GUÍA PARA INFORME de TP: BACTERIÓFAGOS

ROMINA TOCONÁS COMISIÓN4

1) a. Defina bacteriófagos.
BACTERIOFAGOS, también llamados fagos son virus que van a infectar
exclusivamente a microrganismos procariotas, se encuentran distribuidos en todas
partes de la biosfera. Las bacterias lisogenicas parece ser el principal reservorio de
los bacteriófagos.
b. Explique los tipos de ciclos que pueden ocurrir en la célula huésped.
Ciclo lítico
La célula infectada por un virus muere por rotura (lisis), al liberarse las nuevas copias
virales. El ciclo lítico es el método de reproducción viral, este es el principal método de
replicación viral e involucra la destrucción de células infectadas el ciclo consta de las
siguientes fases: fase de adsorción o fijación, el virus se une a la célula hospedadora
de forma estable. La unión es específica, ya que el virus reconoce complejos
moleculares de tipo proteico, lipoproteico o glucoproteico, presentes en las
membranas celulares. Fase de penetración o inyección, el ácido nucleico viral entra
en la célula mediante una perforación que el virus realiza en la pared bacteriana. Fase
de eclipse, en esta fase no se observan copias del virus en la célula, pero se está
produciendo la síntesis de ARN, es decir la duplicación y transcripción de ARN,
necesario para generar las copias de proteínas de la cápside. También se produce la
continua formación de ácidos nucleicos virales y enzimas destructoras del ADN
bacteriano. Fase de ensamblaje, en esta fase se produce la unión de los capsómeros
para formar la cápside y el empaquetamiento del ácido nucleico viral dentro de ella.
Fase de lisis o ruptura, conlleva la muerte celular. Los viriones salen de la célula,
mediante la rotura enzimática de la pared bacteriana. Estos nuevos virus se
encuentran en situación de infectar una nueva célula.
Ciclo lisogenico
Se caracteriza por presentar dos fases iguales al del ciclo lítico, la fase de absorción y la
fase de penetración (el virus se pega a la pared de la bacteria o célula a partir de una
serie de mecanismos de anclaje y penetra o introduce su ácido nucleico en el interior
de dicha bacteria o célula). En la fase de eclipse, el ácido nucleico viral (ADN
bicatenario), se recombina con el ADN bacteriano y permanece inactivo. Esta forma
viral se denomina prófago y la célula infectada se denomina célula lisogénica. Esta
célula se puede mantener así indefinidamente e incluso puede llegar a reproducirse.
Un cambio en el medio celular, va a llevar consigo un cambio celular y con él, la
liberación del prófago, convirtiéndose en un virus activo que continuará con el ciclo
infeccioso o ciclo lítico.
a. Explique cómo procede en el laboratorio para realizar la titulación de fagos por el
método de la doble capa. Para ello dispone de un cultivo puro activo de la bacteria
sensible crecido en caldo común (en fase exponencial de crecimiento); 1 tubo con el
filtrado de fagos; solución fisiológica estéril cantidad suficiente (cs), mechero,
alcohol, algodón, espátula, ansa, tubos de hemolisis estériles, tubos con agar blando
(cs), cajas de petri con medio sólido agar nutritivo, pipetas automáticas y puntas
estériles, estufa de cultivo, baño termostatizado.
Titulación de fago (para saber cuál es la carga viral que tenemos) utilizando una cepa
sensible de E. coli: Método de la doble capa.

1°) Realizar diluciones sucesivas 1/ 10 del filtrado de fagos (lisado), en solución

fisiológica estéril (SF).

2°) En tubos con agar blando fundido (dejarlo en un baño a 45°C, para que se
mantenga y no solidifique), agregar 100 µl de cada una de las diluciones, y 100 µl del
cultivo del microrganismo, B. cereus (que este en fase exponencial).

3°) Se realiza el mismo procedimiento (2°) para cada una de las diluciones.

Se homogeneiza, y lo volcamos sobre la placa.

4°) Dejar Secar e incubar a 32°C durante 16 horas en estufa. Por último, se realiza una
lectura de los resultados, mediante el recuento de unidades formadoras de placas de
lisis por ml, (UFP/mL).

c. Luego de incubar las placas, se realiza el recuento de las placas de lisis y se

obtienen los siguientes resultados:
 - Analice la correspondencia numérica de los datos obtenidos, e indique cómo
informaría las UFP/ml. (Considerar volumen de inóculo 0,2 ml).

Dilución Número de calvas Titulo viral (UFC/ml)

1/10 1250 6x10 4
1/100 958 4,79x105
1/1000 489 2,45x106
1/10000 295 1,48x107
1/100000 33 1,65x107

Título viral = número de placas de lisis (UFP/ml)

vol. inóculo x dilución
UFP/ml = 265 x 10000 =1,48x107
0,2 ml
UFP/ml = 198 x 100000 =1,65x107
0,1 ml
Título viral (promedio) = 1,57x 107(UFP/ml)
Hay mucha diferencia entre los primeros y los últimos, por lo que no se los
puede relacionar entre sí. Los últimos valores de la tabla están en el mismo
orden por lo que si los puedo relacionar. Se usan las placas que tienen entre 30
y 300 calvas.

3) a. Explique cómo procede en el laboratorio para determinar la sensibilidad de

una bacteria a un fago lítico. Para ello dispone de un cultivo puro del
microorganismo sensible crecido en caldo común, 2 frascos de 50 ml con caldo
común estéril (20 ml en cada uno), un tubo con la suspensión del fago,
solución fisiológica estéril (cs), tubos de hemólisis estériles, frasco con caldo
común agar (cs), placas de petri estériles, mechero, alcohol, algodón, pipetas
automáticas y puntas estériles, estufa de cultivo, espectrofotómetro de tubos.
Describa el protocolo de trabajo indicando el momento en que se adiciona el
fago, toma de muestra, medidas de crecimiento, métodos utilizados, etc.

Determinar el efecto de un bacteriófago lítico y lisogénico, sobre el de crecimiento de

E. coli: Curva de crecimiento (medidas de DO y UFC/ml)

1°) Partimos de 3 cultivos diferentes de E. coli, inoculados en caldo común

C: control. Cultivo de E. coli sin bacteriófago (con medio de control y E. coli), es

recomendable tener dos controles

2: Cultivo de E. coli con fago lisogénico

3: Cultivo de E. coli, se agrega fago lítico en T2

2°) Incubar a 37°C durante 4 h. En cada intervalo de 30 min, medir DO560nm en un
espectrofotómetro de tubos y tomar 0,1 ml para determinar UFC/ml mediante el
método de las diluciones sucesivas para calcular UFC/ml al:

 T0: inóculo inicial

 T1: 30 min
 T2: 60 min*

*En la fase exponencial de crecimiento (T2):

1) Medir DO

2) Tomar muestra para diluciones sucesivas.

3) al tubo control lo vamos a dejar así nomas, agregar 100 µl de mitomicina C + CaCl2
(10 mM) al tubo 2 para estimular e ingrese a fase lítica, agregar 100 µl del fago lítico al
tubo 3.

 T3: 90 min
 T4: 120 min

3°) Incubar a 37°C en estufa durante 24 h y analizar los resultados.

b. Luego del experimento se obtienen los siguientes resultados:

- Grafique en un sistema de coordenadas los resultados obtenidos. Justifique.

CONTROL
1 12
0.9
0.8 10
0.7 8
DO 560 nm

Log UFC/ml

0.6
0.5 6
0.4
0.3 4
0.2 2
0.1
0 0
1 2 3 4 5
Tiempo

DO560nm UFC/ml
 Se observa
FAGO T4 que en la
0.9 12 gráfica
0.8
10 control el
0.7
0.6 8
DO y el log
DO 560 nm

Log UFC/ml
0.5 UFC/ml
6
0.4 aumentan a
0.3 4
medida que
0.2
2 pasa el
0.1
0 0 tiempo.
1 2 3 4 5
Tiempo

DO560nm UFC/ml

Cuando se le agrega el fago lítico hay una disminución de la viabilidad celular y de la

masa celular total. Mediante el grafico se puede observar que hay una disminución
tanto de DO como del log UFC/ml, debido a que la celula se reprodujo, infecto y
produjo lisis de la celula.