RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL y Verificar la calidad de los alimentos haciendo uso de los parmetros coliformes totales y coliformes fecales

OBJETIVOS ESPECIFICOS y y Determinar el nmero de colonias formadas de coliformes totales y fecales en los diferentes medios de cultivo como ser PDA, PCA, MC Verificar el crecimiento de coliformes totales y fecales en los caldos verde bilis brillante y caldo E.C. respectivamente

INTRODUCCION Coliformes Totales La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.

Hbitat del grupo coliforme Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

Los coliformes como indicadores Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales y

porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura.

Asimismo, su nmero en el agua es proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. En general, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido divido en dos grupos: coliformes totales y coliformes fecales.

Bacterias que integran el grupo El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros:

1.Escherichia 2.Klebsiella 3.Enterobacter 4.Citrobacter

FUNDAMENTO TEORICO Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces

de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. En alimentos, la identificacin de una concentracin elevada de Coliformes Fecales en un alimento es indicador de su contaminacin y por tanto su mala manipulacin, de ser esto as, se debe declarar al alimento en cuestin como No Apto para el Consumo Humano. La Organizacin Mundial de la Salud indica que la problemtica de la contaminacin de mares y ros por aguas servidas y desages a puesto en alto riesgo a la poblacin acutica de directo consumo humano, estando entre ellos los peces. La contaminacin producida tambin contamina la carne de dichos animales, estando por tanto contaminados en su mayor parte desde su fuente de extraccin. Es por tanto de mucha importancia en la actualidad pruebas que descarten la presencia de microorganismos contaminantes tan peligrosos como son los Coliformes Fecales El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: y E. colienterotoxignica (ETEC) y E. coli enteropatgena (EPEC)

y y y y

E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli enteroinvasiva (EIEC) E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. Escherichia coli enterotoxignica ETEC La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la mucosa intestinal. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne

MATERIALES

Reactivos  Violeta Rojo Bilis Lactosado (VRBL)  Plate Country Agar (PCA)  Papa Dextrosa Agar (PDA)
 Caldo E.Coli  Caldo Verde Bilis Brillante (CEC) (CVBB)

Materiales y Equipos  8Cajas Petrie desechables  8 Tubos de Ensayo

 5 Pipetas Volumtricas de 1mL y 10 mL  1 Matraz Erlenmeyer 250 mL

 Agua Peptona     1 Mechero 1 Asa de Aguja 1 Agitador 1 Estufa

Muestra  Queso menonita

PROCEDIMIENTO  Protegerse adecuadamente antes de comenzar la prctica es decir colocndose barbijo, gorro y guantes, para posteriormente desinfectar el area de trabajo  Tritura lo mas posibles la muestra de queso menonita  Pesar 25 gramos de queso y agregar a 225 mL de agua peptonada, agitando vigorosamente  Agregar 9 mL. De agua peptonada a 4 tubos de ensayo los cuales tendrn una concentracin de 10-2, 10-3, 10-4, 10-5  Enumerar las concentraciones con las que se va a trabajar en las placas petry y PCA: 10-3, 10-4, 10-5 y PDA: 10-2, 10-3 y MC : 10-3, 10-4, 10-5

 Para el medio PCA se pipetea 1mL de la solucin madre y se vierte al primer tubo de concentracin 10-2  Del tubo de concentracin 10-2 es extrado 1mL con otra pipeta , la cual es depositada en el tubo de concentracin 10-3  De la misma manera que la anteriores del tubo de concentracin 10-3 se extrae 2 mL. con una nueva pipeta y es vertido 1 ml al tubo de concentracin 10-4 y el 1 mL. Restante a la caja petry de concentracin 10-3 TENIENDO SIEMPRE EN CUENTA QUE EN TODAS LAS DILUCIONES SE TRABAJA DETRS DEL MECHERO Y QUE PARA CADA DILUCION DE HACE USO DE OTRA PIPETA  Terminado de depositar las diluciones se procede a vaciar el PCA mas o menos que tenga 3-5 mm de espesor y realizar movimientos leves en forma de 8 y 5  Se procede de la misma manera para el medio PDA y MC con la varienta de que las concentraciones en las placas petry son distintas

del tubo de concentracin 10-4 se pipetea 2 mL. con la pipeta ya descontaminada y es vertido a la caja petri de concentracin 10-4 y el otro 1 ml al tubo de concentracin 10-5  Finalmente del tubo de concentracin 10-5 se pipetea 1 mL. Y se lo vierte a la caja petry de concentracin 10-5 

 Una vez que las muestras son depositadas en las cajas petri se proceden a destaparlas no por completo y a verter el agar (agua en esta prctica) lentamente hasta que tenga un espesor de 2 cm., luego se tapa la caja y se realizan movimientos en forma de 8 unas 5 veces verticalmente y 3 veces horizontalmente , este procedimiento se realiza con todas las muestras depositadas SEGUNDA PARTE Una vez que se hubiesen formado las colonias en el medio MC se verifica la presencia de coliformes totales y coliformes fecales en el caldo verde bilis brillante y caldo EC respectivamente Para ello se elige una placa petri la cual se encuentre dentro del rango y se toman 2 colonias enumerando cada una, a partir de ah se elige una colonia para hacer la inoculacin en el caldo EC y Caldo verde bilis brillante

Despus de haber transcurrido 24 horas despus de la siembra se procede con la inoculacin de la siguiente manera Se esteriliza todo el medio con el que se va a trabajar es decir mesones y se protege uno adecuadamente (barbijo , guantes y gorro) Posterior a ello se esteriliza el asa en un mechero se deja enfriar y se destapa la placa petry de concentracin 10-3 se pincha la colonia uno y se le agrga al tubo de ensayo verde bilis brillante teniendo el cuidado de calentar la boquilla en el mechero antes y despus de la inoculacin Se vuelve a esterilizar el asa en el mechero dejando que enfrie por unos segundos y se vuelve a pinchar la colonia 1 se destapa el tubo de ensayo que contiene el caldo EC y se lo agrega se agita levemente y se tapa el tubo teniendo el cuidado de calentar la boquilla antes y despus de la inoculacin De la misma manera se procede con la colonia # 2 inoculando en los 2 tubos

CALCULOS Y RESULTADOS MEDIO: PCA Dilucin 10-3 24 HORAS Incontable Dilucin 10-4 Incontable 341 48 HORAS Incontable Incontable Dilucin 10-5 Incontable

Debido a que los datos obtenidos en nuestras diluciones en caja petry sobrepasan el rango se trabajara con estos por motivos de practica RTBAM: 3.4*107 UFc/g

MEDIO: PDA Dilucin 10-2 24 HORAS Incontable Dilucin 10-3 Incontable

48 HORAS

Incontable

420

M y L= 4.2*105

MEDIO: MC

Dilucin 10-3 24 HORAS 96

Dilucin 10-4 3

Dilucin 10-5 0

VERIFICACION

COLONIA #1
CALDO VERDE BILIS BRILLANTE (Presencia de CT ) CALDO E.C. (Presencia de CF)

COLONIA #2 Positivo Positivo

Positivo Positivo

MEDIO : MC PARAMETRO: Coliformes totales CT = 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc PARAMETRO: Coliformes fecales CF= 96*(2/2)* 103 = 9.6 * 104 UFc MEDIO: PCA

10-2 24 HORAS

10-3

48 HORAS

MEDIO: PCA 24 HORAS

48 HORAS

MEDIO MACONKEY

10-3

10-4

10-5

24 HORAS

OBSERVACIONES  Las colonias tpicas de coliformes presentan un halo rojo  En el medio PCA hubo crecimiento de mohos  En los medio PCA y PDA los microorganismos no se encontraban dentro del rango de la ISO para hacer el recuento correspondiente  Los caldo VBB presentan turbidez  Los caldos EC inicialmente eran de color amarillo tenue despus de la inoculacin se tornan de un blanco lechoso con presencia de precipitado  El caldo EC inicialmente tiene una coloracin verde

CONCLUSIONES  La muestra de queso tiene 9.6 * 104 UFc/g en coliformes totales como coliformes fecales lo cual nos indica que no es apta para el consumo

 El medio utilizado en la practica es el MC que es una medio selectivo diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgeno entricos.