El CIVTEST BOVIS BRSV/VRS es una tcnica de ELISA indirecto para la deteccin en suero de anticuerpos especficos contra el Virus Respiratorio Sincitial Bovino (VRSB). Informacin general. El Virus Respiratorio Sincitial Bovino (VRSB), es un virus del gnero Pneumovirus perteneciente a la failia Paramyxoviridae. Se !an descrito aislaientos de este virus en Europa" #orte Arica" Australia" $apn % recienteente en el #orte de Africa. En los casos &s severos el virus se asla a partir de los e'udados nasales entre los ( ) *+ das despus de la infeccin" % de las ucosas tra,ueales" nasales % -ron,uiales entre los . % */ das post)infeccin. A enudo el 0+ ) 1+ 2 de los aniales de una deterinada edad pueden ostrar sntoas. Los terneros afectados suelen tener de / a 1 eses % !asta *3 eses de edad. En una priera fase" los sntoas tpicos son tos con descargas nasales" con4untivitis % secreciones lacriales. La teperatura rectal es de (+56. En una segunda fase" a los 7 ) / das" cuando todo parece norali8arse" se inicia un nuevo proceso con sntoas asociados al enfisea pulonar" apareciendo dificultad respiratoria % tos seca. La teperatura rectal vuelve a la noralidad % el rito respiratorio auenta a &s de *++. El diagnstico de la-oratorio pasa por el aislaiento o la visuali8acin del virus. El diagnstico puede !acerse utili8ando sueros pareados de los isos aniales con una separacin de entre *3 das % / seanas" para evidenciar un increento en los niveles de anticuerpos (Ig9s). Pincipio del Test. El CIVTESTBVIS BRSV!VRS es un test -asado en un en8ioinunoensa%o (EIA) indirecto. El antgeno especfico de VRSB se !alla tapi8ando los 1: pocillos de la icroplaca. ;urante la incu-acin inicial de la uestra diluida en el pocillo" los anticuerpos especficos de VRSB se unen al antgeno adsor-ido al pocillo ,uedando retenidos en el iso durante el proceso de lavado. A continuacin" se a<ade una solucin de con4ugado ,ue se une a los anticuerpos -ovinos retenidos en el pocillo. =osteriorente" se lava el e'ceso de con4ugado ,ue no !a%a ,uedado retenido % se a<ade un sustrato croognico especfico de la pero'idasa. La consiguiente aparicin de color en cada pocillo es proporcional a la cantidad de anticuerpos especficos de VRSB presentes en cada uestra. Composicin del kit. Producto Cantidad ) >icroplacas de 1: pocillos (divididas en tiras de 0 pocillos) tapi8adas con antgeno especfico de VRSB.
) Vial #?+@ Solucin de Lavado (7+'). !" ml
) Vial #?*@ Solucin ;ilu%ente de >uestras (/') coloreada en verde. !" ml ) Vial #?7@ Solucin de 6on4ugado@ Solucin de =roteina 9ABR=C lista para su uso coloreada en ro4o. #$ ml ) Vial #?/@ Solucin de Sustrato@ Solucin de D>B lista para su uso. #$ ml ) Vial #?(@ Solucin de =aro@ Solucin B7SC( lista para su uso. #$ ml ) Vial #?3@ 6ontrol =ositivo@ Suero 6ontrol =ositivo pre)diluido % listo para su uso coloreado en aarillo. # ml ) Vial #?:@ 6ontrol #egativo@ Suero 6ontrol #egativo pre)diluido % listo para su uso coloreado en a8ul. # ml ) 6u-ierta ad!esiva para icroplaca. ) Instrucciones de uso. # %aterial necesario no suministrado Incu-ador a /. ?6" pipetas de precisin (ono o ulticanal) con sus correspondientes puntas" tu-os % placas de fondo en E para diluir las uestras" lector de placas de ELISA" agua destilada o desioni8ada % lavador de placas. Precauciones Leer atentaente el anual de instrucciones. 6onservar los reactivos entre 7 % 0 ?6 (no congelarlos). 6onservar las placas no utili8adas entre 7 % 0 ?6 cerradas en la -olsa de pl&stico con el sa,uito anti)!uedad. A pesar de ,ue el antgeno !a sido inactivado durante el proceso de fa-ricacin" ane4ar todos los reactivos con cuidado" coo si fueran una fuente potencial de VRSB. #o e'poner la Solucin de Sustrato a la lu8 intensa o a agentes o'idantes. #o utili8ar los Fits despus de su fec!a de caducidad. #o e8clar los reactivos ni las instrucciones de diferentes lotes de Fits. Reali8ar tanto el pipeteado coo el lavado de la placa de fora eticulosa para antener la precisin % la repetitividad de los resultados. #o pipetear los reactivos con la -oca. Etili8ar guantes durante todo el proceso. La Solucin de =aro contiene &cido sulfGrico (7#) ,ue puede resultar corrosivo" anipularla con cuidado. ;escontainar todo el aterial antes de su eliinacin. Hit para uso veterinario. Preparacin de las muestras &os controles positi'o ( negati'o est)n listos para su uso ( no re*uieren dilucin. El resto de las uestras de-en diluirse #+#"" en Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida. Se recoienda reali,ar la dilucin en dos pasos. =or e4eplo@ ;iluir inicialente en un tu-o *+ l de uestra en (1+ l de Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida %" a continuacin" transferir 73 l de esta dilucin *@3+ de la uestra a un pocillo de la placa de ELISA ,ue %a contenga 73 l de Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida. Si se dispone de placas de serologa de 1: pocillos con fondo en E % de pipeta ulticanal capa8 de dispensar con precisin volGenes de *+ l" entonces la dilucin en dos pasos se puede reali8ar del siguiente odo@ ;iluir inicialente" en la placa de serologa" *+ l de uestra en *1+ l de Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida %" a continuacin" transferir *+ l de esta dilucin *@7+ de la uestra a un pocillo de la placa de ELISA ,ue %a contenga (+ l de Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida. Preparacin de los reacti'os E,uili-rar los reactivos a teperatura a-iente antes de coen8ar el procediiento del ensa%o. En su fora concentrada es posi-le ,ue" despus de periodos prolongados de alacenaiento a ( ?6" se foren cristales" tanto en Solucin de Lavado (7+')" coo en la Solucin ;ilu%ente de >uestras (/'). Ena ve8 estas solucines alcan8an de nuevo la teperatura a-iente" stos de-en redisolverse agitando el frasco. El proceso de resolu-ili8acin se puede acelerar suergiendo el frasco durante unos inutos en un -a<o a /. ?6. #o diluir estas solucines !asta ,ue estn totalente redisueltas. =ara evitar la aparicin de cristales en la solucin de lavado concentrada" sta puede alacenarse a teperatura a-iente durante toda la vida del Fit. Solucin de Lavado (7+') (Vial #? +)@ =ara recostituirla a<adir * voluen de Solucin de Lavado (7+') a *1 volGenes de agua destilada o desioni8ada (e4. para preparar 7++ l de Solucin de Lavado diluida e8clar *+ l de la solucin concentrada (7+') con *1+ l de agua destilada). La solucin diluida es esta-le durante . das. Solucin ;ilu%ente de >uestras (/') (Vial #? *)@ =ara recostituirla a<adir * voluen de Solucin ;ilu%ente de >uestras (/') a 7 volGenes de agua destilada o desioni8ada (e4. para preparar :+ l de Solucin ;ilu%ente de >uestras diluida" e8clar 7+ l de solucin concentrada (/') con (+ l de agua destilada). La solucin diluida es esta-le durante . das. Procedimiento del ensa(o *. ;e4ar ,ue todos los reactivos alcancen la teperatura a-iente % asegurarse de ,ue estn -ien e8clados reali8ando una inversin suave del frasco. 7. =reparar una !o4a de datos para identificar los pocillos individuales para cada uestra % control. Los controles positivo % negativo de-n siepre anali8arse por duplicado. /. ;espegar la cu-ierta ad!esiva de pl&stico % a<adir $" l de controles prediluidos ( de las muestras diluidas #+#"" a los pocillos apropiados en la placa. (. 6u-rir la placa con una cu-ierta ad!esiva e incu-ar !" minutos a -./C. 3. Retirar el ad!esivo % reali8ar - la'ados de cada pocillo con /++ l de Solucin de Lavado diluida. Al final" invertir la placa % golpearla fireente so-re papel a-sor-ente. :. A<adir $" l de Solucin de Con0ugado (Vial #?7) a cada pocillo. .. 6u-rir la placa con una cu-ierta ad!esiva e incu-ar !" minutos a -./C. 0. Retirar el ad!esivo % reali8ar - la'ados de cada pocillo con /++ l de Solucin de Lavado diluida. Al final" invertir la placa % golpearla fireente so-re papel a-sor-ente. 1. ;ispensar en cada pocillo $" l de Solucin de Sustrato (Vial #?/). Agitar suaveente la placa durante 7 segundos. *+. ;e4ar desarrollar la reaccin croognica a Deperatura A-iente (7+)7356) en la oscuridad durante #$ minutos. **. ;ispensar en cada pocillo $" l de Solucin de Paro (Vial #?(). Agitar golpeando ligeraente el flanco de la icroplaca. *7. Lipiar la superficie inferior de la placa con un papel a-sor-ente. &eer la placa utili8ando un lector de ELISA e,uipado con un filtro de 1$" nm. Reali8ar previaente el -lanco con el aire. Registrar los resultados. Validacin del Test El test es v&lido si la ;C(3+ edia del 6ontrol =ositivo es superior a +"1 % la ;C(3+ edia del 6ontrol =ositivo es a 3 veces la ;C(3+ edia del 6ontrol #egativo. C)lculos =ara la interpretacin de los resulados es preciso o-tener el valor de IR=6 (Indice Relativo ' *++) de cada uestra. =ara o-tener el valor de IR=6 de cada uestra !a% ,ue aplicar la siguiente relacin (en ella se utili8an los valores edios de ;C(3+ o-tenidos con las 7 rplicas de los controles)@ 100 x Negativo Control DO Media Positivo Control DO Media Negativo Control DO Media Muestra D.O IRPC 450 450 450 450
= Interpretacin de los resultados %2ESTR3 V3&OR 4E IRPC #E9ADIVC 7+"+ =CSIDIVC J 7+"+ REPRESE5T3CI65 7R89IC3 1-CONTROL! " M#!TR$! %-INC#&$R '()C *0 +in. '-L$,$R -' ,C!. 4-CON/#0$DO 5- INC#&$R '()C *0 +in. *-L$,$R -' ,C!. (- !OL#CI1N D !#!TR$TO 2-INC#&$R T3 $M&INT 15 +in. N L$ O!C#RID$D 4- !OL#CI1N D P$RO 10-LCT#R$ D R!#LT$DO! 5iltro de 450 n+. ,er.61170% CI,T!T &O,I! &R!,7,R! Dcnica de ELISA para la deteccin en suero -ovino de anticuerpos especficos del tipo Ig9 contra el Virus Respiratorio Sincitial Bovino. 6digo >icroplacas Ensa%os ++7( 7 *0(
