LABORATORIO DE GENETICA MOLECULAR UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

METODO DE SALTING-OUT PARA EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE SANGRE.

1. Se toman de 3 - 5 mL de sangre con anticoagulante. 2. Se agrega solucin de lisis I hasta un volumen de 14 mL. 3. Mezclar por inversin y dar vorte por 15 segundos. 4. !entri"ugar 35## rpm por $ min. 5. %epetir los pasos & y 3 dos veces. DIGESTION '. %esuspender el (otn de (lancos en 3 mL de solucin lisis II. $. )dicionar 1.5 ml *erclorato de sodio 5M. 8. 1## L S+S &#, -. 1.5 ml /a!l 'M. 1#. +ar vorte y !entri"ugar &0## rpm por $ min. EXTRACCION 11. 1rans"erir la capa intermedia a un tu(o de 15 mL. 1&. )gregar ' mL de Isopropanol a(soluto "rio 2 -1# #!3. 13. +e4ar reposar & min. 14. %etirar grumos del so(renadante. PRECIPITACION 15. Mezclar por inversin suavemente hasta o(tener malla de +/). 1'. %etirar +/) con una punta y lavarlo con & mL de etanol $#,. 17. %esuspender la malla de +/) con 3## L de 15 #.16. 10. Llevar a (a7o maria2'5o!3 durante 15-3# minutos. 1-. )lmacenar a 8&#o!. Si no se o(serva la made4a. centri"ugar a 35## 8 1# min. para de4ar precipitar. +escartar so(renadante. Lavar la made4a con 1### l de Etanol ETO!" #$%& '()o -2$*C". !entri"ugar a 35## 8 1# min. +escartar so(renadante. +e4ar secar el +/). generalmente en incu(adora. +iluir el +/) en el volumen de TE 1X en el 9ue se va a %esuspender. :eneralmente entre &## - 4## l. !he9uear el +/) en A+a(o,a al $.-% con B(Et.

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PREPARACION DE REACTIVOS
SOLUCION LISIS DE RO.OS 1 L/t(o,"
Sucrosa 1ris 2p; $.53 1# mM Mg!l& 5mM 1riton 1##-6 1 , 1#&.'- g 1# mL de s<n madre 1 M. p; $.5 5 mL de s<n madre 1M 1# mL de s<n madre. 1riton 1##-6

Mezclar los reactivos e cepto el 1riton-1## . en 15 mL de agua destilada. )dicionar el 1riton. !ompletar a 1 litro. )lmacenar en "rasco oscuro a 4o!. SOLUCION MADRE T(/,- !Cl 1 M& 0! #&1 V 2 2$$ 3L"

*esar &4.&& g de 1rizma-=ase. llevar hasta 15# mL con agua desionizada. )4ustar a p; $.5 con ;!l concentrado. )4ustar el volumen a &## mL con agua destilada.

SOLUCION LISIS DE BLANCOS 1 L/t(o"

' M /a!l 1&.5 mL de solucin madre /a!l 'M #.#&4 /a-5+1) &4 mL de solucin madre 5+1) 1M. p; 0 )dicional 0## mL de agua desionizada. Mezclar y a4ustar nuevamente a p; 0 con /a>;. Llevar a un volumen "inal de 1 litro. SOLUCION MADRE NaCl 4M& V 2 1$$ 3L"

*esar 1$5.& g y llevar a 5## mL con agua desionizada y agitar. SOLUCION MADRE Na-EDTA 1M& V 2 1$$ 3L"

*ara 1&# mL se pasa 44.'' de 5+1) *esar 10'.1 g. adicionar ' pasillas de /a>;. Llevar a 4## mL. )4ustar a p; 0 con /a>;. !ompletar a 5## mL ;&> desionizada.

PERCLORATO DE SODIO 1M V 2 1$$ 3L"

/o de4ar destapado. compuesto altamente higroscopico. *esar 3#4 g y llevar a un volumen "inal de 5## mL. Mezclar (ien y guardar a 1o am(.

BU55ER TE 1X V 2 3$$ 3L"

1# mM 1ris-;!l . p; 0 1 mM /a-5+1). p; 0 1mL de solucin madre 1M p; 0 &## L solucin madre 1M. p; 0

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