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Purificacin de una protena

Purificacin de una protena

La purificacin de la protena es vital en la caracterizacin de la protena de inters. La purificacin de la protena permite que uno estudie la funcin de la protena, y su actividad enzimtica.

La

informacin estructural de la protena se puede obtener de las protenas purificadas.

NMR, informacin 3-D.

Otras razones para purificar una protena

Purificacin de la protena

Para entender que est pasando en la clula y entre las clulas.

Ventajas de la purificacin
Alta Alto

Reconstruccin de rutas metablicas: enzimas puras para estudiar la cintica, regulacin de la reaccin, etc.

Para estudiar desviaciones del metabolismo normal. Para uso como biocatalizadores (lipasas, proteasas, glucosa isomerasa) y uso en teraputica (insulina, interleukinas) Purificacin de protena recombinante para ensayos de transformacin gentica.

recuperacin de la actividad. grado de pureza del producto final. Reproducibilidad

En el laboratorio A diferentes escalas En otros laboratorios

Uso

econmico de reactivos e instrumentacin simple. Horas de trabajo convenientes.

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Preparando el extracto

Preparando el extracto

Material crudo
Organismos

Desintegracin clulas y extraccin

Suave

Tejido u rgano: ratas, conejos, cerdos, vacas, humanos Invertebrados: cangrejos, langosta Plantas Microorganismos

Lisis celular: eritrocitos Solubilizacin qumica: levadura Homogenizador manual: hgado Homogenizador automtico: tejido muscular, tejido animal y de plantas Prensa francesa: bacteria y clulas de plantas Ultrasonicacin: suspensin de clulas

Moderado

Vigoroso

Almacenamiento
-80oC

Preparando el extracto

Separacin de precipitados y material particulado

Filtracin Centrifugacin

Optimizacin y clarificacin del extracto

Se

establecen condiciones adecuadas dependiendo del tipo de extracto.

Solvente pH

Filtracin

del extracto.

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Mtodos generales de precipitacin

Inmunoprecipitacin:
Proceso

rpido y especfico de separacin proteica mediante precipitacin.

Requiere la utilizacin de anticuerpos contra esa protena, por lo que no suele ser aplicable en la purificacin de protenas nuevas. La unin Ag-Ac causa la precipitacin del complejo, separndolo del extracto crudo.
Abbas, Litchman & Pober, Cellular and Molecular Inmunology, W.B. Saunders, 1999. Figure A-2

Mtodos generales de precipitacin

Purificacin

de protenas asociadas a

membrana
Protenas

adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que desestabilizan las uniones no covalentes. Protenas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de fosfatasas.

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Determinacin de la cantidad de protena

Espectrofotometra

Mtodos para determinar la concentracin de una protena

Biuret Lowry-Folin-Ciocalteau Absorcin

Se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en funcin de la longitud de onda.
La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una muestra versus soluciones estndar, es posible determinar la identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra (solucin desconocida).

UV a 280 nm (aromtico) o 205220 nm (pptido) Enlace de tinte (Coomassie blue) Bradford

Aplicaciones de la espectrofotometra

Ventajas de la tcnica
rpida precisa verstil fcil de usar eficiente en costo

Anlisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un laboratorio de investigacin Estandarizacin de colores de diversos materiales, como plsticos y pinturas Deteccin de niveles de contaminacin en aire y agua. Determinacin de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos.

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Espectrofotometra
El

Espectrofotmetro

espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Posee cuatro componentes bsicos:

una

fuente de radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible y deuterio para ultravioleta) un compartimiento para la muestra un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.

Espectrofotmetro

Mide en % de transmitancia (T) y absorbancia (A).

El

porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de radiacin que pasa a travs de la muestra y alcanza el detector.

La absorbancia se relaciona con la transmitancia:

A =- log 1/T A = 2 log %T

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Determinaciones

Para determinar la concentracin de una solucin desconocida

La relacin entre las cantidades de absorbente en una solucin y el grado en que esta solucin absorbe la luz, se encuentra regida por las leyes de absorcin La ley de Beer establece la relacin entre el grado de absorbancia de una solucin y otras dos variables: la concentracin de absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a travs de la solucin.
La

Por comparacin con una solucin conocida:

Si

tenemos dos soluciones, D (desconocida) y S (Estndar de concentracin conocida), se establece una relacin matemtica entre ellas.

Curva de calibracin:
Es

absorbancia es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz:

A = eLc

la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a concentracin (abscisas). La concentracin se determina por interpolacin de la absorbancia de las soluciones desconocidas en la recta de calibracin.

Desviaciones de la Ley de Beer

Desviaciones de la Ley de Beer

Medir concentraciones muy elevadas del cromgeno: porque al aumentar la concentracin el detector pierde sensibilidad y no detecta las distintas concentraciones. Radiaciones incidentes no monocromticos: un cromgeno slo absorbe una determinada luz a un largo de onda especifico. Solvente significativo comparada con la del soluto: si llega a limite de linearidad con menores concentraciones de la muestra. Luz transmitida por otros mecanismos: luz errtica cuando no pasa por la cubeta pero si por el sensor.

Lados de la cubeta no paralelos: produce la desviacin de la luz Interferentes: los cromgenos que absorben a ese actan como muestra dando error en absorbancia y en distintas concentraciones. Fenmenos de Fluorescencia: la luz que incide y que produce la muestra equivocan al sensor y dan errores en la medicin.

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Determinacin actividad enzimtica

Determinacin actividad enzimtica

Establecer la concentracin adecuada de sustrato.

Aproximadamente

Mtodo de detener la reaccin

La

10 veces el valor de Km

Determinar pH, fortaleza inica y temperatura.

enzima es encubada con el sustrato por un periodo de tiempo fijo y luego se detiene la reaccin. monitorea continuamente e instantneamente el progreso de la reaccin.

Mtodo continuo
Se

Purificacin de protenas especiales

Purificacin de anticuerpos

Protenas recombinantes
Tienen

Se pueden producir por:

Mtodo

valor comercial

Factores de crecimiento, protenas virales para vacunas, enzimas teraputicas y otras protenas para uso clnico y veterinario.

Tcnicas

genticas

Se asla el DNA que contiene el gen el cual puede ser expresado y la protena purificada. Se puede purificar la protena de la fuente natural para determinar la secuencia de amino cidos.

tradicional de inyectar el animal y desangrarlo para recoger el suero que contiene el anticuerpo. Produccin de anticuerpos monoclonales utilizando hibridomas de ratones. Anticuerpos producidos por tcnicas moleculares con expresin en bacterias u otras clulas husped.

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Purificacin de anticuerpos

Mtodos de purificacin dependen de la fuente del material y del propsito de la purificacin (uso).
Precipitacin Precipitacin

con sulfato de amonio isoelctrico Cromatografa de intercambio de iones Cromatografa hidrofbica Adsorbentes de afinidad