Protocolo EXTRACCIÓN DE ADN

A. Antes de usar, tenga en cuanta que buffer CL pruede formar un precipitado durante el
almacenamiento, si es necesario disolver el precipitado calentando a 56°C.
B. Antes de usar, agregue 17ml de etanol al 100% a los 13 ml de solución CW1
(concentrado) y 21 ml de etanol al 100% a 9 ml de solución CW2 (concentrado).
1. Desinfectar todo el material
2. Cortar los papelitos con las muestras de sangre y colocar en los tubos de 2ml.
3. Colocar buffer TE: si el círculo de sangre en el papel es pequeño se coloca solo 100µl pero
si el círculo de sangre en el papel es grande se coloca 200µl.
4. Colocar en baño maría durante 15 min a 56°C.
5. Con una pinza aplastar los papeles dentro del mismo tubo lo máximo hasta que se exprima
la sangre.
6. Desechar los papeles escurridos.
7. Colocar en baño maría durante 15 min a 85-87°C (evitar que el agua hierva y se destapen
los tubos).
8. Colocar en la centrifugadora durante 3 seg.
9. Añadir 100µl de la solución PBS en cada tubo. Mezcle suavemente y deje reposar 1 min a
temperatura ambiente.
10. Añadir 20µl de proteinasa K. Mezclar bien. Añadir 200µl de Buffer CL. Mezcle suavemente.
Incubar a 56°C durante 10 min. Si la solución está turbia, extienda la incubación hasta que
la solución esté clara para completar la lisis.
11. Agregar 200µl de etanol al 100% y mezclar bien.
12. Transfiera toda la solución del tubo a una columna que esté en un tubo de recolección de
2ml. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1- 2min. Centrifugue a 10 000 rpm
durante 2 min. Desechar lo que queda en el tubo colector.
13. Agregar 500µl de solución CW1. Centrifugue a 10 000 rpm durante 1 min.
14. Agregar 500µl de solución CW2. Centrifugue a 10 000 rpm durante 1 min.
15. Desechar el líquido que queda en el tubo colector. Centrifugue a 10 000 rpm durante 1
min.
16. Coloque la columna en un tubo Eppendorf limpio de 1,5 ml. Añada 50 µl de solución CE
apuntando al centro de la membrana de la columna. Incubar a temperatura ambiente
durante 2-3 min. Para mejorar el rendimiento incubar a 50°C durante 2 min.
17. Gire a 10 000 rpm durante 1 min para eludir el ADN de la columna.
18. Coloque los tubos en la caja y coloque en el congelador.

Protocolo PCR

Receta para una muestra

a) H2O = 33 µl
b) Buffer = 5 µl
c) MgCl2 = 3 µl
d) Pf = 2.5 µl
e) Pr = 2.5 µl
f) dNTPs = 0.6 µl
g) Taq = 0.5 µl
h) ADN = 3 µl
1. Siguiendo la receta multiplicar la cantidad de cada reactivo para el número de
muestras que desea procesar excepto el ADN ese siempre será 3 µl
2. Realizar el Mister Mix en un tubo de 1.5ml se coloca todas las cantidades calculadas
previamente (excepción del ADN). Con la ayuda de micropipetas mezclar bien el
contenido.
3. Dependiendo de la cantidad de muestras a procesar rotular los tubos para PCR
4. Trasvasar con la ayuda de una micropipeta 47.1 µl del Master Mix en cada tubo
5. Y para completar un volumen de 50 µl en cada tubo, finalmente se coloca 3 µl de ADN
de cada muestra.
6. Colocar los tubos en el termociclador, se configura dependiendo del gen que se desea
amplificar y se manda la corrida.

Protocolo para el GEL Y ELECTROFORESIS

Para un gel al 2% en 200ml para ocupar las 3 cámaras

1. Se pesa en la balanza 4gr de agarosa

2. Medir 160ml de agua destilada, 40ml de TBE 5X y 10 µl de safe view
3. Mezclrar todo (agua, TBE 5x, agarosa) en un matraz excepto el safe view
4. Colocar 2 min y 30 segundos en el microondas, agitar cada 30 segundos hasta que
la solución quede totalmente transparente
5. Dejar enfriar hasta que la solución este tibia y colocar el safe view
6. Armar la cámara de electroforesis y verter el contenido del matraz en la cámara
7. Esperar hasta que el gel se solidifique y se nota porque tendrá un color gris
8. El gel sumergir en el TBE1X
9. En un papel Parafilm colocar 2 µl de blue juice y 8 µl del tubo para PCR que salió
del termociclador
10. Finalmente, el volumen final de 10 µl colocar en cada pocillo
11. Prender la máquina y esperar