TCNICAS CROMATOGRFICAS

PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFA
1.- DEFINICIN
cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Keulemans ha definido la cromatografa como un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran rea superficial, y la otra es un fluido (fase mvil) que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte, de gran rea superficial. La fase mvil es un fluido (puede ser gas, lquido o fluido supercrtico) que se usa como portador de la mezcla. En la cromatografa ocurren dos fenmenos muy importantes y que son prcticamente los rectores del proceso de separacin: la adsorcin y la absorcin. La adsorcin es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un slido, quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. Esta retencin superficial puede ser fsica o qumica. La adsorcin depende de la naturaleza de la substancia adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisin del adsorbente, y de la concentracin. La absorcin es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.

2.- HISTRIA
Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a travs de arcilla, rocas, etc... la cromatografa como tal adquiere importancia cuando en 1850 el qumico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubri que los cationes orgnicos se separaban por migracin cuando se depositaba una disolucin que los contena sobre un material poroso, como papel. En 1906 el botnico ruso Tswett utiliz la cromatografa en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le di el nombre de cromatografa. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el campo de la qumica orgnica e inorgnica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente. A partir de 1940 los mtodos cromatogrficos adquieren extensin mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elucin y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948. Al mismo tiempo la cromatografa se aplicaba en el campo de la bioqumica, y as Martin consigue separar algunos aminocidos acetilados.

CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

Tipos Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina Cromatografa de gases Cromatografa lquida en fase inversa Cromatografa lquida en fase normal Cromatografa lquida de intercambio inico Cromatografa lquida de exclusin Cromatografa lquida de adsorcin Cromatografa de fluidos supercrticos

Fase mvil Lquido Lquido Gas Lquido (polar) Lquido (menos polar) Lquido (polar) Lquido Lquido Lquido

Fase estacionaria Lquido ( molculas de agua contenidas en la celulosa del papel ) Slido Slido o lquido Slido o lquido (menos polar) Slido o lquido (polar) Slido Slido Slido Slido

1.- CROMATOGRAFA EN COLUMNA

Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plstico o vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusinales, disminuyendo por tanto la resolucin.

2.- CROMATOGRAFA PLANA (Papel y capa fina)

Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel de silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 f366 La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil lquida).El eluente ascender o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrar los componentes a lo largo de sta produciendo manchas que representan a los componentes, la separacin se da por migracin diferencial, es decir que la fase mvil arrastra a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separacin. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de mtodos qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para carbonizar compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando radiacin UV o luz visible. El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia. El proceso de la ccromatografa en papel es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatogrfico en el tanque cromatogrfico

4.- CROMATOGRAFA DE GASES

Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama. La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La fase mvil o gas portador transporta los

componentes de la muestra a travs de la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el rea del pico.

5.- CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada protena a los

grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentracin de iones en solucin (concentracin salina) que compiten con la protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentracin.