Microbiología General - Facultad de Ciencias Exactas – UNLP - MG-Op 2023

AISLAMIENTO DE BACTERIOFAGOS.

1. Detección de bacteriófagos de Bacillus cereus a partir de tierra

Enriquecimiento de bacteriófagos a partir de tierra

a) Agregar 10 g de la muestra en 90 ml de caldo CASOY. Mezclar por agitación.

b) Agregar 0.1 ml del cultivo de B. cereus en fase estacionaria temprana.
c) Incubar 24 hs a 32ºC con agitación.
d) Tomar 5 ml del cultivo de enriquecimiento y centrifugar durante 10 minutos a 3600 rpm.
e) Filtrar asépticamente el sobrenadante (0,22 µm diámetro de poro)

Con el filtrado (libre de bacterias) realizar la prueba de la gota

 Prueba de la gota (Spot test)

a) Disponer de una placa de agar nutritivo previamente secado.

b) Realizar diluciones seriadas del filtrado a partir de 1 ml del filtrado en 9 ml de solución fisiológica.
Continuar diluyendo hasta una dilución 10-5.
c) Fundir y termostatizar a 50ºC un tubo de agar blando (4 ml). Agregar 500 µl de un cultivo de B.
cereus. Mezclar por rotación y volcar sobre la placa de agar nutritivo. Secar en flujo laminar
durante 30 min.
d) Rotular en la caja la posición de cada dilución. Colocar 10 µl del lisado y de cada dilución según el
esquema. Dejar sobre la mesada 15 min.

e) Incubar a 32ºC, durante 16 hs.

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Algunas cuestiones ...

1- Esta placa de la prueba de la gota fue realizada con la cepa de Pseudomonas aeruginosa PAO
frente a diluciones seriadas 1/10 de un fago lítico, el filtrado sin diluir. Que observaciones
podés realizar del resultado del ensayo.

Gota del
filtrado puro

2- ¿Es posible estimar la concentración de fagos que tiene el filtrado utilizado en esta prueba?

3- ¿Cómo interpretás el resultado obtenido en este ensayo

de la gota?

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2- Recuento de unidades formadoras de placas por ml (UFP/ml) mediante la técnica de la doble

capa

Protocolo

a) Disponer de un cultivo de B. cereus en fase exponencial.

b) Disponer de 6 placas de Petri conteniendo agar nutritivo.
c) Realizar diluciones seriadas de la suspensión de fagos con solución fisiológica (SF).
d) Fundir y termostatizar a 45ºC, 6 tubos conteniendo agar blando (tubos de reacción). Rotular los
tubos con las diluciones a plaquear, por duplicado.
e) Agregar a cada tubo 0,1 ml del cultivo de B. cereus
f) Agregar a los tubos 0,1 ml de la dilución correspondiente del fago.
g) Homogeneizar y verter sobre las placas de agar nutritivo previamente rotuladas. Secar e incubar a
32ºC, 16 hs.
h) Contar las placas de lisis y calcular el título (concentración) de la suspensión de fagos (UFP/ml)

Esquema

Suspensión Agar blando a

de fagos 45ºC

+ B. cereus
+ Dilución del fago

Base de agar nutritivo

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SEMINARIO

1- Que etapas se observan en un gráfico de crecimiento de fagos en un escalón: UFP/ml versus

tiempo.

2- ¿Qué es la multiplicidad de infección (MDI)?

3- Analizá las curvas de la figura de DO vs. Tiempo (hs). ¿Como explicas las diferencias observadas?
Concentración inicial de bacterias 1.109 ufc/ml.

4- ¿Qué es una UFP? Analizá el protocolo de recuento de las UFP/ml. ¿Por qué las diluciones de
fagos y bacteria se inoculan previamente en agar blando para luego volcarse al agar nutritivo?

5- ¿Qué técnica se aplica para determinar en forma experimental la fracción de bacterias

sobrevivientes a una infección fágica? ¿Cómo la calcularías en forma teórica? ¿Esperas que sean
coincidentes? Justificar

6- Describí brevemente los ciclos líticos y lisogénico de los bacteriófagos.

7- Se dispone de un filtrado de bacteriófagos que son capaces de infectar E. coli y un cultivo sensible
de la cepa. La concentración del lisado es de 1.5 x 10 9 UFP/ml y el cultivo bacteriano posee una
concentración de 108 UFC/ml. Se toman 5 ml de caldo adicionado de Ca ++ al cual se le agregan 300
µl de cultivo bacteriano y 100 µl del lisado de fagos. Se incuba 10 minutos a 32°C con agitación, se

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realizan diluciones con diluyente helado y se plaquean en agar nutritivo. Los resultados se
muestran a continuación:

DILUCION N° DE COLONIAS
10-2 más de 1000
10-3 298/320
10-4 15/12

A partir de los datos experimentales, calcula la concentración de bacterias sobrevivientes a la

infección viral. Compara el valor obtenido con el estimado de forma teórica. Observás diferencia,
a que las podés atribuir?

8- Suponiendo que el título de fagos de un lisado fue de 5x10 9 UFP/ml y quisieras infectar un cultivo
de Salmonella con una multiplicidad de infección de 6, ¿cuál sería la concentración del cultivo
bacteriano a infectar y cuántas bacterias sobrevivientes esperarías obtener luego de la infección?

9- A partir de una muestra de agua de tanque, se realiza un aislamiento de fagos que infectan
Pseudomonas, siguiendo el protocolo citado en Trabajo Práctico. Luego del enriquecimiento, se
realizó un ensayo de spot test (gotas de 10 µl) y se observó lisis hasta la dilución 1x10 -4 donde se
cuentan 30 placas.
a- Calculá el título aproximado del lisado obtenido si se dispensaron gotas de 10 µl.
b- Cómo confirmarías el resultado estimado en a)

Tiempo* (min) Número de calvas en cada dilución (valor promedio de 2 placas/dilución final)
1x10-2 1x10-3 1x10-4 1x10-5 1x10-6 1x10-7 1x10-8
10 Incontable 247 34 9 1 0 0
20 Incontable 263 28 4 0 0 0
30 Incontable Incontable 180 25 1 0 0
40 Incontable Incontable Incontable 311 35 6 0
50 Incontable Incontable Incontable 347 32 4 0
60 Incontable Incontable Incontable 368 40 11 1
10- En un experimento de crecimiento en un escalón, un stock del fago aislado fue ajustado a 1x10 9
UFP/ml y un volumen de 0,01 ml fue inoculado en 10 ml de un cultivo de Pseudomonas en fase
exponencial (1x107 UFC/ml). Cada 10 minutos y durante una hora, un volumen del cultivo fue
procesado para determinar el número de UFP/ml (fago extracelular).
La tabla muestra los resultados obtenidos.
*Minutos luego de la infección de Pseudomonas con el fago (tiempo postinfección).

a) ¿Cuál fue la multiplicidad de infección utilizada en el experimento?

b) ¿Qué proporción de bacterias fue infectada y cuál fue el tamaño de la explosión?

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Efecto inhibitorio del bacteriófago sobre cultivos líquidos con diferentes multiplicidades de
infección (MOI´s). La flecha indica el punto en el que se adicionó el fago al cultivo. El
bacteriófago impide el crecimiento bacteriano, aun bajo condiciones en las que se utiliza un
bacteriófago por cada millón de bacterias.

Curvas de infección Este tipo de curvas se llevan a cabo para observar la relación existente entre
depredadorpresa que siguen los fagos y sus bacterias huéspedes. Cada condición de estudio cuenta con
una réplica biológica por triplicado para que los resultados sean lo más representativos posibles. Se
estudia una situación control, donde no se lleva a cabo la infección fágica, es decir, se corresponde a la
referencia de crecimiento bacteriano en condiciones óptimas; y se estudia la infección de la cepa
bacteriana a diferentes MOI para establecer cuál sería la más óptima para la terapia fágica, es decir,
cual es la que produce la mejor infección y genera la menor resistencia. Antes de iniciar las curvas se
estableció la fase de crecimiento óptima de las bacterias para cada fago, la cual se determinó mediante
la obtención de curvas de infección a una MOI de 0,1 y distintas DOs correspondientes a distintas
fases de crecimiento de los cultivos bacterianos. Esto permitió establecer que las infecciones
posteriores se iniciase a una DO600nm = 0,7 para ambos fagos, que se corresponde con una
concentración bacteriana de 1*108 UFC/mL. Una vez hecho esto, se realizó una dilución 1/100 del
cultivo overnight de la cepa bacteriana de interés en 15 mL de cultivo LB líquido que se incubó hasta
una DO600nm = 0,7. 12 Transcurrido el tiempo necesario para alcanzar esta fase de crecimiento se
procedió a realizar una medición inicial de la DO600nm mediante un espectrofotómetro para
asegurarse de que todos los tubos partían de la misma concentración bacteriana y a continuación se
llevó a cabo la infección a las diferentes multiplicidades de infección que se pretendían estudiar, en
este caso 0,01; 0,1; 1 y 10. Una vez infectados los tubos, estos se mantuvieron en incubación, y se
retiraron cantidades de 1 mL de cada tubo a períodos de 1 h durante un período total de 6 h con una
medición final a las 22 h tras la infección.

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