" ba!o el promotor At'7C+ de la protena de transporte de sacarosa en c'lulas del floema de Arabido"sis thaliana. &as plantas At40C2-AB, se e%aminaron usando un microscopio confocal para locali1ar la e%presin de AB, e identificar los patrones de desarrollo del floema en diferentes estadios del desarrollo. &a parte superior de la transparencia muestra el desarrollo basip'talo del floema .desde la base *acia la punta de la *o!a/ de la vena ma"or en los cotiledones. AB, se e%presa inicialmente en la vena central .vena clase CG A " ?/ " luego se e%tiende *acia la punta de la *o!a .vena clase CCG C/. Binalmente se e%presa alrededor de la base de la *o!a .2 # " B/. &a parte inferior de la figura muestra el desarrollo acrop'talo de la vena central en *o!as inmaduras. &a descarga de AB, dentro de las *o!as inmaduras en desarrollo ocurre inicialmente desde la vena clase C .A " ?/ sigue por la parte basal de las venas clase CC .C " 2/ " finali1a en la parte apical de las venas clase CC .# " B/. &os genes reporteros no destructivos pueden usarse para observar el desarrollo de ciertos fenmenos biolgicos en tiempo real. &a transparencia :1 muestra la e%presin de AB, en tabacos transg'nicos de 1icotiana benthamiana. #l gen gf" esta dirigido por un promotor constitutivo +ue permite su e%presin en todos los te!idos. #l propsito del ensa"o es mostrar el desencadenamiento del fenmeno de silenciamiento g'nico postranscripcional en plantas transg'nicas en las +ue este fenmeno *a sido inducido artificialmente. &a presencia de la protena AB, se revela por la aparicin de color verde o amarillo ba!o iluminacin ultravioleta. #n ausencia de AB, el te!ido se observa de color ro!o debido a la fluorescencia de la clorofila. A3 Ho!a de una planta de 1icotiana benthamiana no transg'nica +ue emite fluorescencia ro!a debido a la presencia de clorofila. ?3 Ho!a de una planta transg'nica de 1icotiana benthamiana +ue emite una fuerte fluorescencia verde debido a la e%presin del transgen gf". C3 ,lanta transg'nica para gf" infiltrada 18 d antes con Agrobacterium tumefaciens portador del gen reportero gf" en +ue se puede observar la progresin del silenciamiento de AB, en una *o!a inferior .flec*a/. 0n gen reportero no destructivo menos utili1ado .b$sicamente por el costo de los sustratos " por los tiempos implicados en el ensa"o/ es el de la luciferasa. &a transparencia :2 muestra una planta de 1icotiana tabacum e%presando el gen 3uc de $hotinus " ralis ba!o el promotor constitutivo 3:4 de Cauliflower mosaic virus. &a deteccin de fluorescencia se reali1 sobre una pelcula fotogr$fica e%puesta por varios das a la emisin de la planta. #l ensa"o se basa en la medicin de los niveles de lu1 producidas en una reaccin catali1ada por la en1ima luciferasa3 AT, M luciferina M E2
luciferasa

o%iluciferina M ampicilina M ,,i M CE2 M lu1

&a intensidad de lu1 emitida es proporcional a la actividad de la en1ima luciferasa la +ue a su ve1 es dependiente de la temperatura. &a temperatura ptima para la actividad de la luciferasa es de entre 20 " 2: OC.

Sistemas de transferencia directa de ADN Transparencias :3-77 &os diferentes m'todos desarrollados para la transformacin gen'tica de plantas pueden agruparse en dos clases principales de acuerdo con el mecanismo utili1ado para la transferencia de A2(. Como muestra la transparencia - en una clase se encuentran a+uellos m'todos basados en la utili1acin de vectores biolgicos como el Agrobacterium o los virus vegetales " en otra clase a+uellos +ue consisten en la transferencia directa del A2(. #l rango natural de *ospedantes de Agrobacterium se constitu" en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar monocotiledneas " algunas dicotiledneas +ue no eran susceptibles a la bacteria. #n consecuencia se desarrollaron m'todos alternativos de transferencia de A2( basados en procedimientos de naturale1a +umica fisico+umica o mec$nica. #stos nuevos m'todos conocidos como de transferencia directa permiten transferir A2( desnudo sin la mediacin de vectores biolgicos. #ntre estos 9ltimos se inclu"en m'todos tales como el bombardeo con micropartculas .biobalstica/ la permeabili1acin de membranas celulares inducida por corrientes el'ctricas .electroporacin/ "5o por tratamientos +umicos con policationes .,#A ,@,/ o fusgenos lipdicos la abrasin con fibras de carburo de silicio " la microin"eccin. #l bombardeo de micropartculas es el m$s ampliamente utili1ado. &os m'todos de transferencia directa presentan diversas venta!as " desventa!as al ser comparados con los m'todos mediados por vectores biolgicos. #ntre las venta!as3 a/ son considerados universales por+ue al no incluir organismos vectores pueden aplicarse a cual+uier especie independientemente de su susceptibilidad a la infeccin por parte de los mismos. #s decir +ue su e%presin no ser$ dependiente de la interaccin vector-*ospedadorG b/ no re+uieren la eliminacin de las c'lulas del organismo vector de los te!idos o plantas transg'nicas como sucede en la transformacin mediada por AgrobacteriumG c/ las construcciones son m$s simples " pe+ue>as "a +ue no son necesarias secuencias particulares como las de la regin vir o los bordes del pl$smido TiG d/ es m$s f$cil la co-transformacin con dos o m$s genesG e/ son 9tiles para estudiar funcin " regulacin g'nica como as tambi'n actividad de promotores "a +ue en este tipo de m'todos la e%presin transitoria suele ocurrir en forma mu" temprana. #l transg'n puede ser transcripto en el n9cleo " traducido en el citoplasma independientemente de su integracin al genoma nuclear. #ntre sus desventa!as3 a/ pueden conducir a una alta frecuencia de re-arreglos del transg'nG las c'lulas transformadas generalmente contienen secuencias fragmentadas del transg'n " del vector en varios sitios del genomaG b/ la insercin de m9ltiples copias del transg'n es m$s frecuente +ue en el caso de los sistemas basados en vectores biolgicos. #stas dos cuestiones implican +ue en la transformacin directa e%iste una ma"or probabilidad de ocurrencia del silenciamiento g'nico tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. ,or regla general con el fin de atenuar su incidencia de este fenmeno se recomienda tomar ciertas precauciones3 a/ reducir el n9mero de transgenes a transferir b/ evitar el uso de m9ltiples copias del mismo promotor o terminador " c/ evitar el uso de promotores " transgenes con un alto grado de similitud a promotores o genes endgenos.

Transformacin por biobalstica o bombardeo de micropartc las Transparencias ::-82 #l t'rmino ;biobalstica< deriva de la con!uncin de ;biolgico " balstica< o dic*o de otro modo ;balstica biolgica<. #s com9n referirse a este m'todo como bombardeo de partculas bombardeo de micropartculas aceleracin de partculas m'todo del ca>n g'nico etc. &a biobalstica fue ideada " refinada por Po*n 4anford T*eodore Dlein #dQard Rolf " (elson Allen en la 0niversidad de Cornell en los a>os 80. #ste procedimiento consiste en la utili1acin de partculas microscpicas .micropro"ectiles/ cubiertas con mol'culas de A2( o de A=( +ue son acelerados a alta velocidad para atravesar la pared " las membranas celulares. 0na ve1 +ue las partculas son atrapadas en las c'lulas el A=( puede ser traducido directamente o el A2( puede ser transcripto " traducido lo +ue permite observar e%presin transitoria entre 2- " 62 *oras despu's del bombardeo. 4i las partculas bombardeadas son atrapadas en el n9cleo el A2( puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinacin al a1ar lo +ue se considera como un evento de transformacin estable. &a transformacin estable ocurre a mu" ba!a frecuencia por lo +ue es necesario utili1ar un sistema de seleccin in vitro +ue permita distinguir c'lulas transformadas " no transformadas. #l primer ca>n g'nico era similar a una pistola de calibre 22 en la +ue un percutor generaba una e%plosin de plvora impulsando una bala de pl$stico .macropro"ectil/ con las partculas de metal .micropro"ectiles/ " A2( o A=( *acia el te!ido blanco. #n 1786 Dlein et al. reportaron +ue era posible introducir A2( plasmdico en c'lulas epid'rmicas de Allium ce"a mediante bombardeo con partculas de tungsteno " +ue el gen marcador cat de la en1ima cloranfenicol acetiltransferasa era e%presado en niveles mu" altos. ,oco despu's numerosos investigadores pusieron a prueba este m'todo en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. 2esde entonces el bombardeo de micropartculas se constitu" en el segundo m'todo de transformacin gen'tica de plantas m$s empleado luego del de Agrobacterium. #l bombardeo de micropartculas es considerado un mecanismo universal "a +ue por su naturale1a permite introducir A2( desnudo virtualmente en cual+uier tipo de te!ido o c'lula. Ha sido utili1ado para introducir " e%presar material gen'tico no slo en el genoma de plantas superiores sino tambi'n en bacterias proto1oarios algas *ongos c'lulas " te!idos animales .insectos peces aves " mamferos/ " a9n animales " plantas in vivo. Hasta el presente constitu"e el 9nico medio +ue permite transformar organelas celulares como mitocondrias " cloroplastos de modo reproducible. 4e *an identificado varios par$metros fsicos +umicos " biolgicos +ue interact9an entre s " +ue condicionan la eficiencia del bombardeo de micropartculas " la integracin del material gen'tico transferido. #n consecuencia al establecer un protocolo de transformacin es necesario optimi1ar cada par$metro en forma independiente priori1$ndolos por la magnitud de sus efectos " luego determinar sus interacciones en una escala m$s limitada. #n la transparencia :8 se enumeran los factores +ue influ"en en la transferencia del A2( " los relacionados con las construcciones gen'ticas utili1adas. &a transparencia :7 enumera los factores biolgicos +ue condicionan la eficiencia de un ensa"o biobalstico en relacin con el te!ido blanco a ser utili1ado en la transformacin. 2esde la aparicin del primer dispositivo para bombardeo de micropartculas en los a>os 80 se *an desarrollado diferentes ca>ones g'nicos con el ob!etivo de refinar la t'cnica incrementando su seguridad simplicidad " eficiencia. Adem$s se procur da>ar menos el te!ido aplicar una ma"or aceleracin a las micropartculas " ba!ar los

costos de operacin. &os nuevos dise>os inclu"en en su ma"ora3 a/ el uso de una fuer1a impulsora reproducible " precisamente reguladaG b/ el uso de un macropro"ectil +ue permite acelerar a las micropartculas depositadas sobre su superficie. Adem$s en general estos dispositivos incorporaron una c$mara de vaco en la +ue se reali1a el disparo lo +ue permite disminuir la desaceleracin de las micropartculas por el ro1amiento con el aire. &a transparencia 60 enumera distintos sistemas de impulsin basados en3 a/ e%plosin +umica de plvora secaG b/ descarga de *elio a alta presinG c/ descarga de aire CE2 o (2 comprimidoG d/ descarga el'ctrica de alto volta!e " ba!a capacitancia o de ba!o volta!e " alta capacitanciaG e/ flu!o de partculas o flu!o de *elio a ba!a presin por aspersinG f/ flu!o de *elio con ca>n de precisin. &a eleccin del sistema de impulsin influ"e considerablemente en el n9mero de partculas +ue impacta por unidad de $rea bombardeada. &a figura de la transparencia 60 muestra el ca>n g'nico original ideado por 4andford " colaboradores. #l ca>n g'nico desarrollado inicialmente en la 0niversidad de Cornell .transparencia :6/ operaba de forma similar a una pistola en la +ue un macropro"ectil acelerado por e%plosin de plvora liberaba una salva de micropro"ectiles met$licos revestidos de A2( en el interior de las c'lulas blanco. &os primeros bombardeos se efectuaron con micropro"ectiles de tungsteno de - m de di$metro suspendidos en H2E depositados sobre un macropro"ectil de Tefln. #l macropro"ectil era acelerado por e%plosin de plvora a una velocidad de unos 800 m5seg *acia las c'lulas blanco situadas a 10-1: cm de la salida del ca>n. Como se muestra en el es+uema luego del impacto el macropro"ectil +uedaba retenido en una placa de retencin ubicada en la e%tremidad del tubo de aceleracin. &os micropro"ectiles eran impulsados *acia el te!ido blanco a trav's de un orificio e%istente en la placa. Aun+ue el modelo de plvora permiti la transferencia de A2( a diferentes especies las dificultades para controlar la potencia del disparo en forma reproducible " el da>o fsico provocado a las c'lulas limit el n9mero de transformaciones estables. #ntre las modificaciones m$s notables introducidas al dise>o de los ca>ones g'nicos figura el reempla1o de la carga de plvora por presin de gas para generar el impulso de las micropartculas. #l primer dispositivo +ue utili1 esta forma de impulsin fue el ca>n ,24-1000 de 2upont basado en una descarga de *elio o nitrgeno comprimido. #l modelo m$s utili1ado en la actualidad es el ca>n de alta presin de *elio ,24-10005He el +ue fue patentado por 2upont " es comerciali1ado por la compa>a ?io=ad .transparencias 61 " 62/. #l mismo consta de los componentes necesarios para la transferencia de alta presin de *elio .regulador del *elio v$lvula solenoide tubos conectores membrana de ruptura/ de un componente portador del macropro"ectil " de una c$mara principal en donde se bombardea el te!ido blanco en condiciones de vaco parcial. Al accionar el sistema se establece vaco dentro de la c$mara de disparo " el *elio es liberado *acia la misma luego +ue la membrana de ruptura se rompe por e%ceso de presin. #l movimiento del *elio a alta velocidad impulsa el macropro"ectil +ue porta las micropartculas recubiertas de A2( las +ue son as aceleradas *acia el te!ido blanco. #ste dispositivo asegura una aceleracin reproducible de las micropartculas " los te!idos resultan menos da>ados +ue en el caso de los ca>ones impulsados por plvora. &as transparencias 63-6- ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo. #l primer paso involucra la preparacin de las micropartculas la precipitacin del A2( sobre las mismas " el ensambla!e de las distintas partes del ca>n +ue comprenden el sistema de impulsin de los micropro"ectiles. ,ara ello se desenrosca el soporte de la membrana de ruptura se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado " se la coloca en el soporte correspondiente. A continuacin se a!usta el soporte al e%tremo del tubo de salid de gas. #l espesor de la membrana de ruptura vara seg9n la presin de *elio con la +ue se +uiera traba!ar .e%isten membranas +ue van de los 300

psi *asta los 2.200 psi/. &a presin de ruptura determina el poder de la onda de c*o+ue +ue impacta en la c$mara. 4i se incrementa la presin de *elio se incrementa la aceleracin de las micropartculas " en consecuencia su penetracin en el te!ido blanco. &a transparencia 6- ilustra los pasos siguientes en la preparacin del ca>n para el bombardeo. 0na ve1 +ue se *a colocado el macropro"ectil sobre su respectivo ret'n se toma una alcuota de las micropartculas recubiertas de A2( " suspendidas en H 2E o etanol " se la deposita sobre el mismo. Cuando la alcuota se seca el ret'n es invertido .de manera tal +ue los micropro"ectiles +ueden enfrentados con las c'lulas blanco/ " colocado en el lan1ador. #n el mismo dispositivo se agrega una malla de retencin +ue frenar$ al macropro"ectil luego de completar su despla1amiento. #n principio cual+uier material puede ser empleado como micropartcula transportadora de A2( siempre +ue sea de alta densidad +umicamente inerte " de tama>o " formato adecuados. &as micropartculas met$licas de oro o tungsteno son las m$s utili1adas. &as de tungsteno son de formato irregular de tama>o de 0 2 a 3 m. 4u costo es bastante reducido por lo +ue son com9nmente elegidas. 4in embargo son potencialmente t%icas para algunos tipos de c'lulas " est$n su!etas a o%idacin r$pida con la consecuente degradacin del A2(. &as micropartculas de oro son biolgicamente inertes de formato redondeado " de tama>o m$s uniforme de entre 0 6 a 3 m. 4u principal desventa!a es su alto costo. &as caractersticas mencionadas deben ser evaluadas en distintos tipos de c'lulas blanco de modo de optimi1ar el proceso de bombardeo. &a transparencia 66 muestra un es+uema de los par$metros +ue pueden variarse en el dispositivo de un ca>n g'nico " de las relaciones e%istentes entre las principales variables " la velocidad de los micropro"ectiles. #n cada bombardeo reali1ado con el ca>n ,2410005He la velocidad +ue alcan1an los micropro"ectiles es condicionada por3 a/ la presin de *elio elegidaG b/ la presin negativa alcan1ada en la c$mara de disparoG c/ la distancia .A/ entre la membrana de ruptura " el macropro"ectilG d/ la distancia .?/ de despla1amiento del macropro"ectil desde su posicin original *asta el impacto contra la malla de retencinG e/ la distancia .C/ de despla1amiento de los micropro"ectiles desde la malla de retencin *asta el te!ido. @ariando la presin " las distancias .A ? " C/ se puede modificar la velocidad de los micropro"ectiles lo +ue permite optimi1ar los protocolos seg9n el ob!etivo de transformacin " te!ido blanco. #%isten modelos alternativos al ca>n ,24 10005He +ue permiten regular la presin del gas a la cual se desea producir el bombardeo. &a regulacin se efect9a por medio de una v$lvula el'ctrica dentro de un rango de presiones de 200 a 1:00 psi. Al accionar un control el'ctrico la fuer1a electromagn'tica generada por un solenoide produce el despla1amiento de una agu!a +ue perfora las membranas de ruptura permitiendo la salida del *elio .en contraste con el ca>n ,2410005He en +ue la membrana de ruptura se rompe pasivamente por e%ceso de presin/. #l dispositivo +ue se muestra en la transparencia 66 fue desarrollado en #)?=A,A-C#(A=A#( .?rasil/ " *a sido utili1ado e%itosamente en la transformacin de Gl cine ma/, $haseolus vulgaris, Goss "ium hirsutum entre otros. #l Aenebooster .transparencia 68/ es otro tipo de ca>n g'nico producido por #&AD .?udapest/ " desarrollado por el Centro de ?iotecnologa Agrcola del Cnstituto de Ciencias @egetales de Hungra. )ediante este dispositivo las partculas son impulsadas *acia el te!ido blanco por liberacin de nitrgeno comprimido a alta presin. #n este caso los controles de presin " vaco se encuentran en una unidad separada de la c$mara de disparo. #l proceso de disparo es controlado por un sistema electrnico autom$tico. &a energa del disparo es a!ustada seg9n el espesor de la pared celular del te!ido blanco. &os a!ustes de los par$metros de cada disparo pueden

ser arc*ivados por una computadora conectada al dispositivo. #ste ca>n *a sido usado con '%ito en la transformacin de 8r 0a sativa " tambi'n para obtener e%presin transitoria en estudios de promotores especficos para diferentes te!idos .*o!a *ipoctilo embrin escutelo callo cotiledn/ de varias especies vegetales. #ntre sus venta!as pueden mencionarse3 a/ control autom$tico de los disparosG b/ registro computari1ado de los a!ustes de cada disparoG c/ control continuo de la energa de disparoG d/ alta penetracin a trav's de paredes celularesG e/ alta frecuencia de transformacin en especies recalcitrantesG f/ ba!o costo .gas barato placas de retencin reciclables/. #n 1776 *i1o su aparicin la pistola g'nica de mano como una alternativa al ca>n ,24 10005He. #n contraste con los ca>ones g'nicos convencionales en +ue el tama>o del te!ido blanco est$ limitado por el tama>o de la c$mara " el e%planto es su!eto a vaco durante el bombardeo este nuevo dise>o no re+uiere vaco permite traba!ar con virtualmente cual+uier tipo de c'lulas o te!ido blanco " provee una *erramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. #l instrumento +ue se muestra en la transparencia 67 es comerciali1ado por la compa>a ?io=ad. &a pistola traba!a con micropro"ectiles de oro recubiertos de A2( o A=( +ue son precipitados en la pared interna de un cartuc*o de pl$stico " acelerados por un flu!o de *elio a presin. #s posible preparar :0 cartuc*os a la ve1 conteniendo cantidades conocidas de micropro"ectiles los cuales pueden conservarse *asta dos meses previos a su utili1acin. &os cartuc*os se colocan en un soporte .figura C/ el cual se ensambla en la pistola " se dispara. #l sistema es r$pido vers$til " permite la co-transformacin con m$s de un transg'n. #n la pr$ctica los dos sistemas de *elio el ca>n ,2410005He " la pistola Helios se complementan dado +ue en el primero el vaco provee condiciones ambientales m$s controladas en su c$mara de disparo mientras +ue el 9ltimo permite traba!ar con una amplia variedad de te!idos o c'lulas blanco incluidos organismos vivos. &a transparencia muestra la pistola g'nica .figura A/ el porta cartuc*os .figura C/ " un dispositivo .figura ?/ utili1ado para preparar *asta :0 cartuc*os por ve1. #l es+uema inferior muestra el dise>o interno de la pistola g'nica. &a pistola g'nica constitu"e una valiosa *erramienta para transferir A2( o A=( en organismos vivos sin utili1ar c$mara de vaco. 2ebido a +ue la pistola puede ser dispuesta mu" cerca del te!ido a ser bombardeado la tra"ectoria de las partculas es reducida " la desaceleracin por friccin es mu" ba!a. #stos cambios reducen el trauma en te!idos fr$giles " facilitan las manipulaciones. 4in embargo los par$metros de bombardeo deben ser a!ustados de acuerdo con el tipo de te!ido blanco. Algunos reportes mencionan +ue una desventa!a del sistema es la poca reproducibilidad entre e%perimentos. 4in embargo este problema es frecuente en todos los sistemas de bombardeo de partculas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales para controlar me!or este problema tales como traba!ar con material vegetal crecido en las mismas condiciones o utili1ar e%plantos de misma edad fisiolgica. &a e%presin transitoria temprana de genes reporteros es e%tremadamente 9til en el monitoreo de la eficiencia de transferencia g'nica " en el a!uste de los par$metros de bombardeo. Asimismo la e%presin transitoria es sumamente utili1ada para estudios de regulacin " funcin g'nica especificidad de promotores etc. &as figuras de la parte superior de la transparencia 61 muestran la e%presin transitoria del gen uid A en embriones inmaduros de centeno. &as diferencias en la e%presin del gen se relacionan con el uso de diferentes cantidades de micropro"ectiles para el bombardeo3 .figura A/ 200 gG .figura ?/ 100 gG .figura C/ 30 g. &as figuras de la parte inferior muestran la diferencia de e%presin transitoria del gen uid A observada en *o!as de Arabido"sis thaliana bombardeadas con una pistola g'nica Helios .presin de disparo

6: psi/ usando 12: g de micropartculas de oro " 1 g de A2( por disparoG con o sin malla difusora de micropartculas .A " ? respectivamente/. #l Aenebo" es una pistola de mano #&AD .?udapest/ " desarrollado por el Centro de ?iotecnologa Agrcola del Cnstituto de Ciencias @egetales de Hungra. )ediante este dispositivo las micropartculas son impulsadas *acia el te!ido blanco por liberacin de CE2 a presin. ,ueden utili1arse contenedores manuales de gas de diferente capacidad para m9ltiples disparos. #sta pistola se *a utili1ado con '%ito en la produccin de plantas transg'nicas de ma1. #ste sistema permiti la transferencia de A2( in vivo en te!idos meristem$ticos de especies le>osas como dura1no man1ana etc. #ntre sus venta!as m$s importantes caben mencionar3 a/ ba!o costoG b/ no re+uiere uso de c$mara de vacoG c/ alta eficiencia de penetracin a trav's de paredes celularesG d/ alta frecuencia de transformacin en especies recalcitrantesG e/ f$cil mane!o en condiciones de campo. Etro sistema biobalstico alternativo se basa en la tecnologa ACC#&&S desarrollada por la compa>a Agracetus para permitir el m$%imo de fle%ibilidad de a!uste blanco " penetracin celular. #sta tecnologa involucra el uso de una descarga el'ctrica a alto volta!e para evaporar una gota de H2E. &os micropro"ectiles recubiertos de A2( son dispuestos sobre un disco de metal .macropro"ectil/ " posicionados en una c$mara de vaco .transparencia 62/. 0na e%pansin e%plosiva generada por la descarga el'ctrica .apro%imadamente 1- I@ desde un capacitor de 2 B/ en una gota de agua acelera el comple!o macropro"ectil-micropro"ectiles *acia las c'lulas blanco. &a penetracin del te!ido blanco puede ser finamente regulada variando la intensidad de la descarga el'ctrica. )ediante este procedimiento las partculas pueden ser dirigidas a una capa especfica del te!ido. #sta capacidad es un atributo importante del sistema a9n cuando e%plantos id'nticos de diferentes genotipos de la misma especie pueden re+uerir diferentes condiciones de aceleracin para una ptima penetracin de las partculas. &a aceleracin provocada por la descarga el'ctrica reduce el impacto provocado en las c'lulas blanco en comparacin con los sistemas basados en propulsin por gases. 4in embargo a pesar de *aber sido usado con '%ito en la transformacin de numerosas especies " de las venta!as operativas del sistema este sistema no *a sido adoptado en forma generali1ada para la transformacin de plantas. 0n dispositivo de ba!o costo +ue puede usarse como alternativa a los instrumentos m$s sofisticados es el ca>n de c*orro de partculas .,CAG $article ,nflow Gun/. #l mismo puede ser f$cilmente construido en el laboratorio con medios relativamente econmicos. #ste ca>n *ace uso de una v$lvula el'ctrica para generar un c*orro de *elio a ba!a presin el cual acelera las micropartculas dentro de una c$mara de vaco .28-30 pulgadas de Hg/ " las pro"ecta *acia las c'lulas blanco. &a micropartculas recubiertas de A2( son dispuestas en una !eringa con filtro +ue se acopla a un adaptador conectado a la v$lvula solenoide. #ste instrumento *a sido e%itosamente usado para transformar Gl cine ma/, %ea ma s, 9anihot esculenta 9usa s"". #%iste una versin del ,CA en el cual se *a eliminado la c$mara de vaco " +ue se *a usado para transformar 8r 0a sativa. A pesar del ba!o costo del sistema su uso no *a sido tan difundido como el de los ca>ones mencionados anteriormente. 4autter et al. desarrollaron un dise>o alternativo de ca>n g'nico +ue combina caractersticas del m'todo de microin"eccin con la biobalstica. Bue ideado para el bombardeo de meristemas apicales " permite apuntar el disparo en $reas de 100 a 200 m de di$metro. #l te!ido blanco es montado sobre una capa de agarosa en una gota de alginato. (o utili1a macropro"ectiles " el A2( no es precipitado con los micropro"ectiles sino me1clado con los mismos " transferido en con!unto con los mismos en una pe+ue>a gota de l+uido desde un tubo capilar conectado a un tubo

,itot. ,ara romper la gota se usa un flu!o de CE 2 o de (2 a alta presin +ue forma un aerosol " fuer1a a las partculas a trav's de una pe+ue>a apertura .aspersin de gotas microscpicas/. A partir de all las partculas son aceleradas a trav's de un capilar a una c$mara con vaco parcial en +ue se encuentra el te!ido blanco. &a longitud de este 9ltimo capilar determina la velocidad de las partculas " su di$metro determina el $rea de impacto en determinadas condiciones de vaco presin " distancia de traba!o. &os par$metros de disparo pueden adaptarse dentro de un amplio rango. 0n dispositivo de enfo+ue permite dirigir las partculas a un meristema individual. Como se muestra en el es+uema de la derec*a el $rea del blanco es determinada con una mira. #n el mismo se observa el meristema apical de una pl$ntula de cereal luego del bombardeo " la distribucin de las partculas ba!o la mira utili1ada para apuntar el ca>n. #l $rea apuntada tiene un di$metro de 1:0 m. &a segunda capa celular +ue dar$ origen a las c'lulas germinativas se se>ala con el dibu!o de los n9cleos. #ste sistema *a sido utili1ado en diferentes plantas como Triticum aestivum, 'orghum bicolor " otras gramneas aun+ue los resultados obtenidos no satisficieron las e%pectativas para lo cual fue dise>ado. &a transparencia 63 muestra e!emplos de especies de monocotiledneas transformadas por biobalstica !unto con el tipo de te!ido blanco genes reporteros " genes marcadores de seleccin usados.
uid A: gen de la en1ima -glucuronidasa de Escherichia coli. cat: gen de la en1ima cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli luc3 gen de la en1ima luciferasa de $hotinus " ralis bar: gen de la en1ima fosfinotricina acetiltransferasa de 'tre"tom ces h grosco"icus csr:(.als: gen de una forma alterada de la en1ima sintasa del $cido aceto*idro%il tambi'n conocida como acetolactasa sintasa de mutantes de Arabido"sis thaliana. h"t: gen de la en1ima *igromicina fosfotransferasa de Escherichia coli. n"t ,,3 gen de la en1ima neomicina fosfotransferasa CC de Escherichia coli.

A diferencia de la transformacin va Agrobacterium los procedimientos de transformacin por biobalstica no re+uieren el uso de vectores especiales. Como fuente de A2( para el bombardeo es posible utili1ar los pl$smidos com9nmente usados en las manipulaciones de ingeniera gen'tica conteniendo las construcciones gen'ticas de inter's. #n algunos casos se *a obtenido ma"or eficiencia de transformacin cuando los pl$smidos son lineali1ados ! #l promotor m$s ampliamente utili1ado para inducir la e%presin de genes en plantas es el promotor constitutivo 3:4 del virus del )osaico de Coliflor .Ca)@G Cauliflower mosaic virus;. Aeneralmente este promotor brinda altos niveles de e%presin en dicotiledneas. 4in embargo no ocurre lo mismo en monocotiledneas en las +ue se utili1an en forma alternativa promotores como el del gen ubi( .ubi+uitina/ de ma1 " el del gen act( .actina/ de arro1. &a tabla de la transparencia 6- muestra e!emplos de promotores utili1ados en la transformacin de cereales " de sus actividades relativas.
Emu: ,romotor modificado de alco*ol des*idrogenasa de ma1 Act(:Act( intr<n(: ,romotor e intrn de actina de arro1 7bi(:7bi( intr<n: ,romotor e intrn de ubi+uitina de ma1 =4': ,romotor de 3:4 de Ca)@ =4':Adh( intron (: ,romotor de 3:4 de Ca)@ e intrn de alco*ol des*idrogenasa de ma1

&a transparencia 6: muestra e!emplos de especies de dicotiledneas transformadas por biobalstica !unto con los te!idos blanco genes reporteros " genes marcadores de seleccin +ue demostraron ser eficientes.
uid A3 gen de la en1ima -glucuronidasa de Escherichia coli gf"3 gen de la protena de fluorescencia verde de Ae2uorea victoria

bar3 gen de la en1ima fosfinotricina acetiltransferasa de 'tre"tom ces h grosco"icus h"t3 gen de la en1ima *igromicina fosfotransferasa de Escherichia coli n"t ,,3 gen de la en1ima neomicina fosfotransferasa CC de Escherichia coli. csr:(3 gen de una forma alterada de la en1ima sintasa del $cido aceto*idro%il tambi'n conocida como acetolactasa sintasa de mutantes de Arabido"sis thaliana.

Al elegir un te!ido blanco para la transformacin por biobalstica nuevamente debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de inter's para regenerar in vitro. #ntre los e%plantos vegetales utili1ados con ma"or '%ito se encuentran las suspensiones celulares meristemas embriones en desarrollo embriones maduros embriones som$ticos primordios foliares cotiledones " callos. #n la transparencia 66 se muestran algunos e%plantos com9nmente usados en protocolos de biobalstica. 0na de las estrategias ampliamente utili1adas para favorecer la recuperacin de los te!idos luego del bombardeo es la aplicacin de ba>os en antio%idantes para prevenir la o%idacin de los e%plantos. ,ara facilitar el ingreso de los micropro"ectiles en el n9cleo celular los e%plantos suelen ser cultivados en medios conteniendo sustancias osmticas .como manitol/ +ue provocan plasmlisis reversible de las c'lulas. As la menor turgencia de las c'lulas *ace +ue las mismas resulten menos da>adas por el impacto de los micropro"ectiles. ,or otro lado el pasa!e de los e%plantos a medio fresco previo al bombardeo aumenta la tasa mittica favoreciendo as la integracin del A2( for$neo al genoma vegetal. #l bombardeo de micropartculas ofrece una alternativa altamente eficiente e independiente del genotipo para la transformacin de 8r 0a sativa. A la fec*a *an sido transformadas m$s de -0 variedades de arro1 por esta t'cnica. &os e%plantos m$s utili1ados son embriones inmaduros " callos derivados de semillas. #l antibitico preferentemente usado como selector es *igromicina. #l procedimiento se basa en el bombardeo de embriones inmaduros a partir de los cuales se obtienen callos en medio selectivo. #stos callos puede dar lugar a la regeneracin de plantas transg'nicas en medios conteniendo los reguladores de crecimiento adecuados. &a transparencia 66 muestra resultados de transformacin de 8r 0a sativa utili1ando el sistema de bombardeo con micropartculas. #n este caso los e%plantos bombardeados son callos embriog'nicos de 6 variedades de 'lite +ue e%presaron actividad A04 positiva 2- *s despu's del bombardeo. 4e les transfiri simult$neamente el gen bar " el gen h"t. 4e obtuvieron plantas completas a partir de callos cultivados en seleccin con *igromicina " glufosinato de amonio. #n las figuras se observan los callos embriog'nicos transformados la e%presin transitoria del gen uid A en los mismos " la regeneracin de brotes a partir de los callos en seleccin con glufosinato de amonio. &a transformacin por biobalstica puede implementarse eficientemente no slo en el caso del arro1 sino tambi'n en otras especies de monocotiledneas como -estuca arundinacea. &a transparencia 68 ilustra el procedimiento de transformacin de esta especie basado en la induccin de callos embriog'nicos " en el establecimiento posterior de suspensiones celulares embriog'nicas. #stas suspensiones celulares son utili1adas como te!ido blanco para la transformacin por biobalstica. &uego del bombardeo 'stas son puestas en seleccin con *igromicina. #n la transparencia se diferencian las suspensiones celulares transg'nicas .resistentes a la seleccin " de color amarillento/ de las suspensiones susceptibles a *igromicina de color marrn. &a biobalstica es una de las t'cnicas m$s ampliamente utili1adas en la transformacin gen'tica de Gl cine ma/ .so!a/. 2esde *ace m$s de 10 a>os se *an documentado numerosos eventos de transformacin por bombardeo de micropartculas +ue inclu"en el uso de distintos dispositivos de aceleracin como los ca>ones ,24 10005He ,CA o

Accell mencionados anteriormente. &as variedades transg'nicas comerciales tolerantes al *erbicida glifosato *an sido obtenidas por biobalstica. &os te!idos o suspensiones embriog'nicas de so!a as como tambi'n los meristemas apicales son los e%plantos m$s utili1ados en esta especie. #n cuanto a los agentes de seleccin el antibitico *igromicina " el *erbicida ima1ap"r *an sido reportados como los m$s eficientes. &a transparencia 67 muestra diferentes etapas en el proceso de transformacin de so!a. &os cultivos embriog'nicos derivados de cotiledones inmaduros fueron bombardeados con un ca>n g'nico ,24 10005He " puestos en medio de seleccin con *igromicina. A+uellos e%plantos +ue sobrevivieron a la seleccin continuaron siendo cultivados a trav's de diferentes estadios embrionarios *asta su conversin en plantas completas. #n la foto ? puede observarse la e%presin transitoria del gen uidA en un ensa"o *isto+umico. &a biobalstica tambi'n *a sido un instrumento eficiente para la transformacin de 9anihot esculenta Crant1 .mandioca/ a partir de cotiledones. #n la transparencia 80 se observan cotiledones bombardeados .figura A/ con un ca>n g'nico de c*orro de partculas .,CA/ +ue e%presan transitoriamente el gen uidA. A partir de los cotiledones se obtuvieron brotes en seleccin con *igromicina .figuras ? " C/ los cuales regeneraron plantas completas .figuras 2 " #/. 4e constat la e%presin estable del gen uidA en *o!as .figura B/. &as figuras de la transparencia 81 muestran la e%presin transitoria del gen +ue codifica la ,rotena de Bluorescencia @erde .AB,/ en embriones som$ticos de Gl cine ma/ .figuras A " ?/ " Triticum aestivum .figuras C 2 " #/ " la e%presin estable del mismo gen en *o!as de $etunia h brida .figura B/. Todos los e%plantos fueron bombardeados con un ca>n g'nico de c*orro de partculas .,CA/. Punto con los m'todos basados en Agrobacterium tumefaciens el bombardeo de micropartculas es una de las t'cnicas m$s usadas para la transformacin gen'tica de plantas. Asimismo el bombardeo con micropartculas se *a usado con '%ito para transformar animales microorganismos " organelas como cloroplastos " mitocondrias. #l m'todo es sumamente 9til para anali1ar la funcin " regulacin g'nica encarar problemas +ue re+uieren e%presin transitoria o integrativa transferir A=( viral " estudiar vas metablicas. Tradicionalmente se *a ad*erido el A2( a micropro"ectiles de oro o tungsteno para ser transferido pero tambi'n se *a *ec*o lo mismo con bacterias levaduras o fagos. Asimismo se *a utili1ado el sistema de bombardeo como estrategia complementaria en la transformacin mediada por Agrobacterium para provocar orificios en los te!idos blanco " facilitar as la entrada de la bacteria. 4in embargo las t'cnicas de bombardeo presentan limitaciones tal como se discutir$ m$s adelante. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas dada por cutculas endurecidas paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. &a principal limitacin del m'todo contin9a siendo la ba!a relacin entre el total de c'lulas sometidas al bombardeo " el n9mero de c'lulas +ue logran incorporar de manera permanente el transgen. Transferencia de ADN mediada por electroporacin "#o mtodos $ micos Transparencias 83-73 Etro sistema de transferencia directa de A2( se basa en la permeabili1acin de las membranas plasm$ticas de los protoplastos para favorecer el ingreso del material gen'tico. &as paredes celulares representan barreras fsicas significativas para la transferencia de A2( mientras +ue los protoplastos por tratarse de c'lulas desprovistas de paredes celulares constitu"en un tipo de e%planto blanco m$s

apropiado. &a obtencin de protoplastos re+uiere la incubacin de te!ido vegetal en un medio suplementado con en1imas f9ngicas pectocelulolticas para digerir las paredes celulares siendo necesario en algunos casos el agregado de *emicelulasas. &as celulasas " *emicelulasas degradan la pared celular en tanto +ue las pectinasas digieren la matri1 de pectina +ue mantiene ad*eridas a las c'lulas. #l uso de en1imas disponibles comercialmente posibilit el aislamiento de protoplastos de pr$cticamente cual+uier te!ido vegetal siempre +ue el mismo no est' lignificado. &uego de la digestin los protoplastos deben ser aislados " lavados. ,or otro lado con el ob!etivo de optimi1ar la transferencia de A2( a protoplastos se utili1an distintas t'cnicas +ue incrementan la permeabilidad de las membranas plasm$ticas. #s com9n el uso de policationes tales como polietilenglicol .,#A/ polivinil alco*ol .,@A/ " 2#Ade%trano +ue act9an como fusgenos e incrementan la endocitosis del A2( debido a +ue sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del A2( " de la membrana plasm$tica. Adem$s del uso de fusgenos los tratamientos con Ca2M " calor pueden incrementar la precipitacin del A2(. &a obtencin de la primera planta transg'nica viable derivada de protoplastos de 1icotiana sp. se report en 178-. &a transformacin de protoplastos en soluciones +ue contienen ,#A provee frecuencias relativamente ba!as de plantas transg'nicas. 4in embargo debido al gran n9mero de c'lulas disponibles en estos sistemas si se dispone de buenos m'todos de seleccin " de protocolos de regeneracin eficientes es siempre posible obtener plantas transg'nicas. 0na contribucin a la transformacin mediada por ,#A fue la fusin con liposomas. #n este caso el A2( es previamente incorporado a liposomas a partir de las cuales es transferido a las c'lulas. &os liposomas est$n constituidos por lpidos de carga neutra similares a los +ue componen la membrana plasm$tica " pueden ser producidos en diversos tama>os. #l A2( es empa+uetado in vitro " luego transferido a los protoplastos. ,ara *acer m$s eficiente la fusin se utili1an tratamientos con ,#A u otros policationes. Aun+ue el sistema es mu" laborioso " la eficiencia de transformacin es ba!a se *a reportado la obtencin de plantas transg'nicas de tabaco " trigo por esta t'cnica. &a transparencia 8- muestra un es+uema representativo del aislamiento " purificacin de protoplastos de *o!as de 1icotiana tabacum. &as *o!as cosec*adas son puestas en contacto con la solucin en1im$tica durante 16 * al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del te!ido no digerido. 0n m'todo alternativo para permeabili1ar las membranas celulares " facilitar el ingreso del A2( es la electroporacin% la +ue consiste en e%poner a las c'lulas vegetales a intensos campos el'ctricos para provocar la apertura de poros " promover la captura del A2(. &os protoplastos se obtienen siguiendo los pasos mencionados en la transparencia anterior se incuban luego en una solucin buffer conteniendo el A2( .pl$smido con el gen de inter's " el gen de seleccin/ " son e%puestos a pulsos el'ctricos de alto volta!e " de duracin variable. #l campo el'ctrico causa la formacin de poros reversibles en la membrana plasm$tica permitiendo as el pasa!e de A2( a la c'lula. 4e *an determinado las condiciones ptimas para la transformacin de c'lulas de distintas especies inclu"endo la intensidad del campo el'ctrico la densidad de protoplastos " la composicin del buffer de cultivo. &a electroporacin sola no produce altas tasas de transformacin pero la eficiencia puede incrementarse acopl$ndola al uso de policationes como el polietilenglicol .,#A/. &a transformacin por electroporacin *a sido documentada en una amplia variedad de especies " tipos de te!idos pero la disponibilidad de protocolos de regeneracin de plantas enteras a partir de protoplastos resulta una limitante en la ma"or parte de los casos. &a transparencia 8: muestra los pasos a seguir para la transformacin de protoplastos de tabaco por electroporacin. 4e muestran tambi'n distintas tipos de cubetas " electroporadores comerciales.

&a transparencia 86 muestra distintas fases del cultivo de protoplastos electroporados con un gen +ue confiere resistencia a Ianamicina " de la regeneracin de plantas de 1icotiana tabacum a partir de los mismos. A3 protoplastos luego de la electroporacinG ?3 protoplastos cultivados en divisinG C3 protoplastos formando callos en medio con Ianamicina .i1+uierda/ " sin Ianamicina .derec*a/G 23 plantas en medio de enrai1amiento con Ianamicina .planta resistente a la i1+uierda " planta no resistente a la derec*a/G #3 plantas floreciendoG B3 germinacin en medio selectivo. &as plantas transg'nicas contin9an desarroll$ndose mientras +ue las no transg'nicas se tornan clorticas. &a transparencia 86 muestra un es+uema de la transformacin de protoplastos de 8r 0a sativa por electroporacin. #n este protocolo la formacin de callos de los cuales se obtienen los protoplastos se induce a partir de semillas. &uego de la electroporacin los protoplastos son cultivados en medio l+uido !unto a c'lulas nodri1as de tabaco las +ue *an sido elegidas por su alta tasa mittica. &os factores mitog'nicos secretados por las mismas inducen la divisin de los protoplastos. Como se muestra en el panel inferior los protoplastos pueden cultivarse me1clados con las c'lulas nodri1as o separados de las mismas por membranas de tipo )illicell .filtro de n"lon papel de filtro )illipore u *o!a de celof$n/. 0no de los agentes selectores +ue me!or act9an en arro1 es el antibitico *igromicina. #n este caso se reali1 una doble seleccin con *igromicina de los callos obtenidos a partir de protoplastos electroporados antes de inducir la regeneracin de plantas completas. #s tambi'n posible co-transformar protoplastos por electroporacin. #n la transparencia 88 se muestra una etapa del protocolo de transformacin de protoplastos de arro1 con dos pl$smidos diferentes. 0no de los pl$smidos porta el gen hmr de resistencia a *igromicina " el otro el gen de inter's no seleccionable m$s el gen reportero uidA. &uego de la electroporacin los protoplastos son cultivados en medio suplementado con *igromicina. &os protoplastos +ue resisten la seleccin son cultivados en un medio con reguladores de crecimiento para estimular la regeneracin de la pared celular " la divisin celular. &as c'lulas se dividen formando colonias " tras sucesivos subcultivos en diferentes medios regeneran plantas completas por organog'nesis o embriog'nesis. 0n porcenta!e considerable de los protoplastos electroporados incorpora simult$neamente el gen de resistencia a *igromicina el gen de inter's " el reportero " en consecuencia las plantas derivadas de 'stos poseen los dos genes. ,ara diferenciar estas plantas de a+uellas derivadas de protoplastos +ue slo incorporaron el gen de seleccin es necesario determinar la presencia de los genes de inter's en un an$lisis posterior. Aeneralmente esto se reali1a utili1ando la t'cnica de ,C= e iniciadores especficos. &a transparencia 87 muestra fotografas del aislamiento cultivo " electroporacin de protoplastos de Citrus sinensis >naran?o dulce; obtenidos a partir de callos embriog'nicos " del proceso posterior de regeneracin de plantas completas. &os e%plantos e%presan de forma transitoria " estable el gen de la ,rotena de Bluorescencia @erde .gen gf"/, el +ue *a sido utili1ado como gen reportero. &a tabla de la transparencia 70 muestra e!emplos de especies vegetales transformadas por m'todos +umicos .fusin mediante policationes tratamiento con liposomas/ "5o por m'todos de electroporacin de protoplastos. 4e informan los genes de seleccin " los agentes selectores usados. Aun+ue la transformacin de protoplastos resulta un m'todo relativamente simple " efectivo no se utili1a con muc*a frecuencia especialmente por la escasa disponibilidad de protocolos optimi1ados para regenerar plantas a partir de protoplastos.

4i bien la electroporacin se utili1a como t'cnica de transformacin de bacterias " protoplastos tambi'n *a sido empleada para transferir A2( a c'lulas o te!idos intactos es decir +ue presentan paredes celulares. &os e%plantos vegetales utili1ados en este caso pueden ser microesporas polen fragmentos de *o!a embriones callos semillas o "emas. #n algunos casos los e%plantos son pre-tratados con soluciones en1im$ticas .degradacin parcial de las paredes celulares/ o *eridos en forma mec$nica para facilitar la entrada del A2(. 4e *an reportado resultados positivos de la transformacin de c'lulas o te!idos intactos por electroporacin de 8r 0a sativa, 1icotiana tabacum, Triticum aestivum, %ea ma s, Citrus s", etc. &a transparencia 71 muestra un dispositivo .figura A/ usado para transformar embriones de Triticum aestivum. &a electroporacin se reali1a en una c$mara especial en la +ue los embriones son montados en gotas de alginato sobre discos de agarosa .figuras ? C " 2/. 2urante la electroporacin los embriones +uedan en contacto con el buffer de electroporacin enfrentados con el c$todo de la c$mara de electroporacin .figura 2/. &a transparencia 72 muestra diferentes te!idos de Coffea arabiga .cafeto/ electroporados sin pretratamiento en1im$tico .figuras A " ?/ " con pretratamiento en1im$tico .figuras C-B/ en los +ue se observa e%presin transitoria del gen uidA. &os embriones som$ticos en estado de torpedo resultaron ser los e%plantos m$s apropiados para la transformacin por electroporacin. #ste *ec*o se manifiesta en el incremento de la frecuencia de e%presin transitoria del gen uidA " en un aumento de la capacidad regenerativa de los embriones. #l autor de este traba!o conclu"e +ue el pretratamiento con en1imas facilita el ingreso del A2(. &a transparencia 73 muestra los resultados de la transformacin de pro-embriones de 1icotiana tabacum mediante electroporacin sin previa permeabili1acin de las membranas. &os pro-embriones e%presan transitoriamente los genes reporteros uid A " gf". Transformacin con whiskers de carb ro de silicio Transparencias 7--7: #n 1770 se report una nueva t'cnica de transferencia de A2( +ue utili1a fibras mu" finas conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. &as fibras m$s utili1adas en este m'todo son cristales de carburo de silicio de 0 3-0 6 m de di$metro " 10-100 m de longitud. &as fibras de silicio se agregan a una suspensin conteniendo el te!ido vegetal .por e!emplo suspensiones celulares embriones o callos/ " A2( plasmdico " luego se me1clan con un agitador tipo @orte%. Como resultado de la agitacin los whiskers penetran la pared celular " la membrana plasm$tica permitiendo el ingreso del A2(. &a eficiencia de la t'cnica depende del tama>o de la fibra los par$metros de me1cla .agitacin/ la forma de los recipientes utili1ados el material vegetal " las caractersticas de las c'lulas vegetales especialmente el espesor de la pared celular. &as principales venta!as de este m'todo residen en su ba!o costo " en la rapide1 " sencille1 con +ue pueden reali1arse los ensa"os. 4us principales desventa!as son la ba!a eficiencia de transformacin la disminucin de la capacidad regenerativa de los te!idos da>ados por el proceso " la necesidad de traba!ar con e%trema precaucin debido a la to%icidad del carburo de silicio para la salud *umana. Aun+ue el proceso *a sido utili1ado con callos friables este tipo de callo est$ limitado a unos pocos genotipos de ma1 " avena. )uc*os cereales producen callos embriog'nicos mu" compactos " duros +ue no son f$cilmente transformables por este m'todo. 4in embargo se *an introducido me!oras a la t'cnica +ue permitieron la transformacin transitoria " estable de 8r 0a sativa, Triticum s"., !ordeum vulgare, %ea ma s, 1icotiana tabacum, 3olium multiflorum,

3olium "erenne, -estuca arundinacea Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar suspensiones celulares. &a transparencia 7: muestra la transformacin de suspensiones celulares de ma1 con whiskers de carburo de silicio. &as suspensiones celulares fueron puestas en una solucin conteniendo los whiskers " el A2( plasmdico portando los genes uidA " bar. &a me1cla fue agitada con la a"uda de un dispositivo de tipo @orte% .figura A/. &a incorporacin del A2( fue corroborada por la e%presin transitoria del gen uidA .figura ?/. &as c'lulas transformadas formaron callos en seleccin con fosfinotricina .figura C/ " regeneraron plantas transg'nicas .figuras 2 # " B/. #l tratamiento con *erbicida revel +ue las plantas *an *eredado el gen bar en forma mendeliana .figura B/. #ste traba!o fue el primero en +ue se report la produccin de plantas transg'nicas mediante whiskers de carburo de silicio. Transferencia de ADN por microin"eccin Transparencias 76-77 &a microin"eccin es un m'todo de transferencia directa mediante el cual se in"ecta A2( en las c'lulas utili1ando pipetas microcapilares de vidrio ba!o control microscpico. #sta t'cnica se utili1 por primera ve1 en c'lulas animales durante los a>os -0 cuando se *i1o posible la generacin " manipulacin de microagu!as " su uso se e%tendi posteriormente a las c'lulas vegetales. &a t'cnica re+uiere de un micromanipulador " se reali1a ba!o microscopio. 2urante la transferencia de A2( cada c'lula es inmovili1ada con una pipeta succionadora. &as c'lulas microin"ectadas se de!an recuperar en una gota de medio suspendida en una c$mara *9meda " posteriormente son cultivadas in vitro para regenerar plantas. &a microin"eccin fue ideada principalmente para la transformacin de grandes c'lulas animales como las *uevas de los peces. 4in embargo se *an desarrollado protocolos para microin"ectar A2( en protoplastos cultivos embriog'nicos c'lulas en suspensin " estructuras multicelulares vegetales. &a microin"eccin de protoplastos re+uiere inmovili1ar a los mismos en gotas de alginato polilisina o agarosa. &a microin"eccin presenta varias venta!as3 a/ re+uiere pe+ue>as cantidades de A2(G b/ puede aplicarse virtualmente a cual+uier tipo de c'lulaG c/ permite la in"eccin con!unta de A2( con otras mol'culas biolgicamente activasG d/ permite regular el n9mero de mol'culas a transferirG e/ puede monitorearse a las c'lulas blanco durante " despu's de la transferencia de A2(G f/ permite la introduccin no slo de A2( sino tambi'n de cromosomas dentro de las c'lulas. ,or todas estas caractersticas constitu"e un m'todo mu" aplicable al estudio de funciones celulares " de la fisiologa de pl$stidos. 4in embargo su aplicacin a la transformacin de plantas *a sido mu" limitada *asta el presente debido a las dificultades para penetrar la pared celular mediante micropipetas e in"ectar el n9cleo celular .generalmente la vacuola celular ocupa un volumen preponderante/. &a presin de turgencia de las c'lulas vegetales suele dificultar tambi'n el procedimiento de in"eccin. 0tili1ando este m'todo se *an obtenido plantas transg'nicas de 1icotiana tabacum, $etunia s"., Brassica na"us !ordeum vulgare. &a microin"eccin de fluorocromos anticuerpos protenas " material gen'tico es ampliamente utili1ada por los bilogos a pesar de sus desventa!as relacionadas con la insercin de microcapilares. #n c'lulas pe+ue>as el sellado de la membrana plasm$tica alrededor de la *erida provocada por la punta de la pipeta .alrededor de 0 6 m de di$metro/ es a menudo incompleto. Adem$s en la ma"ora de las c'lulas vegetales " en algunos casos de animales la alta presin celular e%acerba los problemas de sellado despu's de la penetracin de la pipeta la presin celular se distiende por+ue los l+uidos celulares son for1ados a entrar al capilar. 2esafortunadamente en c'lulas vegetales mu" turgentes como elementos de plantas

superiores la p'rdida de presin celular es acompa>ada por un dr$stico cambio en la ultraestructura celular. 4in embargo la p'rdida de ultraestructura no ocurre cuando las c'lulas son tratadas con capilares de 0 1 m. #n comparacin con los capilares convencionales esta min9scula punta de pipeta reduce el da>o celular " la p'rdida de turgencia. Aparentemente las fuer1as fsicas en esta punta e%tremadamente fina amortiguan la turgencia celular previniendo cambios bruscos de solutos. 4in embargo la in"eccin de material a trav's de capilares de alrededor de 0 1 m de di$metro re+uiere de alta presin para superar la resistencia al penetrar la c'lula. #n tal sentido las formas convencionales de e!ercer presin resultan insuficientes debido a +ue no producen la presin adecuada o no permiten un control preciso sobre la e%trusin de la muestra. #n la transparencia 78 se muestra el diagrama de una femto!eringa .figura C/ +ue permite introducir muestras del orden de femtolitros en c'lulas " organelas con un mnimo da>o. #l m'todo de microin"eccin +ue utili1a esta micro!eringa se basa en la e%pansin inducida por calor de un metal l+uido .galist$n3 galio indio " esta>o/ dentro de la pipeta para for1ar la muestra desde la punta microcapilar " es adecuado para la transferencia de fluorocromos " construcciones de A2( en cianobacterias " organelas subcelulares. #n la figura 2 se observa el sost'n " calentador con la bomba " la resistencia +ue genera la energa necesaria para e%pandir el metal. Tambi'n se observan dos fotos .figura A " ?/ donde se compara una punta de pipeta convencional con la punta de la femto!eringa. Binalmente " a modo de e!emplo de su uso " resultados se presentan fotos con im$genes de microscopa confocal de 3ucifer ellow in"ectada en una cianobacteria, en cloroplastos de &icia faba " en el n9cleo de c'lulas de 6eno"us distal. &Biobalstica vers s Agrobacterium tumefaciens' Transparencia 100 &a transformacin gen'tica de plantas se remonta a principios de los a>os 80 d'cada en +ue se demostr la capacidad del Agrobacterium para transferir A2( a c'lulas vegetales. 2urante las d'cadas siguientes se reali1aron avances significativos en me!orar los sistemas basados en Agrobacterium as como en desarrollar nuevos m'todos +ue permitieron la transferencia directa de A2(. #ntre estos 9ltimos se inclu"en m'todos como el bombardeo de micropartculas .biobalstica/ la permeabili1acin de membranas celulares por corrientes el'ctricas .electroporacin/ "5o por tratamientos +umicos con policationes .,#A ,@,/ o fusgenos lipdicos la abrasin con fibras de carburo de silicio " la microin"eccin. 4i bien varios de los sistemas de transferencia directa *an resultado en aplicaciones e%itosas el bombardeo de micropartculas es actualmente el m$s ampliamente utili1ado. ,or otra parte aun+ue e%isten muc*os reportes sobre el uso de virus como vectores Agrobacterium resulta el vector biolgico m$s usado para la transformacin vegetal. &a biobalstica fue desarrollada como una alternativa para resolver la ausencia de interaccin entre muc*as especies vegetales " las distintas cepas de Agrobacterium. 4in embargo desde la d'cada del 70 el uso de cepas supervirulentas de la bacteria *a permitido la obtencin de plantas transg'nicas en especies +ue *asta ese momento no eran susceptibles a Agrobacterium " +ue por el contrario *aban podido ser transformadas por biobalstica. ,or su parte el uso de los ca>ones g'nicos est$ limitado por la capacidad regenerativa de las c'lulas bombardeadas " por la integracin estable del A2(. Adem$s la biobalstica *a evidenciado una alta frecuencia de integracin de secuencias re-arregladas "5o truncadas como tambi'n la insercin de m9ltiples copias del transg'n lo +ue redunda en una alta probabilidad de ocurrencia de silenciamiento g'nico. ,or el contrario el Agrobacterium produce

generalmente integraciones +ue involucran a una o a pocas copias del transg'n. #ste aspecto *a determinado +ue siempre +ue sea posible la ma"ora de los investigadores prefieran la t'cnica basada en Agrobacterium. 4in embargo deben considerarse tambi'n las crecientes evidencias +ue muestran +ue la insercin del A2( por la bacteria no es tan definida como se crea anteriormente. #n este sentido se *a *allado +ue secuencias de A2( ubicadas fuera de los bordes de la regin T de Agrobacterium pueden integrarse tambi'n en el genoma de la planta receptora. Adem$s la persistencia de Agrobacterium en los te!idos de las plantas regeneradas es otro problema +ue a9n resta resolver " +ue tiene implicancias sobre aspectos de bioseguridad. ,or estas ra1ones aun+ue e%iste una tendencia a elegir el m'todo de Agrobacterium para transformar plantas tanto 'ste como la biobalstica seguir$n constitu"endo sistemas complementarios durante muc*os a>os.