Extraccin de RNA con Trizol Luiyis group

Extraccin de RNA de tejido heptico con Trizol (Invitrogen) Materiales Vortex Estu#a Ter$o con N' (l Vasos de telgopor )artillo )ortero .inza Tubos RNA 0o$ogenizador de vidrio Reactivos Trizol (lab Javier !loro#or$o (#reezer (sopropanol (#reezer Etanol *+, (#reezer Agua -E.! (A$bion RNase/ap (A$bion Eq ipos !entr"#uga re#rigerada %a&o seco )icrocentr"#uga !a$pana

!) "o#ogenizacin (tra$ajar en ca#pana) Agregar +11 l de Trizol a cada tubo eppendor# (especiales RNA2 Axygen3 !digo J )!T4+1! 5 Tarar un tubo en la balanza nueva5 !olocar la $uestra en N' (l (en vaso de telgopor 5 En#riar el $ortero y ro$per el te6ido con el piln2 7asta 8uedar con trozos pe8ue&os5 -e ser necesario2 usar el $artillo (poniendo la $uestra en un #olio 5 To$ar la cantidad deseada con la pinza y llevarlo r9pida$ente al tubo eppendor#5 .esar el tubo (: !% #g)& Trasvasar el contenido del tubo al 7o$ogenizador de vidrio (previa$ente tratado con solucin RNase/ap y etanolizado 5 ;na vez obtenida una solucin 7o$og<nea2 trasvasar nueva$ente al tubo original2 y agregar la cantidad restante de Trizol (4111 l cada 41 $g de te6ido (ncubar + $in a te$peratura a$biente5 !entri#ugar a 4'5111 g a =>!2 al $enos 41 $in2 y trans#erir el sobrenadante a un nuevo tubo Agregar cloro#or$o ('11 l por cada $L de Trizol2 ver tabla de proporciones 5 Agitar vigorosa$ente por 4+ seg5 ?6o@ No usar vortex@ (ncubar entre ' y 4+ $in a te$peratura a$biente5 !entri#ugar a 4'5111 g por 4+ $in2 entre ' y A >!5 Be generan tres #ases3 Buperior (contiene el RNA 3 acuosa2 incolora

Extraccin de RNA con Trizol Luiyis group

(nter#ase (contiene -NA 3 blanca (n#erior (contiene prote"nas 3 org9nica2 ro6a Trans#erir la #ase acuosa (aprox C+1 l por $L de Trizol a un nuevo tubo y repetir la extraccin con cloro#or$o (con aprox5 A1 l

') (recipitacin del RNA Trans#erir la #ase acuosa (aprox C11 l por $l de Trizol a un nuevo eppendor# (el $is$o volu$en para cada $uestra 5 .recipitar el RNA con isopropanol #r"o (+11 l por $L de Trizol2 ver tabla de proporciones 5 )ezclar por inversin5 (ncubar + D 41 $in a te$peratura a$biente (u ?N a E'1>! 5 !entri#ugar a 4'5111 g 41 $in a ' D A >!5 -escartar el BN5 .ara descartar co$pleta$ente2 dar un spin breve y eli$inar el exceso con .'1

)) *avado Agregar 4 $L de etanol *+, #r"o por $L de Trizol (ver tabla de proporciones 5 !entri#ugar a *+11 g2 + $in a ' D A>!5 -escartar el BN5 Bpin breve y .'1

+) Res spensin Becar el pellet + $in a C*F (estu#a 5 No de6ar secar el pellet co$pleta$ente ya 8ue luego ser9 i$posible resuspenderlo5 Resuspender en C1 l de agua $iliG2 libre de RNasa5 .ara resuspender co$pleta$ente3 alternar #r"o D calor (H1F! 5 (ncubar 41E4+ $in a ++EH1>! !entri#ugar a H+11 rp$ por + $in (en $icrocentr"#uga 5 Trasvasar y #raccionar en tubos nuevos5 2

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Al$acenar a E*1 >!5

Ta$la de proporciones

Tejido (#g) 4' 44 41 I A *

Trizol ( *) 4'11 4411 4111 I11 A11 *11

,loro-or#o ( *) '=1 ''1 '11 4A1 4H1 4=1

Isopropanol .( *) H11 ++1 +11 =+1 =11 C+1

Etanol ( *) 4'11 4411 4111 I11 A11 *11